全 文 ：植物营养与肥料学报 ２０１５，２１（１）：２１１－２１６
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｄｏｉ牶１０１１６７４／ｚｗｙｆ．２０１５０１２３
收稿日期：２０１３－１０－１８ 接受日期：２０１４－１１－０３
基金项目：国家自然科学基金项目（３１３７２１２６）资助。
作者简介：周佳（１９８５—），女，吉林省珲春市人，博士研究生，主要从事植物营养生理与遗传研究。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｊｉａ８５５５＠１６３ｃｏｍ
通信作者 Ｅｍａｉｌ：ｘｒｗａｎｇ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
大豆丛枝菌根共生结构和多聚磷累积双定位方法
周 佳，张 爽，廖 红，王秀荣
（华南农业大学，根系生物学研究中心，资源环境学院，广东广州 ５１０６４２）
摘要：【目的】多聚磷是丛枝菌根内磷的主要贮存形式，定性、定量观察多聚磷对于解析菌根中磷代谢具有重要意
义。随着植物体内越来越多的参与菌根真菌与寄主植物之间营养交换过程的基因被鉴定，迫切需要进一步提高根
内菌根共生结构和多聚磷累积的染色和定位分析技术。【方法】本研究利用丛枝菌根真菌Ｇｌｏｍｕｓｍｏｓｅａｅ侵染的大
豆植株，采集新鲜根样制片，一部分薄根片利用低浓度荧光染料麦胚凝集素，室温染色３０ｍｉｎ，在波长４８８ｎｍ的蓝
光激发下使用荧光显微镜观察拍照；另一部分薄根片利用荧光染料４’，６－二脒基 －２－苯基吲哚二盐酸盐（ＤＡＰＩ）
进行染色，在波长４０５ｎｍ紫外光激发下观察并拍照；进一步取新鲜制备的薄根片，先后用以上两种荧光染料进行
染色，分别在波长４０５ｎｍ和４８８ｎｍ的激发光下观察并拍照，完成了菌根共生结构和多聚磷的共定位。【结果】１）
使用荧光染料麦胚凝集素，大豆丛枝菌根真菌侵染结构的荧光标记活性染色法，可以清晰地检测到大豆丛枝菌根
中所有的共生结构，包括丛枝，泡囊和根内菌丝等。２）在丛枝菌根真菌侵染的根中，各种共生结构都呈现出黄色荧
光，为ＤＡＰＩ与多聚磷结合在紫外光激发下的呈色。根段中部分细胞内的蓝白色斑点为ＤＡＰＩ与细胞核中 ＤＮＡ结
合的显色结果。在含有成熟丛枝结构的细胞中，也可观察到大部分丛枝呈蓝白色，主要是丛枝膜质结构的呈色。
因此，利用荧光染料４’，６－二脒基－２－苯基吲哚二盐酸盐染色法定位多聚磷，能很好地区分多聚磷酸盐、ＤＮＡ和
膜质。３）在以上研究的基础上，通过荧光光路的切换，可以同时观察到菌根共生结构和多聚磷的共定位。处于发
育阶段的整个丛枝中多聚磷累积的亮黄色清晰可见。在成熟的丛枝中，由于膜质结构发达，对累积在丛枝结构中
的多聚磷的染色观察产生了一定影响，导致仅仅局部的多聚磷累积清晰可见。【结论】本研究建立的大豆菌根共生
结构与多聚磷累积的双定位分析系统，能够直观观察植物与丛枝菌根真菌的养分交换，清晰地对丛枝菌根共生结
构中多聚磷的累积进行定位分析，可作为从组织和细胞水平研究菌根共生体的重要技术手段。
关键词：大豆；丛枝菌根真菌；丛枝菌根共生结构；多聚磷；荧光染料
中图分类号：Ｓ１３１＋．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－５０５Ｘ（２０１５）０１－０２１１－０６
Ｄｕａｌｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ
ａｎｄｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｓｏｙｂｅａｎｒｏｏｔｓ
ＺＨＯＵＪｉａ，ＺＨＡＮＧＳｈｕａｎｇ，ＬＩＡＯＨｏｎｇ，ＷＡＮＧＸｉｕｒｏｎｇ
（ＲｏｏｔＢｉｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１０６４２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ】Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓａｒｅｍａｊｏｒｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｆｏｒｍｓｅｘｉｓｔｉｎｇｉｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂｏｄｉｅｓｏｆａｒｂｕｓｃｕｌａｒ
ｍｙｃｏｒｈｉｚａｅ．Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｅｓｏｆｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ
ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｈｉｚａｅ．Ｍａｎｙｇｅｎｅｓｈａｖｅｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｉｎｖｏｌｖｅｉｎｎｕｔｒｉｅｎｔｅｘｃｈａｎｇｅｓｂｅｔｗｅｅｎ
ｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｆｕｎｇｉａｎｄｈｏｓｔｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｉｎ
ａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｈｉｚａｅｉｓｕｒｇｅｎｔｌｙｒｅｑｕｉｒｅｄ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】ＦｒｅｓｈｒｏｏｔｓｆｒｏｍＧｌｏｍｕｓｍｏｓｅａｅｃｏｌｏｎｉｚｅｄｓｏｙｂｅａｎｐｌａｎｔｓ
ｗｅｒｅｓａｍｐｌｅｄａｎｄｍａｄｅｉｎｔｏｔｈｉｎｓｌｉｃｅｓ．Ｓｏｍｅｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｗｈｅａｔｇｅｒｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ
ｆｏｒ３０ｍｉｎａｔｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ａｎｄｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｅｄｕｓｉｎｇａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｔｂｌｕｅｌｉｇｈｔｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｗｉｔｈ
ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｏｆ４８８ｎｍ；ｔｈｅｏｔｈｅｒｓｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅ４，６ｄｉａｍｉｄｉｎｏ２ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ
ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ａｎｄｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｅｄａｔｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｏｆ４０５ｎｍ．Ｔｈｅｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｗｅｒｅ
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２１卷
ｔｈｕｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｂｙｂｏｔｈｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】１）Ｕｓｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｃｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ（ｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｗｈｅａｔ
ｇｅｒｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ），ａｌａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｃｏｕｌｄｂｅｃｌｅａｒｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｒｂｕｓｃｕｌｅｓ，ｖｅｓｉｃｌｅｓ
ａｎｄｉｎｔｅｒｃｅｌｕｌａｒｈｙｐｈａｅ．２）Ｉｎｔｈｅｉｎｆｅｃｔｅｄｒｏｏｔｓ，ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｉｎａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｓｈｏｗｅｄ
ｙｅｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｕｎｄｅｒｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｏｆｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｌｉｇｈｔ．ＤＮＡｉｎｎｕｃｌｅｕｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈ４，６ｄｉａｍｉｄｉｎｏ２
ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｓｈｏｗｅｄｂｌｕｅｗｈｉｔｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｏｔｓ，ａｎｄａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｅｍｂｒａｎｃｅｏｆｍａｔｕｒｅａｒｂｕｓｃｕｌｅｓ
ｉｎｔｈｅｃｅｌｓｅｘｈｉｂｉｔｅｄｂｌｕｅｗｈｉｔｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｓｏ，ｕｓｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅ４，６ｄｉａｍｉｄｉｎｏ２ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ
ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｔｏｐｏｓｉｔｉｏｎｔｈｅｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ，ｔｈｅｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ，ＤＮＡａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｗｅｒｅｏｂｖｉｏｕｓｌｙｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ．３）Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓ，ｄｕａｌｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄ
ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｗａｓｒｅａｌｉｚｅｄｂｙｃｈａｎｇｉｎｇｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｉｍｍａｔｕｒｅａｒｂｕｓｃｕｌｅｓｓｈｏｗｅｄｌｉｇｈｔｙｅｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ａｎｄｔｈｏｓｅｉｎｍａｔｕｒｅａｒｂｕｓｃｕｌｅｓｃｏｕｌｄｏｎｌｙ
ｐａｒｔｌｙｂｅｏｂｓｅｒｖｅｄｓｉｎｃｅｈｉｇｈｌｙｄｅｖｅｌｏｐｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｆｅｃｔｅｄｔｈｅｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄａｐｐｅａｒａｎｃｅｏｆ
ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ】Ｔｈｅｄｕａｌｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅｓｗｈｅａｔｇｅｒｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎａｎｄ４，６
ｄｉａｍｉｄｉｎｏ２ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｉｓａｂｌｅｔｏｌｏｃａｌｉｚｅｔｈｅｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｓｏｙｂｅａｎｒｏｏｔｓ．Ｕｓｉｎｇｔｈｅｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｎｕｔｒｉｅｎｔｅｘｃｈａｎｇｅｓｂｅｔｗｅｅｎａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｆｕｎｇｉａｎｄ
ｐｌａｎｔｒｏｏｔｓｃａｎｂｅｖｉｓｕａｌｙｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｉｓｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｓｙｍｂｉｏｓｉｓａｔ
ｔｉｓｓｕｅａｎｄｃｅｌｕｌａｒｌｅｖｅｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ牶ｓｏｙｂｅａｎ牷ａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｆｕｎｇｉ牷ａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ牷ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ牷
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅｓ
自 然 界 中，丛 枝 菌 根 真 菌 （Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ
ＭｙｃｏｒｈｉｚａｌＦｕｎｇｉ，ＡＭＦ）可以与近８０％的陆生植物
形成互惠共生关系。共生过程中 ＡＭＦ的孢子萌发
产生根外菌丝，随后在植物根内形成根内菌丝、泡
囊、丛枝等一系列共生结构。根外菌丝吸收土壤中
的无机磷，并快速转变成多聚磷（Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ，
ＰｏｌｙＰ），转运至根内共生结构中，在丛枝结构中再
转化成无机磷形态转运给寄主植物利用［１－２］。多聚
磷是丛枝菌根内磷的主要贮存形式，对多聚磷的定
性、定量观察对于解析菌根中磷代谢具有重要意
义。随着植物体内越来越多的负责菌根真菌与寄主
植物之间营养交换的转运子被鉴定［３－６］，迫切需要
进一步提高根内菌根共生结构和多聚磷累积的染色
和定位分析技术。
根内菌根共生结构的染色常用的是非活性染色
法，较难观测到清晰的菌根结构。１９９１年，Ｓｍｉｔｈ和
Ｄｉｃｋｓｏｎ［７］首 次 应 用 麦 胚 荧 光 素 （Ｗｈｅａｔｇｅｒｍ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＷＧＡ）活性染色，观察到清晰的菌根共生
结构，该方法不易操作，需要较好的经验和技术，故发
展受到一定限制。但由于其显著的优点，被染色菌根
共生结构清晰、美观、易于观察，越来越多的实验室
仍然试图建立这种荧光染色方法。多聚磷染色常用
的方法有吕氏亚甲基蓝染色（多聚磷颗粒为粉紫
色），奈瑟氏染色（多聚磷颗粒为紫黑色）和 ＤＡＰＩ
（４′，６Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ２ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）染色
（多聚磷颗粒为黄色）。其中，ＤＡＰＩ染色多聚磷颗
粒为黄色，与ＤＮＡ和膜质结构所呈蓝白色形成鲜明
对比，因为易于区分而成为最常用的多聚磷染色方
法［８－９］。然而，ＤＡＰＩ常用于聚磷菌体内多聚磷的染
色，将其用于菌根真菌侵染结构的染色报道较
少［１０－１１］，利用 ＷＧＡ和 ＤＡＰＩ双染色将菌根共生结
构，以及共生结构中的多聚磷颗粒进行双定位分析
还未见报道。本研究尝试建立大豆丛枝菌根共生结
构的荧光染色定位方法，并对ＡＭＦ侵染结构中磷的
主要存在形态—多聚磷的累积进行 ＤＡＰＩ法定位分
析，进而发展菌根共生结构与多聚磷累积的双定位
分析系统，以期为从组织和细胞水平上研究菌根共
生体提供关键技术手段。
１ 材料与方法
１１ 实验材料
采用砂培方式，植物材料为大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ
（Ｌ．）Ｍｅｒ）基因型 ＨＮ６６，接种１０％的 ＡＭＦＧｌｏｍｕｓ
ｍｏｓｅａｅ菌剂（即孢子、根外菌丝及被侵染根段等的
混合物），在２５℃、１４ｈ光照，２２℃、１０ｈ黑暗的培
养室中培养，每周浇一次低磷（２５μｍｏｌ／Ｌ）改良的
１／２Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液［１２］，ｐＨ６０，期间补水，常规管
理，接种２８ｄ后，采集新鲜根样制片观察。
１２ 根鲜样切片
收取新鲜根样，洗净，切成约１ｃｍ长的根段，用
２１２
１期 周佳，等：大豆丛枝菌根共生结构和多聚磷累积双定位方法
ＰＥＭｂｕｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／ＬＰＩＰＥＳ、５ｍｍｏｌ／ＬＥＧＴＡ和５
ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４，ｐＨ７０）固定１ｈ。将固定好的根段
取出，纸巾吸干表面水分，用低熔点 ａｇａｒ包埋，使用
振动切片机（ＬｅｉｃａＶＴ１２００Ｓ）将根段纵切成５０μｍ
厚的薄根片。
１３ 染色方法
１３１ＷＧＡ４８８染色法 将切好的薄根片放在离心
管中，加入 ＰＢＳｂｕｆｅｒ（ｐＨ７４）（ＫＨ２ＰＯ４，０１４４
ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ，９０ｇ／Ｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ，０７９５ｇ／Ｌ）漂
洗三次，使用ＰＢＳｂｕｆｅｒ稀释的１０μｇ／ｍＬＷＧＡ４８８
（购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＷＧＡ４８８干粉用ＰＢＳｂｕｆｅｒ溶解为
１ｍｇ／ｍＬ的储存液，放置－２０℃长期保存），荧光染
料室温染色３０ｍｉｎ后，再使用 ＰＢＳｂｕｆｅｒ（ｐＨ７４）
漂洗三次，将染色好的薄根片摆放在加有ＰＢＳｂｕｆｅｒ
的载玻片上，压片，在波长４８８ｎｍ的蓝光激发下使
用荧光显微镜观察拍照。
１３２ＤＡＰＩ染色法 将切好的薄根片放在离心管
中，用ＰＢＳｂｕｆｅｒ漂洗三次，使用含有１０％ Ｈ２Ｏ２的
甲醇溶液室温浸泡１０ｍｉｎ，用２０μｇ／ｍＬ的ＤＡＰＩ工
作液（购自 Ｓｉｇｍａ，ＤＡＰＩ干粉用灭菌双蒸水溶解为
１ｍｇ／ｍＬ的储存液，放置 －２０℃长期保存），荧光染
料室温染色３０ｍｉｎ后，再用ＰＢＳｂｕｆｅｒ漂洗三次，将
染色好的薄根片摆放在加有 ＰＢＳｂｕｆｅｒ的载玻片
上，压片，在波长４０５ｎｍ的紫外光激发下使用荧光
显微镜观察并拍照。
１３３ＷＧＡ４８８和ＤＡＰＩ双染色定位法 将切好的
薄根片放在离心管中，用ＰＢＳｂｕｆｅｒ漂洗三次，使用
含有１０％ Ｈ２Ｏ２的甲醇溶液室温浸泡１０ｍｉｎ，首先，
使用２０μｇ／ｍＬ的ＤＡＰＩ室温染色３０ｍｉｎ，再使用１０
μｇ／ｍＬ的ＷＧＡ４８８荧光染料室温染色３０ｍｉｎ后，再
用ＰＢＳｂｕｆｅｒ漂洗三次，将染色好的薄根片摆放在
加有ＰＢＳｂｕｆｅｒ的载玻片上，压片，分别在波长４０５
ｎｍ和４８８ｎｍ的激发光下使用荧光显微镜观察并
拍照。
２ 结果与讨论
２１ ＷＧＡ４８８对菌根共生结构的染色
ＷｈｅａｔＧｅｒｍＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）是一种细胞生物
学研究中广泛使用的荧光标记麦胚凝集素，是从小
麦胚中分离的蛋白，分子量约为４３ＫＤａ，可与 Ｎ乙
酰葡糖胺基和唾液酸残基结合［１３］。ＷＧＡ４８８是一
种真菌细胞壁染料，其可与真菌细胞壁上的几丁质
结合，在波长４８８ｎｍ的蓝光激发下，收集５０５ ５８２
ｎｍ散射绿色荧光［１３］。本研究通过琼脂包埋根鲜样
后，用振动切片机将新鲜根段切成薄根片，再使用
低浓度的 ＷＧＡ４８８荧光染料室温避光染色 ３０
ｍｉｎ，成功地建立了大豆丛枝菌根共生结构的荧光
标记活性染色法。该方法可以清晰地检测到大豆
丛枝菌根中所有的共生结构，包括丛枝、泡囊和根
内菌丝。图１为 ＡＭＦＧｌｏｍｕｓｍｏｓｓｅａｅ侵染大豆２８
ｄ后的根纵切ＷＧＡ４８８染色结果。如图中所示，绿
色荧光部分可以清晰地看到根内菌丝（ＩＨ）、丛枝
结构（Ａ）和泡囊（Ｖ）。
２２ ＤＡＰＩ对菌根内多聚磷的染色
ＤＡＰＩ是一种荧光染料，与菌体中多聚磷结合，
可形成黄色荧光［８－１１］。从图２可见，在ＡＭＦ侵染的
根段中，各种共生结构内都存在黄色荧光，即为
ＤＡＰＩ染色后多聚磷在紫外光激发下的呈色，尤其是
在丛枝结构和泡囊结构中黄色荧光更强（如图２ｃ，ｄ
所示），说明在这两个共生结构中有较多的多聚磷
累积，而根外菌丝，这个主要输送多聚磷的结构中却
只能观察到较弱的黄色荧光（如图２ａ，ｂ所示）。这
可能是由于丛枝结构是植物与菌根真菌之间多聚磷
向无机磷转化的主要场所，而泡囊是菌根真菌用于
储存养分的主要场所。ＤＡＰＩ荧光染料的灵敏度高，
在室温、中性条件下即可以对植物薄根片进行染
色，且对样品无损伤，可保持样品的活性，同时，不影
响其他染料的着色。
ＤＡＰＩ也用于双链 ＤＮＡ的染色，染色后用荧光
显微镜可观察到ＤＡＰＩＤＮＡ复合物呈蓝白色［８，９，１４］。
如图２ｂ所示，根段中部分细胞内的蓝白色斑点即为
ＤＡＰＩ与细胞核中 ＤＮＡ结合的显色结果。而且，在
含有成熟丛枝结构的细胞中也可观察到高度分支的
结构大部分呈蓝白色（图２ａ，ｂ），这主要是由于丛枝
这一高度分化的结构主要是由膜质结构组成，膜质
结构经 ＤＡＰＩ染色后也会发蓝白色荧光［８，９，１１］。而
丛枝菌根共生结构中的多聚磷经 ＤＡＰＩ染色后，呈
亮黄色，很容易加以区分开。因此，虽然本研究中
ＤＡＰＩ对多聚磷的染色不是很特异，但是仍然可以根
据染色后的不同呈色，很容易区分 ＤＮＡ、膜质结构
与多聚磷。此外，在根的维管束中也出现了很亮的
蓝白色荧光，可能为木质部的自发荧光造成（图
２ａ）。
３１２
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２１卷
图１ 大豆菌根共生结构的ＷＧＡ４８８染色
Ｆｉｇ．１ ＶｉｔａｌｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｓｏｙｂｅａｎａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｂｙＷＧＡ４８８
［注（Ｎｏｔｅ）：图中白色箭头所指为菌根共生结构 Ｗｈｉｔｅａｒｏｗｓｓｈｏｗｅｄａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．
Ａ—丛枝 Ａｒｂｕｓｃｕｌｅ；Ｖ—泡囊 Ｖｅｓｉｃｌｅ；ＩＨ—根内菌丝 Ｉｎｔｅｒｃｅｌｕｌａｒｈｙｐｈａ．］
图２ 大豆菌根共生结构中多聚磷的ＤＡＰＩ染色
Ｆｉｇ．２ ＳｔａｉｎｉｎｇｏｆｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｉｎｓｏｙｂｅａｎａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂｏｄｉｅｓｂｙＤＡＰＩ
［注（Ｎｏｔｅ）：图中红色箭头所指为多聚磷的ＤＡＰＩ染色 ＲｅｄａｒｏｗｓｓｈｏｗＤＡＰＩｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ．
Ａ—丛枝Ａｒｂｕｓｃｕｌｅ；Ｖ—泡囊Ｖｅｓｉｃｌｅ；ＩＨ—根内菌丝Ｉｎｔｅｒｃｅｌｕｌａｒｈｙｐｈａ；ＥＨ—根外菌丝ＥｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒＨｙｐｈａ．］
为了进一步确定我们利用 ＤＡＰＩ荧光染色定位
的黄色是聚磷酸盐颗粒而不是其他物质，我们进一
步ＤＡＰＩ染色后，使用激光共聚焦显微镜对 ＡＭＦ侵
染的大豆根系进行了观察，结果如图３所示，右边照
片中绿色十字所指示的蓝色部分为 ＤＡＰＩ自身的荧
光呈色，其发射波长大约在４７０ｎｍ，红色十字所指示
的黄色荧光为ＤＡＰＩ与多聚磷复合物的荧光呈色，其
发射波长大约在５５０ｎｍ，蓝色十字所指示的蓝白色荧
光为ＤＡＰＩ与ＤＮＡ或膜质结构的荧光呈色，其发射波
长大约在５００ｎｍ。ＡｓｃｈａｒＳｏｂｂｉ等［１５］已有的研究发
现，ＤＡＰＩ与多聚磷的结合会改变ＤＡＰＩ的激发光谱。
激发波长在４０５ｎｍ时，ＤＡＰＩ与多聚磷结合后的荧光
强度显著高于ＤＡＰＩ的荧光强度，并且获得最高荧光
强度时的发射波长大约在５５０ｎｍ处。本研究中，我
们发现激发波长在４０５ｎｍ时，丛枝结构中产生的黄
色荧光的发射波长也是大约在５５０ｎｍ处，参照相关
文献报道［１０，１１，１５］，可以间接证明黄色荧光是ＤＡＰＩ与
多聚磷复合物所发出的荧光。
４１２
１期 周佳，等：大豆丛枝菌根共生结构和多聚磷累积双定位方法
图３ 大豆根中ＤＡＰＩ的荧光染色
Ｆｉｇ．３ ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｓｏｙｂｅａｎｒｏｏｔｓｂｙＤＡＰＩ
［注（Ｎｏｔｅ）：左图中绿色曲线和右图中绿色十字所指示的蓝色部分分别表示ＤＡＰＩ自身的荧光强度和呈色，红色曲线和红色十字所指示的
黄色部分分别表示ＤＡＰＩ与多聚磷复合物的荧光强度和呈色，蓝色曲线和蓝色十字所指示的蓝白色部分分别表示ＤＡＰＩ与ＤＮＡ或膜质结
构的荧光强度和呈色 ＧｒｅｅｎｃｕｒｖｅｉｎｔｈｅｌｅｆｔｆｉｇｕｒｅａｎｄｇｒｅｅｎｃｒｏｓｓｉｎｔｈｅｒｉｇｈｔｉｍａｇｅｓｈｏｗｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙａｎｄｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＤＡＰＩ
ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｒｅｄｃｕｒｖｅａｎｄｒｅｄｃｒｏｓｓｓｈｏｗｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙａｎｄｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＤＡＰＩａｎｄＰｏｌｙＰｃｏｍｐｌｅｘ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｂｌｕｅｃｕｒｖｅ
ａｎｄｂｌｕｅｃｒｏｓｓｓｈｏｗｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙａｎｄｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＤＡＰＩａｎｄＤＮＡｏｒｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｃｏｍｐｌｅｘ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．］
２３ 菌根共生结构和多聚磷的双定位
通过将新鲜根样经固定—琼脂包埋—振荡切
片—双氧水 －甲醇处理—ＤＡＰＩＷＧＡ４８８荧光染料
染色—显微镜观察等步骤，本研究成功地建立了大
豆菌根共生结构和多聚磷累积的双染色共定位分析
系统。该方法在用显微镜观察时，只需切换荧光光
路即可同时完成菌根共生结构和多聚磷的共定位。
图４ａ为未经染色明场的纵切根段，丛枝以及根内菌
图４ ＷＧＡ４８８和ＤＡＰＩ双染色的菌根共生结构
Ｆｉｇ．４ ＤｕａｌｓｔａｉｎｉｎｇｏｆａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｗｉｔｈＷＧＡ４８８ａｎｄＤＡＰＩ
［注（Ｎｏｔｅ）：ａ—明场ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ；ｂ，ｄ，ｆ—ＷＧＡ４８８染色ＷＧＡ４８８ｓｔａｉｎｉｎｇ；ｃ，ｅ，ｊ—ＤＡＰＩ染色 ＤＡＰＩｓｔａｉｎｉｎｇ；图中白色箭头所指为菌根共生
结构Ｗｈｉｔｅａｒｏｗｓｓｈｏｗａｒｂｕｓｃｕｌａｒｍｙｃｏｒｈｉｚａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ；红色箭头所指为多聚磷的ＤＡＰＩ染色ＲｅｄａｒｏｗｓｓｈｏｗＤＡＰＩｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ；ａ－ｃ—Ｂａｒ＝１０μｍ；ｄ，ｅ—Ｂａｒ＝２５μｍ；ｆ，ｊ—Ｂａｒ＝５μｍ．］
５１２
植 物 营 养 与 肥 料 学 报 ２１卷
丝结构清晰可见。图４ｂｊ为同时使用 ＷＧＡ４８８和
ＤＡＰＩ对菌根共生结构和多聚磷进行染色，分别在蓝
光和紫外光下的观察结果。纵切的根片段中可以观
察到丛枝、根内菌丝等结构。ＷＧＡ４８８染色的丛枝
结构中绿色荧光颜色比较均匀，且荧光最强，根内菌
丝的荧光较弱（图４ｂ，ｄ，ｆ）。ＤＡＰＩ染色结果可以看
到，在含有丛枝的细胞中有蓝白色荧光，为 ＤＡＰＩ与
丛枝膜质结构的显色结果。同时，可以看到，在一些
含有丛枝的细胞中，明显有黄色荧光的分布，即为多
聚磷累积的 ＤＡＰＩ染色结果（图４ｃ，ｅ，ｊ）。并且，在
成熟丛枝中，由于膜质结构发达，对累积在丛枝结构
中的多聚磷的染色观察产生了一定影响，导致仅仅
局部的多聚磷累积清晰可见（图４ｅ）。而处于发育
阶段的整个丛枝中多聚磷累积的亮黄色更清晰，更
易观察（图４ｃ，ｊ）。此外，与图２类似，维管束中也
出现了很亮的荧光，可能为木质部的自发荧光（图
４ｊ）。本实验中，双染色实现了非常一致的菌根共生
结构和多聚磷累积的双定位，但由于本研究观察拍
照主要使用普通荧光显微镜，所以观测到的丛枝等
结构立体感不足，还有待进一步的改进。
３ 结论
ＷＧＡ４８８对菌根共生结构的染色结合 ＤＡＰＩ对
菌根内多聚磷的染色，实现大豆菌根共生结构与多
聚磷累积的双定位，能够直观观察植物与丛枝菌根
真菌（ＡｒｂｕｓｃｕｌａｒＭｙｃｏｒｈｉｚａｌＦｕｎｇｉ，ＡＭＦ）的养分交
换，可用于从组织和细胞水平研究菌根共生体。
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－８６６
６１２