全 文 ：书西北植物学报!
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基金项目$国家自然科学基金"
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#&福建省重大科技平台建设"
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#
作者简介$李
!
然"
#01)
#!女!硕士!主要从事植物分子生物学研究
"
通信作者$赖钟雄!博士!研究员!主要从事园艺植物生物技术与遗传资源研究
3(45-6
$
65-78"#
!
#+%*9:4
龙眼松散型胚性愈伤组织发生过程中
相关蛋白的表达分析
李
!
然!赖钟雄"!赖呈纯!方智振!林玉玲!刘生财!陈裕坤!张梓浩
"福建农林大学 园艺植物生物工程研究所!福州
%$"""!
#
摘
!
要$以龙眼(红核子)品种"
!"#$%&
(
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&,;:<=*9>*?:/
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AB7-
#松散型胚性愈伤组织"
C3D
#为材料!采用固
相双向凝胶电泳技术和质谱鉴定技术!对其生长过程中相关蛋白的表达变化进行研究结果表明$"
#
#龙眼
C3D
生长过程中!总蛋白点数在
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"
1""
之间!蛋白点数变化虽有升降起伏!但总体呈上升趋势&蛋白质
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F
集中在
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之间&蛋白质分子量在
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之间!表达量相对较高的是分子量在
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#龙眼
C3D
生长过程中质谱鉴定
++
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为功能未知蛋
白!
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涉及胁迫应答和抗氧化!
#"*+#I
涉及能量和糖代谢!
#"*+#I
涉及蛋白代谢和修复!
+*"+I
涉及细胞骨
架重构!
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蛋白是调控蛋白!
%*"%I
是核酸代谢相关蛋白!而所占比例最少的为信号转导与细胞凋亡相关蛋
白*氨基酸代谢相关蛋白*脂类代谢相关蛋白!以及维生素代谢相关蛋白均为
#*$!I
"
%
#龙眼
C3D
生长过程中!
胁迫反应%氧化还原相关蛋白"抗坏血酸类过氧化物酶
J#)&
*
J#$1
和
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!苄基醚还原酶同系物
K?+
*谷胱甘肽
过氧化酶以及过氧化物酶
;!+
#表达高峰出现在前期
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!而过氧化物酶
)
多在后期
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表达&蛋白质合
成及修复的相关蛋白!只有蛋白质异形体
#
在
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"
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表达量高!其他蛋白的表达高峰出现在前期
#"
"
!"L
之
间!能量与糖代谢相关酶在整个过程中都有较大量的表达
关键词$龙眼&松散型胚性愈伤组织&蛋白质组&质谱
中图分类号$
M&10
文献标志码$
N
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E
B9T=:4BT=
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龙眼""
!"#$%&
(
)*+$,
-
&,;:<=*
#胚胎发育状
况关系到成熟果实的食用和加工甚至坐果率!尤其
是早期败育的品种普遍存在严重的生理落果问题!
直接影响到产量植物体细胞胚在发生发育中与合
子胚胎发育过程相似+#,!因此!阐明龙眼体胚发生发
育过程从基因到性状表达的规律有着十分重要的意
义!可为新品种选育*果核大小调控*果实品质改善
以及提高坐果率*增加产量提供理论依据+!,已建
立并长期保持的龙眼松散型胚性愈伤组织"
U=-5X6B
B4X=
W
:
@
B/-9956<.
!
C3D
#!具有很强的体细胞胚发
生和植株再生能力!这在木本植物中是很少见的!是
木本植物离体胚胎发生的模式植物之一+%($,龙眼
C3D
及其悬浮细胞系!是分离原生质体的优良材
料!是用于基因工程育种的良好转化体系!是细胞突
变体筛选的高效试验系统!在快速繁殖苗木*制作人
工种子等方面龙眼的胚性细胞系也是一种优良体
系+%,前人研究表明!龙眼体细胞胚发生各时期的
主要蛋白质组分相似!体现了体胚蛋白质组分的稳
定性!也说明这些蛋白质是维持体胚细胞基础代谢
必需基因表达的产物+,因此找出胚性愈伤组织和
胚状体特异蛋白之间的联系及功能!对于深入了解
体胚发生机理有重要意义通过对龙眼体细胞胚发
生早期+&,*中期+1,和后期+0,蛋白质组学以及相关分
子生物学方面+#",的研究!发现龙眼体胚发生的整个
过程是受内外环境综合影响!包括激素种类和浓度
的调节*大分子物质代谢与积累*氧化胁迫等!导致
不同阶段蛋白质"包括酶#组分及含量的不同!与衰
老有关的酶系统!超氧化物歧化酶"
S[H
#*过氧化氢
酶"
DNK
#*谷胱甘肽过氧化物酶"
PS?(]^
#是生物
体内氧自由基清除系统的三大重要酶系!随机体衰
老会大量积累龙眼
C3D
高频率体细胞胚发生和
再生能力的保持!与其长期继代保持过程中细胞活
力的维持息息相关因此利用蛋白质组学方法研究
龙眼
C3D
衰老过程中蛋白质的功能!从蛋白质水平
上探讨龙眼
C3D
生长和衰老机制!为龙眼
C3D
正
常培养*长期继代以及胚性保持提供依据
#
!
材料和方法
>*>
!
供试材料
龙眼
;D!
细胞系的松散型胚性愈伤组织+%,!于
附加
#*"4
@
%
;!
!
)(H
的
ZS
固体培养基上继代培
养!温度"
!$_!
#
`
!黑暗培养分别取培养
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*
!"
*
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*
)"
和
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的
C3D
后作为试验材料第一向电
泳采用
3TT5/F]P
E
A:=
#
等电聚焦系统&第二向电
泳采用
3TT5/HN;K.-8
垂直电泳系统蛋白质组
试验所用试剂均为
P3?B56TA95=B
生产!其他化学
试剂为国产分析纯
>*?
!
方
!
法
>*?*>
!
蛋白质样品的提取与定量
!
龙眼
C3D
不同
培养阶段丙酮干粉制备和蛋白样品的提取参照赖呈
纯等+##,的方法提取的蛋白质样品参照
V=5L(
U:=L
+
#!
,稍作改良的方法进行定量
>*?*?
!
蛋白质样品双向电泳
!
第一向等电聚焦
"
F3C
#电泳和
F]P
胶条平衡!采用线性
F]P
胶条长
度
#194
!
E
?
为
)
"
&
!使用
3TT5/F]P
E
A:=
#
"
P3
?B56TA95=B
#!采用主动加样水化固相
E
?
梯度凝
胶第二向
SHS(]NP3
采用
P3?B56TA95=B
公司生
产的
3TT5/HN;K.-8
垂直电泳系统进行!具体参数
1"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
和操作方法见赖呈纯等+&,和方智振等+1,的方法
>*?*@
!
龙眼胚性愈伤组织生长过程中相关蛋白的
质谱鉴定
!
将选好的目的蛋白点!用解剖刀沿蛋白
点染色边缘切下!装入
#*$4;3]
管中!做好标记!
交由上海复旦大学生物质谱实验室!用
ZN;HF(
K[C
质谱仪制备肽质量指纹谱!鉴定蛋白具体操作
参照赖呈纯等+&,的方法
!
!
结果与分析
?*>
!
质谱鉴定的龙眼相关蛋白点在双向电泳凝胶
上的分布及相关信息
龙眼
C3D
凝胶
!(H
图谱分析后!选取蛋白表达
量相对值超过
"*%
的
&)
个差异表达蛋白进行质谱
鉴定!由于其中
#1
个点在本实验室其他研究+&(0,中
已经完成鉴定!本实验不再重复对剩下
$+
个差异
表达的蛋白点进行质谱鉴定!鉴定成功的有
)1
个
"图
#
中绿色显示!且在图
#
和表
#
中用编号
J
表
示#!其蛋白匹配分数大于
&!
!得到的数据库搜索结
果较为可靠
?*?
!
质谱鉴定相关蛋白的功能分析
对龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中差异显
著的
$+
个蛋白进行
ZN;HF(K[C
质谱分析!成功
鉴定
)1
个点"匹配分数
#
&!
#!成功率达到
1$*&#I

可见利用
ZN;HF(ZS
方法鉴定蛋白质!尤其对于
混合蛋白质多肽类物质相对分子质量的精确测定有
很大优势+#%,加上何园+0,和赖呈纯等+&,已鉴定的
#1
个蛋白"表
!
中编号分别为
?D
和
;
的蛋白点#!
龙眼
C3D
生长过程中已经成功鉴定的点总共有
++
个!可以分为
##
个功能类群"表
!
#!分别是胁迫应
答和抗氧化相关蛋白*蛋白代谢和修复相关蛋白*能
量和糖代谢相关蛋白*信号转导和细胞凋亡相关蛋
白*核酸代谢相关蛋白*细胞骨架的重构相关蛋白*
维生素代谢相关蛋白*脂类代谢相关蛋白*氨基酸代
谢相关蛋白*调控蛋白以及功能未知蛋白其中!在
已知功能的蛋白中!比例最高的是胁迫应答和抗氧
化相关蛋白!占
%"*%"I
!并且过氧化物酶数量最
多!有
#!
个&其次是蛋白代谢和修复相关蛋白以及
能量和糖代谢相关蛋白!都有
&
个!分别都占
#"*+#I
&细胞骨架的重构相关蛋白!所占比例是
+*"+I
&调控蛋白共有
%
个!比例占到
)*$$I
&核酸
代谢相关蛋白有
!
个!占
%*"%I
&占比例较少的为
维生素代谢*氨基酸代谢*脂类代谢相关蛋白信号转
导相关蛋白!分别只有
#
个!各占
#*$!I
其余还
有
#0
个功能未知蛋白在数据库中检索不到得分大
于
&!
的结果!可能是目前像龙眼这样的木本植物在
分子方面的研究还很有限在龙眼松散型胚性愈伤
组织生长过程中参与氧自由基清除功能的酶占了功
能已知蛋白的一半以上!可以推测在生长过程中不
同阶段!会有不同的酶出现维持细胞内部的氧化胁
迫压力平衡!从而保证正常生长增值
?*@
!
龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中质谱鉴
定蛋白表达变化
?*@*>
!
胁迫应答和抗氧化相关蛋白
!
龙眼
C3D
生
长过程中鉴定出的胁迫应答和抗氧化类相关蛋白共
有
!"
个!以过氧化物酶为主!其中苄基醚还原同系
物
K?+
*谷胱甘肽过氧化酶*过氧化氧化还原蛋白
各
#
个!抗坏血酸类过氧化物酶共
$
个!其余
#!
个
全部为过氧化物酶!其中两个过氧化酶"
?D#0
和
图
#
!
龙眼
C3D
质谱鉴定的相关蛋白点在双向电泳凝胶上分布
C-
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期
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李
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然!等$龙眼松散型胚性愈伤组织发生过程中相关蛋白的表达分析
书书书
表
!
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龙
眼
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生
长
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#通过数据库检测是同一个蛋白"登录号均为
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#!其他均为过氧化酶
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物酶表达量增加的阶段也不同!表达量相对值超过
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;!+
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时主要是苄基醚还原酶同系物
K?+
和叶绿体抗坏血酸类过氧化物酶
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!
"L
时苄基醚还原酶同系物
K?+
的表达量虽然有所下
降但仍然高于
"*%
!其余
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种表达量由高到低依次
是抗坏血酸类过氧化物酶
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*抗坏血酸类过氧化
物酶
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*谷胱甘肽过氧化酶*过氧化酶
;!+
到
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种酶的表达量都有所下降!而过
氧化还原蛋白的表达量超过他们!过氧化物酶
)
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都有少量表达在后期"
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"
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#大量表达的是全部的过氧化酶"过氧化酶
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#以及
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种抗坏血酸类过氧化物酶
"
J%+#
和细胞质抗坏血酸类过氧化物酶
#
#!表达量
最高的是过氧化物酶
)J!)1
!谷胱甘肽过氧化酶和
过氧化还原蛋白还有少量表达"表达量相对值小于
"*!
#!到
$"L
时!部分过氧化物酶表达量下降或消
失!但抗坏血酸类过氧化物酶
J%+#
表达量还很高
"表
%
#可见!在龙眼松散型胚性愈伤组织生长过
程的不同阶段!会有不同的抗氧化相关蛋白起主要
作用!行使平衡氧胁迫环境及清除氧自由基的功能
?*@*?
!
蛋白代谢和修复相关蛋白
!
龙眼
C3D
生长
过程中共鉴定到蛋白代谢和修复相关酶
&
个在生
长前期!细胞分裂迅速!愈伤组织体积和重量生长也
非常迅速!即前期"
#"
"
!"L
#是龙眼
C3D
快速增殖
期!因此!此时也很可能是蛋白质大量合成并行使功
能的主要时期此时与蛋白质合成及修复相关的蛋
白就会大量表达!主要有
)
种!分别是二硫化物异构
酶*延伸因子类似蛋白*
PK]
结合蛋白和蛋白质异
形体
#
!且表达量最高的是二硫化物异构酶!最低的
是
PK]
结合蛋白在培养
!"L
时!蛋白酶体
$
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*
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和
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亚基也有表达!且蛋白表达相对值超过
"*%
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时!只有蛋白质异形体
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升高!其余都降低或者消失而到生长后期"
)"
"
$"
L
#各种蛋白合成及修复的相关酶已经不表达或者很
少!只有蛋白酶体
%
亚基和
+".
酸性核糖体蛋白还
有少量表达!表达量百分含量低于
"*%
"图
!
#表明
在龙眼
C3D
生长后期细胞渐渐衰老!生命力减弱
?*@*@
!
能量和糖代谢相关蛋白
!
在龙眼松散型胚
性愈伤组织生长的整个过程中!为各种生命活动提
供能量是必不可少的!因此能量代谢一直贯穿于生
长到衰老的整个过程中不同的与能量和糖代谢相
关的酶参与了不同的生理活动已经鉴定出的
&
种
能量与糖代谢相关蛋白在龙眼
C3D
整个生长过程
中表达量都很高!在培养
#"L
时
J大亚基结
合蛋白
$
亚基和
!
个烯醇化酶的表达量很高!到培
养
!"L
时磷酸甘油酸酯激酶和烯醇化酶
?D1
的表
达量依然很高!最高达到
#*"
以上!到
%"L
时
2NH(
苹果酸脱氢酶也表现出了相对高的表达量!到后期
线粒体
C#(NK]
酶
$
亚基*烯醇化酶和磷酸丙糖异
构酶
&
表达量还是比较高!直到
$"L
时磷酸丙糖异
构酶
&
还有大量表达"图
%
#
?*@*A
!
核酸代谢相关蛋白
!
龙眼松散型胚性愈伤
组织生长过程相关蛋白的质谱鉴定结果中!有两个
核酸代谢相关蛋白!这两种蛋白的表达量趋势基本
相似!大量表达都集中在培养
%"L
时!且二磷酸核
!##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
@
!
龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中胁迫应答和抗氧化类群蛋白表达变化模式
K5X6B%
!
]5TTB=/.:U.T=B..=B.
E
:/.B5/L5/T-:8-L5/T
E
=:TB-/.B8
E
=B..-:/L<=-/
@
C3DLB>B6:
E
4B/T-/6:/
@
5/
点编号
S
E
:T9:LB
蛋白名称
]=:TB-//54B
培养时间
D<6T<=56T-4B
%
L
#" !" %" )" $"
J)#
苄基醚还原酶同系物
K?+]AB/
W
69:<45=5/XB/7
W
6-9BTAB==BL<9T5.B
A:4:6:
@
K?+
"*1# "*%& " " "
J#)&
抗坏血酸类过氧化物酶
N.9:=X5TB
E
B=:8-L5.B " #*)" "*!% " "
J#$1
抗坏血酸类过氧化物酶
N.9:=X5TB
E
B=:8-L5.B " #*## "*!0 " "
J#+"
谷胱甘肽过氧化酶
P6E
B=:8-L5.B " "*%$ "*#" "*"$ "
J!)1
过氧化物酶
)]B=:8-L5.B) " " "*#" #*"0 "
J!+#
过氧化物酶
)]B=:8-L5.B) " " "*#0 "*+& "
J!+)
过氧化物酶
)]B=:8-L5.B) " " "*!1 "*1% "
J!+$
过氧化氧化还原蛋白
]B=:8-=BL:8-/.
!
E
=8(#
!
E
=8(!
!
E
=8(%
!
E
B " " "*)+ "*#& "
J!10
过氧化物酶
)]B=:8-L5.B) " " " "*0+ "*)$
J!0#
过氧化物酶
)]B=:8-L5.B) " " " "*%& "
J%""
过氧化物酶
)]B=:8-L5.B) " " " "*$% "*#"
J%"$
过氧化物酶
)]B=:8-L5.B) " " " "*%1 "*"$
J%"&
过氧化物酶
)]B=:8-L5.B) " " " "*%# "
J%%+
过氧化物酶
)]B=:8-L5.B) " " " "*%" "
J%+#
抗坏血酸类过氧化物酶
N.9:=X5TB
E
B=:8-L5.B " " " "*%! "*10
J%10
细胞质抗坏血酸类过氧化物酶
#D
W
T:.:6-95.9:=X5TB
E
B=:8-LBB.B(# " " " " "*%#
J%$)
过氧化物酶
)]B=:8-L5.B) " " " "*1# "*!)
?D!#
类囊体"叶绿体#结合抗坏血酸过氧化物酶
KA
W
65G:-L(X:E
B=:8-L5.B
"
V=5..-95:6B=59B5
#
"*%" " " " "
?D#0
赤豆过氧化物酶
]B=:8-L5.B
"
."
-
,&&,
-
)+&"*
#
" " " "*%1 "
;!+
赤豆过氧化物酶
]B=:8-L5.B
"
."
-
,&&,
-
)+&"*
#
"*!0 "*## " " "
图
!
!
龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中
蛋白质合成和修复类群蛋白表达变化
C-
@
*!
!
]5TTB=/.:U
E
=:TB-/.
W
/TAB.-.(=B65TBL
E
=:TB-/
B8
E
=B..-:/L<=-/
@
C3DLB>B6:
E
4B/T-/6:/
@
5/
苷激酶的表达量最高!超过
#*)
!其次是转录辅助蛋
白!在
!"
和
)"L
时二磷酸核苷激酶也有表达可
能在此阶段有相关核酸蛋白的合成!而使核酸代谢
相关蛋白大量表达"图
)
#
?*@*B
!
细胞骨架的重构相关蛋白
!
肌动蛋白和肌
球蛋白以及微管蛋白都是细胞骨架的主要成分!为
细胞质流动*细胞器运动*物质运输*有丝分裂*胞质
图
%
!
龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中
能量和糖代谢类群蛋白表达变化
C-
@
*%
!
]5TTB=/.:UB/B=
@W
5/L95=X:A
W
L=5TB
4BT5X:6-.4(=B65TBL
E
=:TB-/B8
E
=B..-:/
L<=-/
@
C3DLB>B6:
E
4B/T-/6:/
@
5/
分裂和细胞的顶端生长等提供所需的力在龙眼
C3D
生长过程中!质谱鉴定成功的蛋白包含肌动蛋
白*
&
类重链肌球蛋白*类肌球蛋白以及
%
(
微管蛋
白各
#
个!并且都是在培养
%"L
时有大量表达!且
&
类重链肌球蛋白的表达更多可能与此时期细胞
生理活动发生变化有关"图
$
#
%##
#
期
!!!!!!!!!!
李
!
然!等$龙眼松散型胚性愈伤组织发生过程中相关蛋白的表达分析
图
)
!
龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中
核酸代谢相关蛋白表达变化
C-
@
*)
!
]5TTB=/.:U/<96B-959-L4BT5X:6-.4(=B65TBL
E
=:TB-/B8
E
=B..-:/L<=-/
@
C3DLB>B6:
E
4B/T-/6:/
@
5/
图
$
!
龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中
细胞骨架重构类群蛋白表达变化
C-
@
*$
!
]5TTB=/.:U9
W
T:.GB6BT:/=B4:LB6-/
@
(=B65TBL
E
=:TB-/B8
E
=B..-:/L<=-/
@
C3DLB>B6:
E
4B/T-/6:/
@
5/
?*@*C
!
调控蛋白
!
龙眼
C3D
生长过程中共有
%
个
调控蛋白!在赖呈纯等+&,的研究中已鉴定出来!分别
是
%
多肽类似蛋白
%
*逆转录转座子蛋白*肌动蛋白
结合蛋白!龙眼
C3D
生长过程中主要集中在
!"
"
%"L
表达"图
+
#!表达量由高到低依次是逆转录转
座子蛋白*
%
多肽类似蛋白
%
*肌动蛋白结合蛋白!且
肌动蛋白结合蛋白开始表达的时间要比肌动蛋白表
达的时间提前"图
$
和图
+
#!可能肌动蛋白结合蛋
白的主要作用是调控后续肌动蛋白等相关表达
?*@*D
!
信号转导与氨基酸*维生素*脂类代谢相关
蛋白
!
龙眼
C3D
生长过程中质谱鉴定到信号转导
与细胞凋亡相关蛋白*氨基酸代谢相关蛋白*维生素
代谢相关蛋白和脂类代谢相关蛋白各有一个!分别
为
S(
腺苷甲硫氨酸合成酶*雷帕霉素靶蛋白激酶*
胞质型的半胱氨酸合成酶
&
和烟草烯脂酰
(ND]
还
原酶!并且除
S(
腺苷甲硫氨酸合成酶在
%"L
时有大
量表达!其他主要都是在
)"L
时可以检测到表达!
雷帕霉素靶蛋白激酶在
$"L
时有少量表达"图
&
#
图
+
!
龙眼松散型胚性愈伤组织生长
过程中调控蛋白表达变化
C-
@
*+
!
]5TTB=/.:U=B
@
<65T:=
WE
=:TB-/B8
E
=B..-:/
L<=-/
@
C3DLB>B6:
E
4B/T-/6:/
@
5/
图
&
!
龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中信号
转导与氨基酸*维生素*脂类代谢相关蛋白表达变化
C-
@
*&
!
]5TTB=/.:U.-
@
/56T=5/.L<9T-:/
!
54-/:59-L
4BT5X:6-.4
!
>-T54-/4BT5X:6-.4
!
6-
E
-L4BT5X:6-.4(=B65TBL
E
=:TB-/B8
E
=B..-:/L<=-/
@
C3DLB>B6:
E
4B/T-/6:/
@
5/
S(
腺苷甲硫氨酸"
S(5LB/:.
W
6(;(4BTA-:/-/B
!
SNZ
#
是人体和其他生物体内的主要甲基供体"它为体内
蛋白质*脂肪*核糖核酸和维生素
V#!
提供甲基#!
也是多胺代谢中的重要合成前体!其他代谢相关蛋
白在后期表达可能是进入衰老阶段时!主要靠这些
酶来维持基础代谢
%
!
讨
!
论
@*>
!
能量和糖代谢是龙眼松散型胚性愈伤组织生
长的基础
在龙眼
C3D
生长的整个过程中"培养
"
"
$"
L
#!质谱鉴定成功的能量代谢相关蛋白共有
&
个!包
括
!
个烯醇化酶!
2NH(
苹果酸脱氢酶*磷酸丙糖异
构酶
&
*磷酸甘油酸酯激酶*
J大亚基结合
蛋白
$
亚基*线粒体
C#(NK]
酶
$
亚基各
#
个
2NH(
苹果酸脱氢酶是三羧酸循环过程中的关键
酶*三羧酸循环是依赖氧气的供能方式烯醇化酶*
)##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
磷酸丙糖异构酶
&
*磷酸甘油酸酯激酶都参与糖酵
解!是糖酵解过程重要的几个酶糖酵解是在氧气
不足条件下!将葡萄糖或糖原分解为乳酸!并释放少
量
NK]
的过程
J有双重调节功能!在
D[
!
浓度高时起羧化作用!而在
[
!
浓度高时起加
氧作用
NK]
酶催化
NK]
转化成
NH]
释放能量
是细胞生命活动最直接的能量来源
龙眼
C3D
生长过程早期"
#"
"
!"L
#表达的酶
有烯醇化酶*
2NH(
苹果酸脱氢酶*磷酸丙糖异构酶
&
*磷酸甘油酸酯激酶及
J大亚基结合蛋白
$
亚基
J大亚基结合蛋白
$
亚基在
#"
"
%"
L
的表达量逐渐下降!可能是在早期细胞增值快!细
胞活性高!呼吸作用强烈!在狭小的空间里氧气会供
应不足!
J可以适当平衡
D[
!
%
[
!
浓度!保
证呼吸作用正常进行!并且由于氧气缺乏!细胞主要
以糖酵解
(
三羧酸循环方式供能!以促进快速生长
烯醇化酶催化从
!(
磷酸甘油酸形成高能化合物磷
酸烯醇式丙酮酸的酶!两种烯醇化酶
?D1
和
;&"
分别在生长早期开始大量表达且分别在
%"L
和
)"
L
时表达量最高!可能主要与其参与糖酵解过程有
关胞质型磷酸甘油酸酯激酶"
9
W
T:.:6-9
E
A:.
E
A:(
@
6
W
9B=5TBG-/5.B
!
]Pb
#几乎存在于所有的生物中!
并且高度保守+#),其表达量在生长
!"L
时最高!在
%"L
之后逐渐下降!与其功能相关!它也是参与糖
酵解的重要酶!可以催化
NK]
和
NH]
之间的转
化!实现能量之间的传递
磷酸丙糖异构酶
&
主要在后期"
)"
"
$"L
#表
达!并且呈上升趋势!说明到后期可能由于氧气的缺
乏主要以糖酵解过程为主提供胚性愈伤组织生长发
育所需要的能量消耗
NK]
酶又称为三磷酸腺苷
酶!是一类能催化三磷酸腺苷"
NK]
#水解为二磷酸
腺苷"
NH]
#和磷酸根离子的酶!并且释放能量在
龙眼愈伤组织生长
%"L
时检测到表达!且到
)"L
时!检测到线粒体
C#(NK]
酶
$
亚基的大量表达
在龙眼体细胞胚发生过程中!也检测到该酶转录水
平的规律变化+#$,线粒体内膜的内表面有直径为
0"
埃的球状颗粒一般被称为偶联因子
#
"
C#
#!
C#
有
NK]
酶活力!缺失
C#
的线粒体内膜制剂会失去氧
化磷酸化能力!加入
C#
则可恢复此能力可见线
粒体
C#(NK]
酶
$
亚基对构成完整的
NK]
酶并保
证其活力有重要意义
@*?
!
蛋白质合成与修复是保证龙眼松散型胚性愈
伤组织正常生长的物质基础
蛋白质是一切生命的物质基础!是机体细胞的
重要组成部分不同的结构和性状可以构成功能不
同的蛋白质蛋白质可以参与基因表达的调节!以
及细胞中氧化还原*电子传递*神经传递乃至学习和
记忆等多种生命活动的过程尤其在生命活动旺盛
的细胞中更需要蛋白质的参与!所以蛋白质的大量
合成也多发生在细胞活力旺盛的细胞中
龙眼
C3D
生长早期有多种蛋白质合成相关酶
的表达!鉴定到的有
&
个!分别是二硫化物异构酶*
延伸因子类似蛋白*蛋白质异形体
#
*蛋白酶体两类
亚基*酸性核糖蛋白从整体表达趋势来看以早期
大量表达为主!后期也有蛋白酶体和酸性核糖蛋白
的表达!但是表达量很少在龙眼
C3D
生长到
#"L
时二硫化物异构酶*延伸因子类似蛋白*蛋白质异形
体
#
*
PK]
结合蛋白都拥有最高表达量!除蛋白质
异形体
#
在
)"L
时降到最低点!其他都在
%"L
时表
达量就降到最低
PK]
结合蛋白"
PK]X-/L-/
@E
=:TB-/
!
P
蛋
白#!与
PK]
或
PH]
结合的蛋白质!又叫鸟苷酸结
合调节蛋白"
@
<5/-/B/<96B:T-LB(X-/L-/
@
=B
@
<65T:=
W
E
=:TB-/
#!它参与细胞的多种生命活动!如细胞通
讯*核糖体与内质网的结合*小泡运输*蛋白质合成
等在龙眼
C3D
生长早期鉴定到
PK]
结合蛋白的
表达!推测与细胞快速增值时蛋白质合成*信号转导
等需要有关龙眼
C3D
生长
#"
"
%"L
都有不同程
度表达量推定的蛋白质异形体
#
"
A
WE
:TABT-956
E
=:(
TB-/-.:U:=4#
#!且以
#"L
时表达量最高蛋白质
异形体"
E
=:TB-/-.:U:=4
#是一些功能上相关!而结
构不同的蛋白质形式例如由同种
4J2N
前体经
可变剪接可以产生功能相关的不同蛋白质延伸因
子"
B6:/
@
5T-:/U59T:=
!
3C
#是参与蛋白合成过程中肽
链延伸的蛋白因子!在蛋白质合成过程中!帮助进入
的氨基酸残基与肽链之间形成酰基!使肽链得以延
长延 伸 因 子 类 似 蛋 白 "
B6:/
@
5T-:/U59T:=(6-GB
E
=:TB
#在龙眼胚性愈伤组织生长前期被发现有表
达!可能与快速生长时蛋白质的大量合成有关二
硫化物异构酶"
L-.<6U-LB-.:4B=5.B
#是存在于真核
生物细胞质网状结构的一种酶!它可以催化形成或
断裂蛋白质半胱氨酸残基之间的二硫键!以保证蛋
白质能迅速而准确地完成折叠二硫化物异构酶在
蛋白质折叠中扮演着重要角色+#+,
在龙眼
C3D
生长过程中发现了蛋白酶体的两
类亚基!蛋白酶体
%
亚基和
$
亚基
&
*
#"
!都是在组
织培养
!"L
时有大量的表达蛋白酶体是存在于
胞质溶胶中的一类结构和功能保守的蛋白酶解复合
$##
#
期
!!!!!!!!!!
李
!
然!等$龙眼松散型胚性愈伤组织发生过程中相关蛋白的表达分析
物!在真核生物和古菌中普遍存在的!蛋白酶体是细
胞用来调控特定蛋白质和除去错误折叠蛋白质的主
要机制经过蛋白酶体的降解!蛋白质被切割为约
&
"
1
个氨基酸的肽段&这些肽段可以被进一步降解
为单个氨基酸分子!然后被用于合成新的蛋白质
从不同酶不同时间的表达可以看出
#"
"
!"L
是龙眼
C3D
快速生长增值的阶段!到
%"L
时表达
量开始下降!可能是一个转折期!后期表达量和酶的
种类都减少!可能细胞的生长渐趋缓慢甚至停止
因此继代培养或者用于做细胞培养时!龙眼
C3D
最
晚取
!"L
时的材料
@*@
!
细胞骨架和调控蛋白是维持龙眼松散型胚性
愈伤组织生命活动的重要物质
在龙眼
C3D
生长旺盛的中期鉴定到
)
种与细
胞骨架重构相关的蛋白和
%
种调控相关蛋白!都在
!"
"
%"L
有大量表达!之后便逐渐减少此时表达
的
&
类 重 链 肌 球 蛋 白 "
4
W
:.-/965..
&
AB5>
W
9A5-/
#*类肌球蛋白
F^D
"
4
W
:.-/(6-GB
E
=:TB-/ F^D
#*
肌动蛋白*
%
(
微管蛋白都是构成细胞骨架系统的主
要成分!在细胞运动*细胞分裂*受精作用*基因表达
和信息传递*能量转换以及维持细胞形态等方面都
具有重要作用
而
%
种调控相关蛋白$新生多肽相关复合物
%
亚基类似蛋白
%
"
N6
E
A5(2ND(6-GB
E
=:TB-/%
#*逆转
录转座子蛋白及肌动蛋白结合蛋白均为赖呈纯等+&,
鉴定得到的逆转录转座子在植物中作为核
H2N
的主要组分含量丰富!玉米
)0I
"
&1I
的基因组由
逆转录转座子构成+#&,小麦基因组
+1I
是转座
子+#1,转录转座子蛋白则与逆转录转座子的
J2N
*蛋白质的产生及包装成适当的形状以整合到
基因组中有关+#0,肌动蛋白结合蛋白是一类调节
肌动蛋白聚合*成束或交联的蛋白质!能将肌动蛋白
丝与细胞浆和细胞膜的其他成分相连接+!",!从而介
导细胞形态的维持*细胞运动等众多生物学功
能+!#,
新生多肽相关复合物
%
亚基类似蛋白与转录调
控蛋白有相似的序列!且报道有催化加强
9(cL-5TBL
的转录的功能!在荔枝体胚发生初期+!!,和龙
眼体胚发生早期+&,都能检测到它的大量表达!但目
前的研究对其生物学功能尚不能完全解释!推测其
亚单位对基因的转录有调控作用+!%,
在龙眼
C3D
生长的旺盛时期!细胞骨架相关蛋
白和调控蛋白的大量表达!对于细胞快速分裂!维持
细胞形态以及运动等生命活动起到重要作用
@*A
!
从蛋白质水平解释龙眼松散型胚性愈伤组织
的衰老机制
蛋白质是一切生命活动的体现者蛋白质组是
一个体系"包括细胞*亚细胞器*体液等#中的所有蛋
白质!更能体现一个系统或组织的生命活动从龙
眼松散型胚性愈伤组织生长的不同阶段表达的蛋白
质可以看出!主要是与细胞生长*分化*代谢*信号转
导*细胞凋亡和抗逆性等功能相关!这充分反映了龙
眼松散型胚性愈伤组织生长发育的生物学过程
在成功鉴定的蛋白质中!有占鉴定成功的总蛋
白数
%"*%"I
的蛋白与胁迫应答和抗氧化相关
#!
个过氧化物酶!三类抗坏血酸过氧化物酶"共
$
个#!
谷胱甘肽过氧化酶*过氧化氧化还原蛋白*苄基醚还
原酶同系物
K?+
各
#
个在龙眼
C3D
整个生长过
程中的不同时期都有抗氧化相关酶的表达!在早期
表达的有
%
个抗坏血酸过氧化物酶!苄基醚还原酶
同系物
K?+
!可及时清除生理代谢过程中产生的氧
自由基!维持细胞内氧化胁迫压力平衡苄基醚还
原酶可以催化异黄酮类和木酚素的生物合成!苄基
醚还原酶同系物
K?+
!是催化异黄酮类和木酚素生
物合成还原酶类的同系物+!),!异黄酮和木酚素不仅
能促进心材的快速生长!并且在植物防御方面也起
到很大作用+!$,该酶在胚性愈伤组织培养
#"L
时
就被检测到有大量表达!可能还与细胞生长及分化
相关
抗坏血酸过氧化物酶"
N]^
#是利用抗坏血酸
"
N.N
#为电子供体清除
?
!
[
!
的一类酶在鉴定成
功的酶中!有
%
类抗坏血酸过氧化物酶$除抗坏血酸
过氧化物酶外还有细胞质抗坏血酸类过氧化物酶
#
和类囊体结合抗坏血酸过氧化物酶!抗坏血酸过氧
化物酶
J#)&
*
J#$1
和类囊体结合抗坏血酸过氧化
物酶主要在前
%"L
内有大量表达!而之后主要表达
的是抗坏血酸过氧化物酶
J%+#
和细胞质抗坏血酸
类过氧化物酶
#
可见在整个培养过程中从
#"
"
$"
L
都有不同的
N]^
表达以发挥主要作用
在中期过氧化氧化还原蛋白和两类抗坏血酸类
过氧化物酶有少量表达!可能是细胞的生理状态开
始发生改变!生长速度有所降低!细胞活力也开始下
降!对胁迫也开始有应答!因此在此阶段表达的氧化
胁迫酶种类和表达量都不高而过氧化氧化还原蛋
白"
]=8
#也是一种重要的氧自由基清除剂!研究证明
寄生植物体内该酶是清除过氧化氢"
?
!
[
!
#最重要的
酶
S5
W
BL
等+!+,对曼森吸血虫"
/%0"*1$*$#&#&,*$,"
#
]=84J2N.
的定量监控表明!在整个生活周期中
]=8
+##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
都有不同程度的表达!尤其以成熟期表达量最高推
定的
E
=8(#
*
E
=8(!
*
E
=8(%
在龙眼
C3D
生长后期有表
达!可能主要参与清除氧自由基
到后期随着细胞衰老的加剧!累积的氧自由基
需要清除!表达出大量过氧化物酶
)
和两个抗坏血
酸过氧化物酶来行使抗氧化延缓衰老的生理机制
过氧化物酶"
][H
#是存在于各种动物*植物和微生
物体内的一类氧化酶催化由过氧化氢参与的各种
还原剂的氧化反应在植物生长发育过程中它的活
性不断发生变化!一般老化组织中活性较高!幼嫩组
织中活性较弱在龙眼
C3D
生长过程中共鉴定到
#!
个过氧化物酶!也表现出在生长前期少量表达!
主要集中在
)"
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