全 文 ：书西北植物学报!
"#$
!
%$
"
#
#$
""#&""!!
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""()"!*
"
!"#$
#
"#(""#&("$
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#"+&$"$
%
,
+-../+#"""()"!*+!"#$+"#+""#&
收稿日期$
!"#*("0(#0
&修改稿收到日期$
!"#*(##(##
基金项目$四川省杰出青年基金"
!"#)12""%3
#
作者简介$谌琴琴"
#00"
#!女!在读硕士研究生!主要从事穿心莲内酯生物代谢调控研究
4(56-7
$
.89/
:
-/!"""
!
.-/6+;/
"
通信作者$王
!
强!博士!教授!博士生导师!主要从事作物次生代谢调控与分子育种研究
4(56-7
$
:
<6/
=!
.-;6>+9?>+;/
病毒诱导基因沉默鉴定穿心莲内酯
生物合成关键酶
$
%
&(
功能
谌琴琴#!刘
!
琴#!李聪聪#!付羽萍!!王
!
强#"
"
#
四川农业大学 生态农业研究所!成都
$###%"
&
!
四川农业大学 动物医学院!成都
$###%"
#
摘
!
要$该研究采用病毒诱导基因沉默技术"
@ABC
#!以生长到第
3
片真叶期的穿心莲植株为实验材料!沉默参与穿
心莲内酯生物合成的
!"#(
柯巴基焦磷酸合酶基因"
$
%
&(
#!用半定量和荧光定量
DEF
检测病毒诱导沉默后
$
%
&(
及其上游基因的表达!用
GDHE
法检测
$
%
&(
沉默后穿心莲内酯的积累变化!同时检测茉莉酸甲酯"
I9(
1J
#处理后
$
%
&(
及上游基因的表达!以全面分析穿心莲内酯代谢以及
J
K
EDC
在穿心莲内酯生物合成中的作用
机制!验证其在植物体内的功能结果显示$"
#
#
$
%
&(
基因被成功沉默!基因表达显著下调!进而引起上游?牛
儿基?牛儿基焦磷酸合成酶基因"
))(
#的表达下调!而
%(
羟
(%(
甲基戊二酰辅酶
J
还原酶基因"
*+),
#和
#(
脱氧
木酮糖
(*(
磷酸合成酶基因"
-.(
#的表达未受影响"
!
#
$
%
&(
基因沉默
#*?
后穿心莲内酯积累量显著下降!表
明
$
%
&(
是穿心莲内酯生物合成关键酶基因!且能够负反馈影响上游基因表达"
%
#茉莉酸甲酯"
I91J
#显著诱
导
$
%
&(
及上游基因
*+),
(
-.(
和
))(
的表达!表明穿心莲内酯生物合成基因受到
I91J
的广泛调控该
研究首次使用
@ABC
证明
$
%
&(
参与到穿心莲内酯生物合成!为利用该技术鉴定穿心莲内酯生物合成途径中其
他基因功能奠定了基础
关键词$
@ABC
&
!"#(
柯巴基焦磷酸合酶&穿心莲内酯&生物合成&基因表达
中图分类号$
2&3$
&
2&30
文献标志码$
J
)*+,-#"+./&0.1.,-21#3.-#"+"4$
%
&(5+6"/62!#+$+!1"
7
1.
%
0"/#!28
9#"8
:
+-028#8;
:
<#1*8=#+!*,2!>2+2(#/2+,#+
7
CG4L2-/
:
-/
#
!
HAM2-/
#
!
HAEN/
=
;N/
=
#
!
OMP>
K
-/
=
!
!
QJLB2-6/
=
#
"
"
#A/.R-R>R9NS4;N7N
=
-;67J
=
T-;>7R>T9
!
C-;8>6/J
=
T-;>7R>T67M/-U9T.-R
V
!
E89/
=
?>$###%"
!
E8-/6
&
!EN79
=
9NS@9R9T-/6T
V
I9?-;-/9
!
C-;8>6/J
=
T-;>7R>T67M/-U9T.-R
V
!
E89/
=
?>$###%"
!
E8-/6
#
$;8-1.,-
$
W89!"#(;N
K
67
V
7?-
K
8N.
K
86R9.
V
/R86.9
=
9/9
"
$
%
&(
#
<-R8
K
>R6R-U9-/UNU759/R-/6/?TN
=
T6
K
8N7(
-?9.X-N.
V
/R89.-.<6..-79/;9?.>;;9..S>7
V
-/R893(796S.R6
=
9NS$"/01
2
03
%
456
%
3"57893#3R8TN>
=
8WF@
U-T>.(-/?>;9?
=
9/9.-79/;-/
=
"
@ABC
#!
<8-;8<6.U9T-S-9?X
V
.95-
:
>6R-R6R-U9FW(DEF6/?
:
>6R-R6R-U9FW(
DEF+
"
#
#
B9/9.-79/;-/
=
NS$
%
&(T9.>7R9?-/?9;T96.9?6;;>5>76R-N/NS6/?TN
=
T6
K
8N7-?9..-
=
/-S-;6/R7
V
<-R8GDHE6/67
V
.-.+
"
!
#
A/NT?9TRN;N5
K
T989/.-U97
V
-/U9.R-
=
6R9
=
9/99Y
K
T9..-N/NS6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.X-N(
.
V
/R89.-.
!
R89>
K
RT965
=
9/9.
!
*+),
!
-.(6/?))(<9T9;8N.9/RNX96/67
V
Z9?X
V:
FW(DEF+A/@ABC
K
76/R.
!
))(.8N<9??9;T96.9?RT6.;T-
K
R6;;>5>76R-N/
!
<8-;85-
=
8RX9T9.>7R9?STN5/9
=
9R-U9S99?X6;[NS
BBDD6;;>5>76R9?6SR9T$
%
&(
=
9/9.-79/;-/
=
+LN.-
=
/-S-;6/R;86/
=
9<6.NX.9TU9?SNT*+),6/?-.(
>
K
N/$
%
&(
=
9/9.-79/;-/
=
+
"
%
#
*+),
!
-.(6/?))(9Y8-X-R9?-/?>;-X79
=
9/99Y
K
T9..-N/<-R8I91J
RT96R59/R
!
6.<976.$
%
&(
!
-/?-;6R-/
=K
79-NRTN
K
-;T9
=
>7R-N/NSI91JN/6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.X-N.
V
/R89.-.+AR
-.R89S-T.RT9
K
NTRRN;86T6;R9T-Z9$
%
&(-/UN7U9?-/6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.X-N.
V
/R89.-.5":5:1R8TN>
=
8@ABC
!
<8-;876
V
.R89SN>/?6R-N/SNTS>TR89T-/U9.R-
=
6R-N/NSNR89T6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.X-N.
V
/R89R-;
=
9/9.+
?2
:
@"1!8
$
@ABC
&
!"#(;N
K
67
V
7?-
K
8N.
K
86R9.
V
/R86.9
&
6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.
&
X-N.
V
/R89.-.
K
6R8<6
V
&
=
9/99Y
K
T9.(
.-N/
!!
中药穿心莲是爵床科穿心莲属植物穿心莲
)
$"/01
2
03
%
456
%
3"57893#3
"
\>T5+S+
#
L99.
*的干
燥地上部分!又名一见喜(印度草(榄核莲!味苦!是
清热解毒(抗菌消炎之要药)#*现代药理研究表明
穿心莲具有抗肿瘤)!(%*(抗病毒)*(免疫调节及肝保
护作用)**等!主要药效成分是穿心莲内酯和脱水穿
心莲内酯但穿心莲内酯类化合物的生物合成途径
还未被解析!限制了其在合成生物学领域的研究
穿心莲内酯是由
#
个五元内酯环和
#
个半日花
烷型双环骨架组成的二萜内酯)$*!具有萜类化合物
共同前体焦磷酸异戊烯酯"
ADD
#和焦磷酸
"
!
"
(
二甲
基烯丙酯"
]IJDD
#
ADD
和
]IJDD
是由细胞质
中的甲羟戊酸途径"
I@J
#或质体中的
!E(
甲基
()(
磷酸
()](
赤藓糖醇途径"
I4D
#生成的)&*
I@J
途
径主要为生成倍半萜(三萜等提供前体!
I4D
途径
为单萜(二萜和四萜等提供前体二萜是以
%
个
ADD
和
#
个
]IJDD
头尾相连形成的?牛儿基?牛
儿醇焦磷酸酯"
=
9T6/
V
7
=
9T6/
V
7
KV
TN
K
8N.
K
86R9
!
BB(
DD
#为直接前体)3*!由二萜合酶催化成环!并经后续
的氧化修饰形成)0*穿心莲中的一个二萜合酶
(!"#(
柯巴基焦磷酸合酶"
!"#(;N
K
67
V
7?-
K
8N.
K
86R9.
V
/(
R86.9
!简称
$
%
&(
#的基因序列已被报道)#"*本
实验室用原核表达和微生物代谢工程技术鉴定了
$
%
&(
的生化功能!即催化
BBDD
生成
!"#(
焦磷酸
古巴酯"
!"#(EDD
#!该反应为穿心莲内酯生物合成重
要步骤!可能是穿心莲内酯生物合成的一个关键
酶)##*!但该途径在赤霉素生物合成中也存在!因此
$
%
&(
的体内功能仍需进一步验证
病毒诱导基因沉默技术"
U-T>.(-/?>;9?
=
9/9.-(
79/;-/
=
!
@ABC
#是一个有效的反向遗传学工具!被广
泛应用于植物基因体内功能鉴定!如番茄)#!*(烟
草)#%*等植物在中草药中!
C-/
=
8
)
#)
*利用
@ABC
成
功沉默了南非醉茄中的
(;(
基因!减少了植物体内
醉茄内酯的积累&
H-
)
#*
*利用
@ABC
在天仙子中鉴定
了一个参与莨菪烷生物合成的细胞色素
D)*"
的功
能作者前期以穿心莲中的八氢番茄红素脱氢酶基
因"
$
%
-(
#为报告基因!用烟草脆裂病毒"
RNX6;;N
T6RR79U-T>.
!
WF@
#为载体在穿心莲体内建立了病毒
诱导基因沉默体系)#$*本研究利用
WF@(@ABC
在
穿心莲叶片中沉默
$
%
&(
!并使用
GDHE
法测定
沉默后叶片中穿心莲内酯的含量!同时通过
:
FW(
DEF
技术检测穿心莲内酯生物合成上游基因和
$
%
&(
的表达水平!研究了
J
K
EDC
在穿心莲内酯
生物合成中的作用机制!并验证了其在植物体内的
功能
#
!
材料和方法
A+A
!
材
!
料
穿心莲种子收集于广西贵港!种植在人工气候
室!生长条件为
#)8
光照"
!3^
#和
#"8
黑暗"
!*
^
#经四川农业大学王强教授完成鉴定
A+B
!
方
!
法
ACBCA
!
<5>(
载体构建
!
根据
LE\A
上已报道
$
%
&(
基因序列"
B9/\6/[
登录号
_D03!30!
#及
K
WF@!
"
J\FE
#的多克隆位点!使用软件
7`-
=
N&
和
DT-59T%
设计
#
对克隆引物
$
%
&((WF@(O
"
<3=G
#
#和
K
EDC(WF@(F
"
.41
#
#"表
#
#!以含有
全长
$
%
&(
的
K
B4I(W
载体为模板!进行
DEF
扩增!胶回收纯化得到一段
)&%X
K
的核心保守片段
TEDC
使用
<3=G
#
和
.41
#
对回收产物及
K
WF@!
进行双酶切!回收的酶切产物用
W
)
(]LJ
"
W6_6F6
#连接酶连接!连接产物转化
W` D
#"
感受态
细胞"
WAJLB4L
#!通过菌落
DEF
及质粒酶切鉴定
获得重组表达载体
K
WF@!(0&(

A+B+B
!
农杆菌浸染
!
分别将
K
WF@#
"
J\FE
#和
K
WF@!(TEDC
用冻融法转化农杆菌菌株
B@%#"#
"本实验室保存#!
)38
后挑取单菌落接入
*5HH培养基"含
*"5
=
%
H
卡那霉素!
*"5
=
%
H
利福平!
*"
5
=
%
H
庆大霉素#
!3^
过夜培养活化!次日将活化过
的菌液加入到
*"5H
含有
#"55N7
%
H!(
吗啉乙磺
酸"
I4C
#和
!"
$
5N7
%
H
乙酰丁香酮"
JC
#的带抗生
素的
H液体培养基中!
3^
过夜培养!离心收集农
杆菌菌体用侵染缓冲液"
#"55N7
%
H I
=
E7
!
!
#"
55N7
%
HI4C
!
!""
$
5N7
%
H JC
#悬浮菌体!调整
]`
$""
为
#+"
!室温下放置
%8
后侵染穿心莲内酯
在生长阶段的叶片中积累最快)#&*!所以选择
3
叶期
3#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
植株进行侵染侵染时将含有
K
WF@#
和
K
WF@!(
0&(
的农杆菌
#a#
混合!用无针头的注射器在叶
片背面注射!使菌液充满整个叶片!每颗苗注射
!
%
)
片叶子将注射后的植株放在
!!^
的恒温培养
箱中连续光照
#!8
!后正常培养
A+B+D
!
基因表达检测
!
取浸染农杆菌
#*?
后的叶
片提取总
FLJ
!以
7`-
=
N
"
?W
#为引物!用
I(IH@
反
转录酶"
W6_6F6
#合成
;]LJ
使用半定量和荧光定
量
DEF
检测
$
%
&(
基因沉默效果
$
%
&(
基因及
内参
$7#5"
基因"
B9/\6/[
登录号
1b)))"*$
#的半定
量及荧光定量检测引物见表
#
半定量
DEF
反应条
件为$
0*^
预变性
*5-/
&
0*^
变性
%".
&
**^
退火
%".
&
!^
延伸
#5-/
&
%"
个循环&
!^
延伸
&5-/
&
)
^
保存
DEF
产物用
#c
的琼脂糖凝胶电泳检测
荧光定量
DEF
使用
C.NO6.R4U6BT99/C>
K
9T5-Y
试剂在
EOb0$
荧光定量
DEF
仪"
\-N(F6?
#上进行
检测反应条件为$
0*^
预变性
%5-/
&
0*^
变性
#*.
&
**^
退火
#*.
&
!^
延伸
!".
&
)"
个循环每
个样品均设
%
个重复!采用仪器自带软件
\-N(F6?
EOb56/6
=
9T
按
!

&
&
#法处理数据!使用
4Y;97!"#"
作图
用
#""
$
5N7
%
HI91J
处理
3
叶期穿心莲植株!
在
"
(
$
(
#!
(
!)
和
)38
取样!提取
FLJ
并合成
;](
LJ
用于检测穿心莲内酯生物合成上游基因
))(
"
B9/\6/[
登录号
J10&%#%%
#(
*+),
"
B9/\6/[
登
录 号
JP!*)%30
#和
-.(
"
B9/\6/[
登 录 号
JP!*)%0"
#的表达!引物见表
#

ACBCE
!
FG&
法测定含量
!
!
#
"对照品
!
穿心莲内
酯!脱水穿心莲内酯 "批号分别为
##"&0&(!""%"&
和
##"3*)(!"#""&
#!购自中国食品药品检定研究
院精密称取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照
品!加甲醇制成
*
=
%
H
贮备液
!"色谱条件
!
高效液相色谱仪"
J
=
-79/R(
##""
#!色谱柱
J
=
-79/RE
#3
"
)+$55d!*"55
!
*
$
5
#&流动相甲醇"
J
#
(
水"
#!梯度洗脱"
%
#!5-/
!
%"
%
$"c J
&
#!
%
!"5-/
!
$"c J
&
!"
%
!%5-/
!
$"c
%
%"cJ
&
!%
%
!*5-/
!
%"cJ
#&柱温
!*^
&穿
心莲内酯和脱水穿心莲内酯检测波长分别为
!!*
和
!*)/5
&流速
"+35H
%
5-/
)
#3
*
&进样量
#"
$
H
穿心
莲内酯和脱水穿心莲内酯的保留时间分别是
0+)
和
#$+*5-/
!与其他组分分离良好
!
%
"标准曲线的制作
!
取对照品贮备液稀释成
*
个不同浓度的对照品溶液!分别进样
#"
$
H
!记录
峰面积!以峰面积对标品含量进行回归分析!即得对
照品的标准曲线回归方程为$穿心莲内酯!
>e
#03%.f#*""+#
"
,
!
e"+000#
#&脱水穿心莲内酯!
>e#$!%+).f$3+0$&
"
,
!
e"+000&
#
!
)
"供试品溶液的制备
!
称取穿心莲叶片鲜重
"+*
=
!研匀!加入
#"5H
甲醇!浸渍
#8
!超声处理
"功率
!!"Q
!频率
%%[GZ
#
%"5-/
!
)"""T
%
5-/
离
表
A
!
片段扩增及检测引物
W6X79#
!
W89
K
T-59T.SNTDEF65
K
7-S-;6R-N/6/?6/67
V
.-.
用途
M.6
=
9
名称
L659
序列
C9
:
>9/;9
长度
H9/
=
R8
%
X
K
登录号
B9/\6/[
代谢途径
I9R6XN7-;
K
6R8<6
V
载体构建
@9;RNT;N/.RT>;R-N/
J
K
EDC(WF@(O
"
<3=G
#
#
J
K
EDC(WF@(F
"
.41
#
#
BEBBJWEEJBWBWEEWBJEBBEWEJWWW
BEEWEBJBWWEEEEWBBJJJEJWEJEEWB
)&% _D03!30!
穿心莲内酯生物合成
J/?TN
=
T6
K
8N7-?9X-N.
V
/R89.-.
FW(DEF
X?7EDC(O
X?7EDC(F
EWEEBWJWEJBEEEEWWBW
WEJBJJBWJJEBBEBBBWJW
%)" _D03!30!
穿心莲内酯生物合成
J/?TN
=
T6
K
8N7-?9X-N.
V
/R89.-.
X?7J;R-/(O
X?7J;R-/(F
JEJWBEBJWEEWEEBWEWWB
BEJBEWWEEJWEEEBJWEJW
%"" 1b)))"*$
肌动蛋白
J;R-/
:
FW(DEF
:
EDC(O
:
EDC(F
EJEEJWEWEEBEEWBWEW
JEEJEEJEWEJEBEEJEW
3# _D03!30!
穿心莲内酯生物合成
J/?TN
=
T6
K
8N7-?9X-N.
V
/R89.-.
:
J;R-/(O
:
J;R-/(F
WWEJEEJEWJEJBEJBJBEB
JJBBJEEWEJBBBEJWEB
#3$ 1b)))"*$
肌动蛋白
J;R-/
:
BBDDC(O
:
BBDDC(F
BWWBWEJJBBWBEJWWBBWB
BEWEEJEWWEEBJEWEWBWE
#33 J10&%#%%
异戊二烯
A.N
K
T9/N-?.
:
GIBF(O
:
GIB4(F
WWEBWBJWBBJJWBJEEJBJ
WWBEJJJWEWBEWWBJEEWB
#%3 JP!*)%30
甲羟戊酸途径
I@J
:
]bC(O
:
]bC(F
BBEJBJEBBJEEWJEJEJWW
BWBBEJJEEJWBWBJJJEJB
##) JP!*)%0"
!E(
甲基
()(
磷酸
()](
赤藓糖醇
I4D
!!
注$下划线为酶切位点序列
LNR9
$
W89>/?9T7-/9SNT9/Z
V
597N;>..9
:
>9/;9+
0#
#
期
!!!!!!!!
谌琴琴!等$病毒诱导基因沉默鉴定穿心莲内酯生物合成关键酶
J
K
EDC
功能
心
#"5-/
!取上清&沉淀用
#"5H
甲醇再提取
#
次!
合并后用旋转蒸发仪浓缩后用甲醇溶解定容至
#
5H
!
GDHE
测定含量前用
"+)*
$
5
的滤膜过滤!各
处理
)
个生物学重复!每个样品取自
)
棵植株!
%
个
重复相对积累量的计算方法$
穿心莲内酯相对积累量
e
"浸染
#*?
后内酯含
量
3
叶期内酯含量#%
3
叶期内酯含量
d#""c
!
!
结果与分析
BCA
!
HI=&H
及
J
HI=&H
检测
!
1
230
基因表达
采用叶片注射法浸染穿心莲
3
叶期植株"图
#
!
J
#
#*?
后观察!侵染
K
WF@!(0&(
与空载体
K
WF@!
的植株没有明显的表型差异"图
#
!
#取
浸染后生长
#*?
的叶片进行基因表达的检测!
FW(
DEF
检测发现
$
%
&(
基因表达有明显的下调"图
#
!
E
#进 一 步 使 用
:
FW(DEF
定 量 检 测 发 现
$
%
&(
基因表达下调了
)0+3c
"图
#
!
]
#!证明
$
%
&(
基因被
K
WF@!(0&(
病毒载体成功沉默!
效果明显
BCB
!
沉默
!
1
230
后穿心莲内酯的积累变化
收集穿心莲
3
叶期及农杆菌浸染
#*?
后的叶
片!
GDHE
法测定体内穿心莲内酯及脱水穿心莲内
酯含量结果显示相对于
3
叶期!生长
#*?
后的
WF@
空白对照和
$
%
&(
沉默植株中穿心莲内酯
含量均显著增加"图
!
!
J
#!相对于
3
叶期的积累量
分别增加了
#"$+)%c
和
*!+0#c
!但
$
%
&(
沉默
植株中穿心莲内酯积累量显著低于空白对照"图
!
!
#沉默
$
%
&(
基因导致穿心莲内酯的积累量显
著下降!符合其生化功能分析)##*!证明
J
K
EDC
催化
穿心莲内酯生物合成关键步骤脱水穿心莲内酯在
整个生长期含量较低!差异变化不明显
B+D
!
穿心莲内酯生物合成上游基因的表达检测
穿心莲内酯含量可以被茉莉酸甲酯"
I91J
#诱
J+
叶片注射法浸染
3
叶期的穿心莲&
\+
沉默
$
%
&(
基因
#*?
后的
植株&
E+
叶片中
$
%
&(
基因表达的
FW(DEF
分析&
]+
叶片中
$
%
&(
基因表达的
:
FW(DEF
分析图中的
WF@
表示浸染
K
WF@!
的空白对照植株!
J
K
EDC(U-
=
.
表示浸染
K
WF@!(0&(
的植株
图
#
!
@ABC
法沉默穿心莲
$
%
&(
基因
J+J
=
TN-/S-7RT6R-N/NS$?
%
3"57893#36R3(796S.R6
=
9<-R8796S
-/
,
9;R-N/
&
\+D76/R<-R8$
%
&(
=
9/9.-79/;-/
=
SNT#*?6
V
.
&
E+FW(DEF6/67
V
.-.NS$
%
&(9Y
K
T9..-N/-/R89796U9.
-/S-7RT6R9?
&
]+
:
FW(DEF6/67
V
.-.NS$
%
&(9Y
K
T9..-N/
-/R89796U9.-/S-7RT6R9?+W8976X97.6T9?9.-
=
/6R9?
$
WF@
!
K
76/R.-/S-7RT6R9?<-R8
K
WF@!6.6;N/RTN7
&
J
K
EDC(U-
=
.
!
K
76/R.-/S-7RT6R9?<-R8
K
WF@!(0&(
O-
=
+#
!
$
%
&(
=
9/9.-79/;-/
=
-/$?
%
3"57893#3<-R8@ABC
J+3
叶期及浸染生长
#*?
后穿心莲内酯含量&
\+
穿心莲内酯的相对积累量图中的
WF@
表示浸染
K
WF@!
的空白对照植株!
J
K
EDC(U-
=
.
表示浸染
K
WF@!(0&(

""
表示和对照有显著性差异"

#
"+"#
#的植株
图
!
!
@ABC
处理穿心莲后穿心莲内酯的积累
J+J/?TN
=
T6
K
8N7-?9.;N/R9/R-/3(796S.R6
=
9
!
WF@6/?$
%
&((U-
=
.796U9.
&
\+F976R-U96;;>5>76R-N/NS6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.
-/WF@6/?$
%
&((U-
=
.796U9.+W8976X97.6T9?9.-
=
/6R9?
$
WF@
!
K
76/R.-/S-7RT6R9?<-R8
K
WF@!6.6;N/RTN7
&
J
K
EDC(U-
=
.
!
K
76/R.-/S-7RT6R9?<-R8
K
WF@!(0&(+
""
-/?-;6R9.R89.-
=
/-S-;6/R?-SS9T9/;9STN5R89;N/RTN7
"

#
"+"#
#
O-
=
+!
!
J/?TN
=
T6
K
8N7-?9.6;;>5>76R-N/-/$?
%
3"57893#3<-R8@ABCRT96R59/R
"!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
%
!
$
%
&(
上游基因在
I91J
诱导"
J
#和
@ABC
处理后"
#的定量
DEF
分析
O-
=
+%
!:
FW(DEF6/67
V
.-.NS>
K
.RT965
=
9/9.NS
$
%
&(-/R89796U9.-/?>;9?X
V
I91J
"
J
#
6/?RT96R9?R8TN>
=
8@ABC
"
#
导增加)#0*!
$
%
&(
基因表达也能够被
I91J
诱
导)##*为了分析穿心莲内酯生物合成上游基因是
否与
$
%
&(
具有相同表达模式!对穿心莲
I@J
途径中的
*+),
(
I4D
途径中的
-.(
以及生成
J
K
EDC
催化底物
BBDD
的
))(
基因进行了
:
FW(DEF
分析结果"图
%
!
J
#显示!
I91J
处理穿
心莲后!
$
%
&(
在
#!8
被诱导表达量达到最大!
*+),
(
-.(
(
))(
在
$8
分别被诱导上调了
0+"3
(
%+%#
和
*+3"
倍!除了
*+),
在
#!8
持续被
诱导表达外!
-.(
和
))(
在
#!8
已恢复到正常
表达水平病毒诱导
$
%
&(
基因沉默后!
*+),
和
-.(
的表达没有受到影响!但
))(
的表达下
调了
$)+%$c
"图
%
!
#!暗示穿心莲内酯生物合成
中有负反馈调节机制的存在
%
!
讨
!
论
本研究使用
@ABC
法成功沉默了穿心莲叶片中
$
%
&(
的基因表达!通过
GDHE
法检测到穿心莲
内酯积累量明显下降!证明
$
%
&(
在植物体内参
与穿心莲内酯生物合成!符合以往的生化研究)##*
同时
$
%
&(
基因沉默后!穿心莲植株并未有表型
变化!显示赤霉素代谢未受到影响
在
$
%
&(
被
I91J
诱 导 上 调 后!上 游 的
*+),
(
-.(
和
))(
也被诱导上调!并且诱导时
间早于
$
%
&(
!表明
I91J
能够广泛调控穿心莲
萜类代谢相关基因表达!和以往研究中
I91J
诱导
穿心莲悬浮细胞穿心莲内酯积累的结果一致)#0*
I91J
处理能引起植物的抗病反应)!"*!本研究中
I91J
诱导穿心莲
I@J
途径的
*+),
上调水平
明显大于
I4D
途径的
-.(
!推测
I@J
途径增加
的法尼基焦磷酸用来参与甾醇生物合成!改变细胞
膜结构去抵抗
I91J
模拟的病原菌浸染
$
%
&(
被沉默后!
))(
的基因表达显著降低!可能是
J
K
EDC
催化底物
BBDD
的积累负反馈调节上游基
因
))(
的表达!但早期的
*+),
(
-.(
并没有受
到影响!暗示穿心莲内酯生物合成调控主要集中在
))(
和
$
%
&(
这两个基因然而
$
%
&(
沉默
后其下游基因的表达情况!以及与其它萜类代谢流
之间的相互作用仍不清楚!需要进一步的研究
大多数的药用植物的遗传转化技术发展都比较
滞后!使用
@ABC
技术鉴定重要药用成分的生物合
成基因功能是一个可靠便捷的方法然而
@ABC
技
术由于病毒载体的局限性!能用于此方法的植物仍
有限!即使对于现在常用的表达稳定(沉默效果好(
对植物毒副作用小的
WF@
病毒载体适用范围也是
较低的!所以获得适用范围广的病毒载体是急需解
决的问题)!#*另外作者在实验中尝试过不同的农
杆菌浸染方法!最后用针尖刺伤叶片后再用无针头
注射器注射农杆菌的沉默效果最好!并且注射
3
叶
期之前的幼苗存活率较低!表明针对不同植物应当
筛选最佳的侵染时期和方法
参考文献!
)
#
*
!
国家药典委员会
+
中华人民共和国药典"一部#)
C
*
+
北京$中国
医药科技出版社!
"#*
$
!$3+
)
!
*
!
韩
!
光!杜钢军!许启泰
+
穿心莲二萜内酯类化合物的合成及抗
肿瘤构效关系研究)
1
*
+
中国药学杂志!
""3
!
ED
"
#"
#$
&0"(&0)+
!!!
GJLB
!
]MB1
!
bM2W+CR>?-9.N/.
V
/R89.-.6/?6/R-R>5NT
.RT>;R>T9(6;R-U-R
V
T976R-N/.8-
K
NS?-R9T
K
9/976;RN/9.NS$"/01
2
@
03
%
456
%
3""57893#3 L99.
)
1
*
?&45"!6!430=37!8#57396A180@
"39
!
""3
!
ED
"
#"
#$
&0"(&0)+
)
%
*
!
张丹丹!陈娟娟!方建国!等
+
穿心莲抗人巨细胞病毒的体外实
#!
#
期
!!!!!!!!
谌琴琴!等$病毒诱导基因沉默鉴定穿心莲内酯生物合成关键酶
J
K
EDC
功能
验研究)
1
*
+
医药导报!
"#"
!
BK
"
$
#$
&"%(&"&+
!!!
gGJLB]]
!
EG4L11
!
OJLB1B
!
#39+J/R-(;
V
RN59
=
67NU(
-T>.9SS9;RNS6/?TN
=
T6
K
8-.
K
6/-;>76R65":5#01
)
1
*
+*!039/1
B
+!/575"!
!
"#"
!
BK
"
$
#$
&"%(&"&+
)*
!
平
!
静!王思源!谢
!
宁!等
+
穿心莲内酯磺化物体外抗腺病毒药
效学研究)
1
*
+
中国实验方剂学杂志!
"#!
!
AL
"
!#
#$
#&*(#&3+
!!!
DALB1
!
QJLBCP
!
bA4L
!
#39+J.R>?
V
NS6/R-(6?9/NU-T>.
9SS9;RNS6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.>7SN/6R9?5":5#01
)
1
*
+&45"!6!A180@
"391
B
CD
%
!05=!"#39E03/5#51"39+!/5739F1=893!
!
!"#!
!
AL
"
!#
#$
#&*(#&3+
)
*
*
!
江冬青!罗晓红!谢智颖!等
+
穿心莲临床药理研究概况)
1
*
+
国
际中医中药杂志!
"#%
!
DM
"
##
#$
#"%"(#"%!+
!!!
1AJLB]2
!
HM` b G
!
bA4gG P
!
#39+`U9TU-9K
86T56;N7N
=V
NS$"/01
2
03
%
456
%
3"57893#3
)
1
*
+G"#!0"3#51"39A180@
"391
B
E03/5#51"39&45"!6!+!/575"!
!
"#%
!
DM
"
##
#$
#"%"(#"%!+
)
$
*
!
郗砚彬!巢志茂!魏少荫!等
+
穿心莲中半日花烷型二萜内酯化
学成分和药理活性研究进展)
1
*
+
国际中医中药杂志!
!""&
!
BK
"
!
#$
#""(#"%+
!!!
bAP!
EGJ` gI
!
Q4ACP
!
#39+F9.96T;8
K
TN
=
T9..76X?6/9
?-R9
K
9/976;RN/96/?
K
86T56;N7N
=
-;676;R-U-R
V
-/$"/01
2
03
%
456
%
3"@
57893#3
"
\>T5+S+
#
L99.
)
1
*
+G"#!0"3#51"39A180"391
B
E03/5#51"39
&45"!6!+!/575"!
!
""&
!
BK
"
!
#$
#""(#"%+
)
&
*
!
@FJL` @J4
!
E` IJL]
!
BFMACC4I Q+L9RV
.-.
NSR89I@J6/?I4D
K
6R8<6
V
.SNT-.N(
K
T9/N-?.
V
/R89.-.
)
1
*
+
$""839,!:5!H1
B
93"#<5191
2I
!
"#%
!
$)
$
$*(&""+
)
3
*
!
EG4LO
!
WG H`H]
!
\` GHIJLL1
!
#39+W89S65-7
V
NSR9T(
K
9/9.
V
/R86.9.-/
K
76/R.
$
65-?(.-Z9S65-7
V
NS
=
9/9.SNT.
K
9;-67(
-Z9?59R6XN7-.5R86R-.8-
=
87
V
?-U9T.-S-9?R8TN>
=
8N>RR89[-/
=
(
?N5
)
1
*
+E4!93"#A180"39
!
"##
!
NN
"
#
#$
!#!(!!0+
)
0
*
!
WG H`H]+W9T
K
9/9.
V
/R86.9.6/?R89T9
=
>76R-N/
!
?-U9T.-R
V
6/?
X-N7N
=
-;67TN79.NSR9T
K
9/959R6XN7-.5
)
1
*
+&800!"#J
%
5"51"5"
93"#<5191
2I
!
""$
!
K
"
%
#$
!0&(%")+
)
#"
*
!
姚
!
攀!陈慧芝!李竹君!等
+
穿心莲
9/R(
柯巴基焦磷酸合酶基因的
克隆与生物信息学分析)
1
*
+
生物技术通报!
"#!
!
#"
$
#*$(#$!+
!!!
PJ` D
!
EG4LGg
!
HAg1
!
#39+E7N/-/
=
6/?X-N-/SNT56R-;
6/67
V
.-.NS6;]LJ9/;N?-/
=
6
K
>R6R-U99/R(;N
K
67
V
7?-
K
8N.(
K
86R9.
V
/R86.9STN5 $"/01
2
03
%
456
%
3"57893#3
"
\>T5+S+
#
L99.
)
1
*
+<51#!74"191
2I
<899!#5"
!
"#!
!
#"
$
#*$(#$!+
)
##
*
!
CG4L22
!
HAHb
!
1AJLBP
!
#39+O>/;R-N/67;86T6;R9T-Z6(
R-N/NS!"#(;N
K
67
V
7?-
K
8N.
K
86R9.
V
/R86.9STN5$"/01
2
03
%
456
%
3"57893#3<-R8
K
>R6R-U9-/UN7U959/R-/6/?TN
=
T6
K
8N7-?9.X-(
N.
V
/R89.-.
)
1
*
+<51#!74"191
2I
K!##!06
!
!"#*
!
]` A
$
#"+#""&
%
.#"*!0("#*(#0$#(&
"
N/7-/9
#
+
)
#!
*
!
OJLWALA4
!
OJHE` L4B
!
OFMCEAJLW4C
!
#39+]-..9;R-N/NS
RN56RN7
V
;N
K
9/9X-N.
V
/R89.-.R8TN>
=
8U-T>.(-/?>;9?
=
9/9.-79/;-/
=
)
1
*
+93"#4
I
65191
2I
!
"#%
!
AND
"
!
#$
03$(003+
)
#%
*
!
朱
!
峰!张
!
萍!林宏辉!等
+
本生烟
LM($和
LM($+E
基
因的克隆及
@ABC
表达载体构建)
1
*
+
四川大学学报!
!"#!
!
EK
"
!
#$
)*%()*3+
!!!
gGMO
!
gGJLBD
!
HAL G G
!
#39+EN/.RT>;R-N/NS@ABC
9Y
K
T9..-N/U9;RNT;6TT
V
-/
=
LM($=
9/9.
;7N/9?STN5L571#53"3M!"#43=53"3
)
1
*
+A180"391
B
(57483"
N"5:!065#
I
!
"#!
!
EK
"
!
#$
)*%()*3+
)
#)
*
!
CALBGJ_
!
]QA@4]A@
!
FJAJ
!
#39+@-T>.(-/?>;9?
=
9/9
.-79/;-/
=
NSO5#43"5361="5
B
!03.
:
>679/9.
V
/R86.9/9
=
6R-U97
V
T9
=
>76R9..R9TN76/??9S9/;9(T976R9?
=
9/9.T9.>7R-/
=
-/T9?>;9?
<-R86/N7-?9.6/?X-NR-;.RT9..RN79T6/;9
)
1
*
+93"#<51#!74"19@
1
2I
A180"39
!
"#*
!
AD
"
%
#$
#(#%+
)
#*
*
!
HAF
!
F44]]Q
!
HAM4
!
#39+O>/;R-N/67
=
9/N5-;6/67
V
.-.
NS67[67N-?X-N.
V
/R89.-.-/*
I
167
I
3=86"5
2
!0T9U967.6;
V
RN(
;8TN59D
)*"
-/UN7U9?-/7-RRNT-/9T96TT6/
=
959/R
)
1
*
+&4!=56#0
I
<5191
2I
!
""$
!
AD
"
*
#$
*#%(*!"+
)
#$
*
!
谌琴琴!李丽霞!战鹏林!等
+
穿心莲八氢番茄红素脱氢酶
J
K
(
D]C
的基因克隆及功能鉴定)
1
*
+
中国中药杂志!
!"#*
!
EO
"
#0
#$
%&$"(%&$*+
!!!
CG4L22
!
HAHb
!
gGJLDH
!
#39+E7N/-/
=
6/?S>/;R-N/67
;86T6;R9T-Z6R-N/NS
K
8
V
RN9/9 ?9.6R>T6.9-/ $"/01
2
03
%
456
%
3"57893#3
"
\>T5+S+
#)
1
*
+&45"3A180"391
B
&45"!6!+3#!053
+!/573
!
"#*
!
EO
"
#0
#$
%&$"(%&$*+
)
#&
*
!
DG H`DGJLJL
!
FJLB_J]AH` _ L
!
CJ4GML1
!
#39+
E86/
=
9.-/R89;N/R9/R.NSSN>T6;R-U9?-R9T
K
9/N-?.6R?-SS9T9/R
=
TN=
9.-/$"/01
2
03
%
456
%
3"57893#3
"
\>T5+S+
#
L99.
"
E8>6/Y-/7-6/
#)
1
*
?&45"!6!+!/575"!
!
"#%
!
L
"
#
#$
!(#!+
)
#3
*
!
郭山山!卫莹芳!闫
!
婕!等
+
全国不同产地及不同部位穿心莲
中总内酯的含量测定)
1
*
+
时珍国医国药!
!"#"
!
BA
"
##
#$
!&0&(!&00+
!!!
BM` CC
!
Q4APO
!
PJL1
!
#39+]9R9T5-/6R-N/NSRNR6776;(
RN/9.-/?-SS9T9/R6T96.6/?
K
6TR.NS6/?TN
=
T6
K
8-.
)
1
*
+K564@
5P4!"+!/575"!3"/+3#!053+!/573,!6!3074
!
"#"
!
BA
"
##
#$
!&0&(!&00+
)
#0
*
!
CGJFIJCL
!
1GJg
!
CALGJF_
!
#39+16.5N/6R9(-/(
?>;9?X-N.
V
/R89.-.NS6/?TN
=
T6
K
8N7-?9-/$"/01
2
03
%
456
%
3"@
57893#3
)
1
*
+4
I
65191
2
5393"#308=
!
"#*
!
AMD
"
!
#$
!!#(!!0+
)
!"
*
!
IJFWAL4gAI
!
EGFACD44HCI1+B9/N5-;6/67
V
.-.NS
R89>/SN7?9?
K
TNR9-/T9.
K
N/.9-/$03M5/1
%
656.8N<.-R.;N/(
/9;R-N/RN-5
K
NTR6/R;97>76T
K
TN;9..9.
)
1
*
+E4!93"#&!99
!
!""%
!
AM
"
!
#$
*$#(*&$+
)
!#
*
!
_MIJF1
!
BMLJDJWAC
!
_MIJF1
!
#39+@-T>.(-/?>;9?
=
9/9.-79/;-/
=
>.-/
=
65N?-S-9?X9R6.6R97-R9
$
6
K
NR9/R-67;6/?-(
?6R9SNTS>/;R-N/67
=
9/N5-;.NS;TN
K
.
)
1
*
+$0745:!61
B
Q50191@
2I
!
"#)
!
AMK
"
3
#$
!#"0(!##%+
!编辑#宋亚珍"
!!
!!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷