全 文 ：书西北植物学报!
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#$""#&""!! !"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/ !! 文章编号$
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收稿日期$!"#*("0(#0 &修改稿收到日期$
!"#*(##(##
基金项目$四川省杰出青年基金" !"#)12""%3 # 作者简介$谌琴琴"
#00"
#!女!在读硕士研究生!主要从事穿心莲内酯生物代谢调控研究
4(56-7
$.89/ : -/!""" ! .-/6+;/ " 通信作者$王
!
强!博士!教授!博士生导师!主要从事作物次生代谢调控与分子育种研究
4(56-7
$: <6/ =! .-;6>+9?>+;/ 病毒诱导基因沉默鉴定穿心莲内酯 生物合成关键酶$
%
&(
功能
谌琴琴#!刘
!
琴#!李聪聪#!付羽萍!!王
!
强#"
"
#
四川农业大学 生态农业研究所!成都
$###%" & ! 四川农业大学 动物医学院!成都$###%"
#
摘
!
要$该研究采用病毒诱导基因沉默技术" @ABC #!以生长到第 3 片真叶期的穿心莲植株为实验材料!沉默参与穿 心莲内酯生物合成的 !"#( 柯巴基焦磷酸合酶基因"$
%
&(
#!用半定量和荧光定量
DEF
检测病毒诱导沉默后
$% &( 及其上游基因的表达!用 GDHE 法检测$
%
&(
沉默后穿心莲内酯的积累变化!同时检测茉莉酸甲酯"
I9(
1J
#处理后
$% &( 及上游基因的表达!以全面分析穿心莲内酯代谢以及 J K EDC 在穿心莲内酯生物合成中的作用 机制!验证其在植物体内的功能结果显示$"
#
#
$% &( 基因被成功沉默!基因表达显著下调!进而引起上游?牛 儿基?牛儿基焦磷酸合成酶基因" ))( #的表达下调!而 %( 羟 (%( 甲基戊二酰辅酶 J 还原酶基因" *+), #和 #( 脱氧 木酮糖 (*( 磷酸合成酶基因" -.( #的表达未受影响" ! #$
%
&(
基因沉默
#*?
后穿心莲内酯积累量显著下降!表
明
$% &( 是穿心莲内酯生物合成关键酶基因!且能够负反馈影响上游基因表达" % #茉莉酸甲酯" I91J #显著诱 导$
%
&(
及上游基因
*+),
(
-.(
和
))(
的表达!表明穿心莲内酯生物合成基因受到
I91J
的广泛调控该
研究首次使用
@ABC
证明
$% &( 参与到穿心莲内酯生物合成!为利用该技术鉴定穿心莲内酯生物合成途径中其 他基因功能奠定了基础 关键词$
@ABC
&
!"#(
柯巴基焦磷酸合酶&穿心莲内酯&生物合成&基因表达
中图分类号$2&3$
&
2&30
文献标志码$J )*+,-#"+./&0.1.,-21#3.-#"+"4$
%
&(5+6"/62!#+$+!1" 7 1. % 0"/#!28 9#"8 : +-028#8; : <#1*8=#+!*,2!>2+2(#/2+,#+ 7 CG4L2-/ : -/ # ! HAM2-/ # ! HAEN/ = ;N/ = # ! OMP> K -/ = ! ! QJLB2-6/ = # " " #A/.R-R>R9NS4;N7N = -;67J = T-;>7R>T9 ! C-;8>6/J = T-;>7R>T67M/-U9T.-R V ! E89/ = ?>$###%"
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E8-/6
&
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V
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C-;8>6/J
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T-;>7R>T67M/-U9T.-R
V
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E89/
=
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$W89!"#(;N K 67 V 7?- K 8N. K 86R9. V /R86.9 = 9/9 "$
%
&(
#
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K
>R6R-U9-/UNU759/R-/6/?TN
=
T6
K
8N7(
-?9.X-N.
V
/R89.-.<6..-79/;9?.>;;9..S>7
V
-/R893(796S.R6
=
9NS$"/01 2 03 % 456 % 3"57893#3R8TN> = 8WF@ U-T>.(-/?>;9? = 9/9.-79/;-/ = " @ABC #! <8-;8<6.U9T-S-9?X V .95- : >6R-R6R-U9FW(DEF6/? : >6R-R6R-U9FW( DEF+ " # # B9/9.-79/;-/ = NS$
%
&(T9.>7R9?-/?9;T96.9?6;;>5>76R-N/NS6/?TN
=
T6
K
8N7-?9..-
=
/-S-;6/R7
V
<-R8GDHE6/67
V
.-.+
"
!
#
A/NT?9TRN;N5
K
T989/.-U97
V
-/U9.R-
=
6R9
=
9/99Y
K
T9..-N/NS6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.X-N(
.
V
/R89.-.
!
R89>
K
RT965
=
9/9.
!
*+),
!
-.(6/?))(<9T9;8N.9/RNX96/67
V
Z9?X
V:
FW(DEF+A/@ABC
K
76/R.
!
))(.8N<9??9;T96.9?RT6.;T-
K
R6;;>5>76R-N/
!
<8-;85-
=
8RX9T9.>7R9?STN5/9
=
9R-U9S99?X6;[NS
BBDD6;;>5>76R9?6SR9T$% &( = 9/9.-79/;-/ = +LN.- = /-S-;6/R;86/ = 9<6.NX.9TU9?SNT*+),6/?-.( > K N/$
%
&(
=
9/9.-79/;-/
=
+
"
%
#
*+),
!
-.(6/?))(9Y8-X-R9?-/?>;-X79
=
9/99Y
K
T9..-N/<-R8I91J
RT96R59/R
!
6.<976.$% &( ! -/?-;6R-/ =K 79-NRTN K -;T9 = >7R-N/NSI91JN/6/?TN = T6 K 8N7-?9.X-N. V /R89.-.+AR -.R89S-T.RT9 K NTRRN;86T6;R9T-Z9$
%
&(-/UN7U9?-/6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.X-N.
V
/R89.-.5":5:1R8TN>
=
8@ABC
!
<8-;876
V
.R89SN>/?6R-N/SNTS>TR89T-/U9.R-
=
6R-N/NSNR89T6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.X-N.
V
/R89R-;
=
9/9.+
?2
:
@"1!8
$@ABC & !"#(;N K 67 V 7?- K 8N. K 86R9. V /R86.9 & 6/?TN = T6 K 8N7-?9. & X-N. V /R89.-. K 6R8<6 V & = 9/99Y K T9.( .-N/ !! 中药穿心莲是爵床科穿心莲属植物穿心莲 )$"/01
2
03
%
456
%
3"57893#3
"
\>T5+S+
#
L99.
*的干
燥地上部分!又名一见喜(印度草(榄核莲!味苦!是
清热解毒(抗菌消炎之要药)#*现代药理研究表明
穿心莲具有抗肿瘤)!(%*(抗病毒)*(免疫调节及肝保
护作用)**等!主要药效成分是穿心莲内酯和脱水穿
心莲内酯但穿心莲内酯类化合物的生物合成途径
还未被解析!限制了其在合成生物学领域的研究
穿心莲内酯是由
#
个五元内酯环和
#
个半日花
烷型双环骨架组成的二萜内酯)$*!具有萜类化合物 共同前体焦磷酸异戊烯酯" ADD #和焦磷酸 " ! " ( 二甲 基烯丙酯" ]IJDD # ADD 和 ]IJDD 是由细胞质 中的甲羟戊酸途径" I@J #或质体中的 !E( 甲基 ()( 磷酸 ()]( 赤藓糖醇途径" I4D #生成的)&* I@J 途 径主要为生成倍半萜(三萜等提供前体! I4D 途径 为单萜(二萜和四萜等提供前体二萜是以 % 个 ADD 和 # 个 ]IJDD 头尾相连形成的?牛儿基?牛 儿醇焦磷酸酯" = 9T6/ V 7 = 9T6/ V 7 KV TN K 8N. K 86R9 ! BB( DD #为直接前体)3*!由二萜合酶催化成环!并经后续 的氧化修饰形成)0*穿心莲中的一个二萜合酶 (!"#( 柯巴基焦磷酸合酶" !"#(;N K 67 V 7?- K 8N. K 86R9. V /( R86.9 !简称$
%
&(
#的基因序列已被报道)#"*本
实验室用原核表达和微生物代谢工程技术鉴定了
$% &( 的生化功能!即催化 BBDD 生成 !"#( 焦磷酸 古巴酯" !"#(EDD #!该反应为穿心莲内酯生物合成重 要步骤!可能是穿心莲内酯生物合成的一个关键 酶)##*!但该途径在赤霉素生物合成中也存在!因此$
%
&(
的体内功能仍需进一步验证
病毒诱导基因沉默技术"
U-T>.(-/?>;9?
=
9/9.-(
79/;-/
=
!
@ABC
#是一个有效的反向遗传学工具!被广
泛应用于植物基因体内功能鉴定!如番茄)#!*(烟
草)#%*等植物在中草药中!
C-/
=
8
)
#)
*利用
@ABC
成
功沉默了南非醉茄中的
(;(
基因!减少了植物体内
醉茄内酯的积累&
H-
)
#*
*利用
@ABC
在天仙子中鉴定
了一个参与莨菪烷生物合成的细胞色素
D)*"
的功
能作者前期以穿心莲中的八氢番茄红素脱氢酶基
因"
$% -( #为报告基因!用烟草脆裂病毒" RNX6;;N T6RR79U-T>. ! WF@ #为载体在穿心莲体内建立了病毒 诱导基因沉默体系)#$*本研究利用
WF@(@ABC
在
穿心莲叶片中沉默
$% &( !并使用 GDHE 法测定 沉默后叶片中穿心莲内酯的含量!同时通过 : FW( DEF 技术检测穿心莲内酯生物合成上游基因和$
%
&(
的表达水平!研究了
J
K
EDC
在穿心莲内酯
生物合成中的作用机制!并验证了其在植物体内的
功能
#
!
材料和方法
A+A
!
材
!
料
穿心莲种子收集于广西贵港!种植在人工气候
室!生长条件为
#)8
光照"
!3^
#和
#"8
黑暗"
!*
^
#经四川农业大学王强教授完成鉴定
A+B
!
方
!
法
ACBCA
!
<5>(
载体构建
!
根据
LE\A
上已报道
$% &( 基因序列" B9/\6/[ 登录号 _D03!30! #及 K WF@! " J\FE #的多克隆位点!使用软件 7`- = N& 和 DT-59T% 设计 # 对克隆引物$
%
&((WF@(O
"
<3=G
#
#和
K
EDC(WF@(F
"
.41
#
#"表
#
#!以含有
全长
$% &( 的 K B4I(W 载体为模板!进行 DEF 扩增!胶回收纯化得到一段 )&%X K 的核心保守片段 TEDC 使用 <3=G # 和 .41 # 对回收产物及 K WF@! 进行双酶切!回收的酶切产物用 W ) (]LJ " W6_6F6 #连接酶连接!连接产物转化 W` D #" 感受态 细胞" WAJLB4L #!通过菌落 DEF 及质粒酶切鉴定 获得重组表达载体 K WF@!(0&( A+B+B ! 农杆菌浸染 ! 分别将 K WF@# " J\FE #和 K WF@!(TEDC 用冻融法转化农杆菌菌株 B@%#"# "本实验室保存#! )38 后挑取单菌落接入 *5HH培养基"含 *"5 = % H 卡那霉素! *"5 = % H 利福平! *" 5 = % H 庆大霉素# !3^ 过夜培养活化!次日将活化过 的菌液加入到 *"5H 含有 #"55N7 % H!( 吗啉乙磺 酸" I4C #和 !"$
5N7
%
H
乙酰丁香酮"
JC
#的带抗生
素的
H液体培养基中!
3^
过夜培养!离心收集农
杆菌菌体用侵染缓冲液"
#"55N7
%
H I
=
E7
!
!
#"
55N7
%
HI4C
!
!""
$5N7 % H JC #悬浮菌体!调整 ]`$""
为
#+"
!室温下放置
%8
后侵染穿心莲内酯
在生长阶段的叶片中积累最快)#&*!所以选择
3
叶期
3#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 植株进行侵染侵染时将含有 K WF@# 和 K WF@!( 0&( 的农杆菌 #a# 混合!用无针头的注射器在叶 片背面注射!使菌液充满整个叶片!每颗苗注射 ! % ) 片叶子将注射后的植株放在 !!^ 的恒温培养 箱中连续光照 #!8 !后正常培养 A+B+D ! 基因表达检测 ! 取浸染农杆菌 #*? 后的叶 片提取总 FLJ !以 7`- = N " ?W #为引物!用 I(IH@ 反 转录酶" W6_6F6 #合成 ;]LJ 使用半定量和荧光定 量 DEF 检测$
%
&(
基因沉默效果
$% &( 基因及 内参$7#5"
基因"
B9/\6/[
登录号
1b)))"*$#的半定 量及荧光定量检测引物见表 # 半定量 DEF 反应条 件为$
0*^
预变性
*5-/
&
0*^
变性
%".
&
**^
退火
%".
&
!^
延伸
#5-/
&
%"
个循环&
!^
延伸
&5-/
&
)
^
保存
DEF
产物用
#c
的琼脂糖凝胶电泳检测
荧光定量
DEF
使用
C.NO6.R4U6BT99/C>
K
9T5-Y
试剂在
EOb0$荧光定量 DEF 仪" \-N(F6? #上进行 检测反应条件为$
0*^
预变性
%5-/
&
0*^
变性
#*.
&
**^
退火
#*.
&
!^
延伸
!".
&
)"
个循环每
个样品均设
%
个重复!采用仪器自带软件
\-N(F6?
EOb56/6
=
9T
按
!

&
&
#法处理数据!使用
4Y;97!"#"
作图
用
#""
$5N7 % HI91J 处理 3 叶期穿心莲植株! 在 " ($
(
#!
(
!)
和
)38
取样!提取
FLJ
并合成
;](
LJ
用于检测穿心莲内酯生物合成上游基因
))(
"
B9/\6/[
登录号
J10&%#%%
#(
*+),
"
B9/\6/[
登
录 号
JP!*)%30
#和
-.(
"
B9/\6/[
登 录 号
JP!*)%0"
#的表达!引物见表
#

ACBCE
!
FG&
法测定含量
!
!
#
"对照品
!
穿心莲内
酯!脱水穿心莲内酯 "批号分别为
##"&0&(!""%"&
和
##"3*)(!"#""&
#!购自中国食品药品检定研究
院精密称取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照
品!加甲醇制成
*
=
%
H
贮备液
!"色谱条件
!
高效液相色谱仪"
J
=
-79/R(
##""
#!色谱柱
J
=
-79/RE
#3
"
)+$55d!*"55 ! *$
5
#&流动相甲醇"
J
#
(
水"
#!梯度洗脱"
%
#!5-/
!
%"
%
$"c J & #! % !"5-/ !$"c J
&
!"
%
!%5-/
!
$"c % %"cJ & !% % !*5-/ ! %"cJ #&柱温 !*^ &穿 心莲内酯和脱水穿心莲内酯检测波长分别为 !!* 和 !*)/5 &流速 "+35H % 5-/ ) #3 * &进样量 #"$
H
穿心
莲内酯和脱水穿心莲内酯的保留时间分别是
0+)
和
#$+*5-/ !与其他组分分离良好 ! % "标准曲线的制作 ! 取对照品贮备液稀释成 * 个不同浓度的对照品溶液!分别进样 #"$
H
!记录
峰面积!以峰面积对标品含量进行回归分析!即得对
照品的标准曲线回归方程为$穿心莲内酯! >e #03%.f#*""+# " , ! e"+000# #&脱水穿心莲内酯! >e#$!%+).f$3+0$&
"
,
!
e"+000&
#
!
)
"供试品溶液的制备
!
称取穿心莲叶片鲜重
"+*
=
!研匀!加入
#"5H
甲醇!浸渍
#8
!超声处理
"功率
!!"Q
!频率
%%[GZ
#
%"5-/
!
)"""T
%
5-/
离
表
A
!
片段扩增及检测引物
W6X79#
!
W89
K
T-59T.SNTDEF65
K
7-S-;6R-N/6/?6/67
V
.-.
用途
M.6
=
9
名称
L659
序列
C9
:
>9/;9
长度
H9/
=
R8
%
X
K
登录号
B9/\6/[
代谢途径
I9R6XN7-;
K
6R8<6
V
载体构建
@9;RNT;N/.RT>;R-N/
J
K
EDC(WF@(O
"
<3=G
#
#
J
K
EDC(WF@(F
"
.41
#
#
BEBBJWEEJBWBWEEWBJEBBEWEJWWW
BEEWEBJBWWEEEEWBBJJJEJWEJEEWB
)&% _D03!30!
穿心莲内酯生物合成
J/?TN
=
T6
K
8N7-?9X-N.
V
/R89.-.
FW(DEF
X?7EDC(O
X?7EDC(F
EWEEBWJWEJBEEEEWWBW
WEJBJJBWJJEBBEBBBWJW
%)" _D03!30!
穿心莲内酯生物合成
J/?TN
=
T6
K
8N7-?9X-N.
V
/R89.-.
X?7J;R-/(O
X?7J;R-/(F
JEJWBEBJWEEWEEBWEWWB
BEJBEWWEEJWEEEBJWEJW
%"" 1b)))"*$肌动蛋白 J;R-/ : FW(DEF : EDC(O : EDC(F EJEEJWEWEEBEEWBWEW JEEJEEJEWEJEBEEJEW 3# _D03!30! 穿心莲内酯生物合成 J/?TN = T6 K 8N7-?9X-N. V /R89.-. : J;R-/(O : J;R-/(F WWEJEEJEWJEJBEJBJBEB JJBBJEEWEJBBBEJWEB #3$ 1b)))"*$肌动蛋白 J;R-/ : BBDDC(O : BBDDC(F BWWBWEJJBBWBEJWWBBWB BEWEEJEWWEEBJEWEWBWE #33 J10&%#%% 异戊二烯 A.N K T9/N-?. : GIBF(O : GIB4(F WWEBWBJWBBJJWBJEEJBJ WWBEJJJWEWBEWWBJEEWB #%3 JP!*)%30 甲羟戊酸途径 I@J : ]bC(O : ]bC(F BBEJBJEBBJEEWJEJEJWW BWBBEJJEEJWBWBJJJEJB ##) JP!*)%0" !E( 甲基 ()( 磷酸 ()]( 赤藓糖醇 I4D !! 注$下划线为酶切位点序列
LNR9
$W89>/?9T7-/9SNT9/Z V 597N;>..9 : >9/;9+ 0# # 期 !!!!!!!! 谌琴琴!等$病毒诱导基因沉默鉴定穿心莲内酯生物合成关键酶
J
K
EDC
功能
心
#"5-/
!取上清&沉淀用
#"5H
甲醇再提取
#
次!
合并后用旋转蒸发仪浓缩后用甲醇溶解定容至
#
5H
!
GDHE
测定含量前用
"+)*
$5 的滤膜过滤!各 处理 ) 个生物学重复!每个样品取自 ) 棵植株! % 个 重复相对积累量的计算方法$
穿心莲内酯相对积累量
e
"浸染
#*?
后内酯含
量
3
叶期内酯含量#%
3
叶期内酯含量
d#""c
!
!
结果与分析
BCA
!
HI=&H
及
J
HI=&H
检测
!
1
230
基因表达
采用叶片注射法浸染穿心莲
3
叶期植株"图
#
!
J
#
#*?
后观察!侵染
K
WF@!(0&(
与空载体
K
WF@!
的植株没有明显的表型差异"图
#
!
#取
浸染后生长
#*?
的叶片进行基因表达的检测!
FW(
DEF
检测发现
$% &( 基因表达有明显的下调"图 # ! E #进 一 步 使 用 : FW(DEF 定 量 检 测 发 现$
%
&(
基因表达下调了
)0+3c
"图
#
!
]
#!证明
$% &( 基因被 K WF@!(0&( 病毒载体成功沉默! 效果明显 BCB ! 沉默 ! 1 230 后穿心莲内酯的积累变化 收集穿心莲 3 叶期及农杆菌浸染 #*? 后的叶 片! GDHE 法测定体内穿心莲内酯及脱水穿心莲内 酯含量结果显示相对于 3 叶期!生长 #*? 后的 WF@ 空白对照和$
%
&(
沉默植株中穿心莲内酯
含量均显著增加"图
!
!
J
#!相对于
3
叶期的积累量
分别增加了
#"$+)%c 和 *!+0#c !但$
%
&(
沉默
植株中穿心莲内酯积累量显著低于空白对照"图
!
!
#沉默
$% &( 基因导致穿心莲内酯的积累量显 著下降!符合其生化功能分析)##*!证明 J K EDC 催化 穿心莲内酯生物合成关键步骤脱水穿心莲内酯在 整个生长期含量较低!差异变化不明显 B+D ! 穿心莲内酯生物合成上游基因的表达检测 穿心莲内酯含量可以被茉莉酸甲酯" I91J #诱 J+ 叶片注射法浸染 3 叶期的穿心莲& \+ 沉默$
%
&(
基因
#*?
后的
植株&
E+
叶片中
$% &( 基因表达的 FW(DEF 分析& ]+ 叶片中$
%
&(
基因表达的
:
FW(DEF
分析图中的
WF@
表示浸染
K
WF@!
的空白对照植株!
J
K
EDC(U-
=
.
表示浸染
K
WF@!(0&(
的植株
图
#
!
@ABC
法沉默穿心莲
$% &( 基因 J+J = TN-/S-7RT6R-N/NS$?
%
3"57893#36R3(796S.R6
=
9<-R8796S
-/
,
9;R-N/
&
\+D76/R<-R8$% &( = 9/9.-79/;-/ = SNT#*?6 V . & E+FW(DEF6/67 V .-.NS$
%
&(9Y
K
T9..-N/-/R89796U9.
-/S-7RT6R9?
&
]+
:
FW(DEF6/67
V
.-.NS$% &(9Y K T9..-N/ -/R89796U9.-/S-7RT6R9?+W8976X97.6T9?9.- = /6R9?$
WF@
!
K
76/R.-/S-7RT6R9?<-R8
K
WF@!6.6;N/RTN7
&
J
K
EDC(U-
=
.
!
K
76/R.-/S-7RT6R9?<-R8
K
WF@!(0&(
O-
=
+#
!
$% &( = 9/9.-79/;-/ = -/$?
%
3"57893#3<-R8@ABC
J+3
叶期及浸染生长
#*?
后穿心莲内酯含量&
\+
穿心莲内酯的相对积累量图中的
WF@
表示浸染
K
WF@!
的空白对照植株!
J
K
EDC(U-
=
.
表示浸染
K
WF@!(0&(

""
表示和对照有显著性差异"

#
"+"#
#的植株
图
!
!
@ABC
处理穿心莲后穿心莲内酯的积累
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I91J
诱
导)##*为了分析穿心莲内酯生物合成上游基因是
否与
$% &( 具有相同表达模式!对穿心莲 I@J 途径中的 *+), ( I4D 途径中的 -.( 以及生成 J K EDC 催化底物 BBDD 的 ))( 基因进行了 : FW(DEF 分析结果"图 % ! J #显示! I91J 处理穿 心莲后!$
%
&(
在
#!8
被诱导表达量达到最大!
*+),
(
-.(
(
))(
在
$8 分别被诱导上调了 0+"3 ( %+%# 和 *+3" 倍!除了 *+), 在 #!8 持续被 诱导表达外! -.( 和 ))( 在 #!8 已恢复到正常 表达水平病毒诱导$
%
&(
基因沉默后!
*+),
和
-.(
的表达没有受到影响!但
))(
的表达下
调了
$)+%$c
"图
%
!
#!暗示穿心莲内酯生物合成
中有负反馈调节机制的存在
%
!
讨
!
论
本研究使用
@ABC
法成功沉默了穿心莲叶片中
$% &( 的基因表达!通过 GDHE 法检测到穿心莲 内酯积累量明显下降!证明$
%
&(
在植物体内参
与穿心莲内酯生物合成!符合以往的生化研究)##*
同时
$% &( 基因沉默后!穿心莲植株并未有表型 变化!显示赤霉素代谢未受到影响 在$
%
&(
被
I91J
诱 导 上 调 后!上 游 的
*+),
(
-.(
和
))(
也被诱导上调!并且诱导时
间早于
$% &( !表明 I91J 能够广泛调控穿心莲 萜类代谢相关基因表达!和以往研究中 I91J 诱导 穿心莲悬浮细胞穿心莲内酯积累的结果一致)#0* I91J 处理能引起植物的抗病反应)!"*!本研究中 I91J 诱导穿心莲 I@J 途径的 *+), 上调水平 明显大于 I4D 途径的 -.( !推测 I@J 途径增加 的法尼基焦磷酸用来参与甾醇生物合成!改变细胞 膜结构去抵抗 I91J 模拟的病原菌浸染$
%
&(
被沉默后!
))(
的基因表达显著降低!可能是
J
K
EDC
催化底物
BBDD
的积累负反馈调节上游基
因
))(
的表达!但早期的
*+),
(
-.(
并没有受
到影响!暗示穿心莲内酯生物合成调控主要集中在
))(
和
$% &( 这两个基因然而$
%
&(
沉默
后其下游基因的表达情况!以及与其它萜类代谢流
之间的相互作用仍不清楚!需要进一步的研究
大多数的药用植物的遗传转化技术发展都比较
滞后!使用
@ABC
技术鉴定重要药用成分的生物合
成基因功能是一个可靠便捷的方法然而
@ABC
技
术由于病毒载体的局限性!能用于此方法的植物仍
有限!即使对于现在常用的表达稳定(沉默效果好(
对植物毒副作用小的
WF@
病毒载体适用范围也是
较低的!所以获得适用范围广的病毒载体是急需解
决的问题)!#*另外作者在实验中尝试过不同的农
杆菌浸染方法!最后用针尖刺伤叶片后再用无针头
注射器注射农杆菌的沉默效果最好!并且注射
3
叶
期之前的幼苗存活率较低!表明针对不同植物应当
筛选最佳的侵染时期和方法
参考文献!
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国家药典委员会
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中华人民共和国药典"一部#)
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*
+
北京$中国 医药科技出版社! "#*$
!$3+ ) ! * ! 韩 ! 光!杜钢军!许启泰 + 穿心莲二萜内酯类化合物的合成及抗 肿瘤构效关系研究) 1 * + 中国药学杂志! ""3 ! ED " #" #$
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张丹丹!陈娟娟!方建国!等
+
穿心莲抗人巨细胞病毒的体外实
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期
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谌琴琴!等$病毒诱导基因沉默鉴定穿心莲内酯生物合成关键酶 J K EDC 功能 验研究) 1 * + 医药导报! "#" ! BK "$
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#$#&*(#&3+ ) * * ! 江冬青!罗晓红!谢智颖!等 + 穿心莲临床药理研究概况) 1 * + 国 际中医中药杂志! "#% ! DM " ## #$
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)
$* ! 郗砚彬!巢志茂!魏少荫!等 + 穿心莲中半日花烷型二萜内酯化 学成分和药理活性研究进展) 1 * + 国际中医中药杂志! !""& ! BK " ! #$
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