全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 21 期 2014 年 11 月

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不同生长期穿心莲活性成分及关键酶基因差异表达研究
陈 娟，谷 巍*，段金廒*，宿树兰，邵 婧，孙红梅，耿 超
南京中医药大学药学院，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程
研究中心，江苏 南京 210023
摘 要：目的 对主产地广东遂溪、福建漳浦及引种栽培地区江苏南京、淮安的不同生长期穿心莲 Andrographis paniculata 活性成
分及关键酶基因表达情况进行分析，研究穿心莲活性成分积累动态，探讨其最佳采收期及分子机制。方法 用 HPLC 法测定穿心
莲内酯及脱水穿心莲内酯量，并用实时荧光定量 PCR 技术从 mRNA 水平比较研究不同生长期穿心莲关键酶 ent-柯巴基焦磷酸合
酶（CPS）基因的表达情况。结果 不同产地穿心莲生长过程基本一致，在营养生长时期生长迅速，进入生殖生长后生长趋于平
缓。4 个产地穿心莲样品中活性成分变化趋势相近，穿心莲内酯量均在始花期达到最高，脱水穿心莲内酯量变化较平缓；穿心莲
CPS 基因的相对表达量在蕾期至始花期相对较高，与穿心莲内酯量呈显著正相关。4 个产地穿心莲的穿心莲内酯与脱水穿心莲内
酯之和均达到《中国药典》2010 年版标准。结论 穿心莲最佳采收期应以物候期为评判依据，其最佳采收期为始花期。
关键词：穿心莲；穿心莲内酯；脱水穿心莲内酯；ent-柯巴基焦磷酸合酶；实时荧光定量 PCR
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)21- 3149 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.21.020
Study on active components of Andrographis paniculata at various growth periods
and differential expression of key enzyme gene
CHEN Juan, GU Wei, DUAN Jin-ao, SU Shu-lan, SHAO Jing, SUN Hong-mei, GENG Chao
Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, National and Local Collaborative
Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, College of Pharmacy,
Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
Abstract: Objective To study the dynamic changes of the active components from Andrographis paniculata at various growth periods
grown in Suixi in Guangdong province, Zhangpu in Fujian province as well as introduced and cultivated in Nanjing and Huaian in
Jiangsu province, and to investigate the expression level of the key enzyme gene at the same time in order to obtain the accumulation trend
of the active contents from A. paniculata and explore a reasonable harvest and its molecular mechanism. Methods The contents of
andrographolide and dehydroandrographolide were analyzed by HPLC. The expression of key enzyme gene, ent-copalyl diphosphate
synthase (CPS) was measured at mRNA level with QRT-PCR. Results The growth periods of A. paniculata were similar in different
areas. It grew fast at vegetative stage while slowly at reproductive stage. The contents of active ingredients in A. paniculata from four areas
showed the same change tendency. The content of andrographolide reached the highest level at flowering period. At the same time, the
changes of dehydroandrographolide was flatting out. The expression of CPS reached its maximum at bud to flowering period. There was a
significant positive correlation between the content of andrographolide and the expression of CPS. Conclusion The optimal harvest time
of A. paniculata should be judged on phenological period and the best harvest period is flowering period.
Key words: Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees; andrographolide; dehydroandrographolide; ent-copalyl diphosphate synthase;
real-time quantitative PCR

穿心莲为爵床科植物穿心莲 Andrographis
paniculata (Burm. f.) Nees 的全草，有“天然抗生素”
之称[1]，原产印度、斯里兰卡等国，我国于 20 世纪
70 年代在广东、福建一带大量引种栽培[2]。穿心莲的
活性成分主要是穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯[3]，
为二萜内酯类化合物，具有清热解毒、凉血消肿之功

收稿日期：2014-06-16
基金项目：国家“十二五”科技支撑项目（2012BAI29B02）；江苏省青蓝工程（2012）；江苏省中药优势学科 II 期建设（ysxk-2014）；国家自
然基金重点项目中药道地性及其形成的环境机制研究（81130070）；道地药材国家重点实验室培育基地建设项目
作者简介：陈 娟，硕士研究生，研究方向为分子生药学、药用植物生理生态学。Tel: 18905239948 E-mail: juanchen29@126.com
*通信作者 谷 巍，教授。 Tel: 13951879869 E-mail: guwei9926@126.com
段金廒，教授。 E-mail: DUANJA@163.com
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效[4]。ent-柯巴基焦磷酸合酶（ent-copalyl diphosphate
synthase，CPS）是穿心莲二萜化合物合成途径中的
重要调控位点[5]，其表达水平决定了下游萜类化合
物的组成和质量分数[6]。随着抗生素滥用及不良反
应的增加，穿心莲作为中药抗生素，需求量不断增
加，引种范围不断扩大，由于各引种地区采收期标
准不一，其质量存在很大差异，对药材的品质、产
量以及资源的合理保护与开发利用都有着影响。本
实验对主产地广东遂溪、福建漳浦及引种栽培地区
江苏南京、淮安的不同生长期穿心莲活性成分积累
动态及关键酶基因表达情况结合物候期进行分析，
研究不同环境生态条件下穿心莲最佳采收期及其分
子机制，为穿心莲的规范化生产、合理采收和质量
控制提供科学指导。
1 材料
1.1 样品
实验地点设在穿心莲主产地广东遂溪（穿心莲
GAP 基地）、福建漳浦及引种地江苏南京及淮安，
引种地穿心莲种子来源于广西贵港，按照 GAP 管
理制度进行种植管理。样品由南京中医药大学谷巍
教授鉴定为穿心莲 Andrographis paniculata (Burm.
f.) Nees。在 7～10 月分别于穿心莲叶期、蕾期、始
花期、盛花期、果期[7]不同生长期采集样品，分析
其不同生长期药效成分的量；另采收部分新鲜样品
保存于液氮（−196 ℃）中，备用，以分析其 CPS
基因表达量。
1.2 仪器与试药
Agilent 2695 高效液相色谱仪；Light Cycler 480
荧光定量 PCR 仪（Roche 公司）；Allegra 21R 台式
高速冷冻离心机；Hofer ΜV—25 紫外透射仪。
脱水穿心莲内酯（批号 110854-201308）、穿心
莲内酯（批号 110797-201108）对照品均由中国食
品药品检定研究院提供；TRlzol Reagent（Ambion
公司）；RT mix（Vazyme 公司）；qPCR Master Mix
（TaKaRa 公司）；DEPC（Sigma 公司）；SDS（Amresco
公司）；Agarose（上海基因公司）；甲醇（色谱纯）；
其余试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 不同生长期穿心莲生长特性[8]
在引种地区江苏南京，根据穿心莲的生长情况，
于穿心莲各生长期采集样品，采摘后 2 h 内分别测定
样品鲜质量、株高、叶片数、分叉数，取其平均值。
采用《中国药典》2010 年版方法测定植株含水量。
2.2 穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的测定[3]
2.2.1 色谱条件 C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5
μm），甲醇-水（60∶40）为流动相，体积流量 0.8
mL/min，柱温 25 ℃；检测波长 226 nm（用于检测
穿心莲内酯），254 nm（用于检测脱水穿心莲内酯），
进样量 10 μL，色谱图见图 1。
2.2.2 对照品溶液的制备 分别称取穿心莲内酯和
脱水穿心莲内酯对照品适量，用甲醇配制成 0.2
mg/mL 的混合对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 将穿心莲样品干燥粉
碎，过 40 目筛，称取 0.2 g 样品，加甲醇 5 mL 超
声提取 0.5 h，用甲醇补足质量，摇匀，过 0.45 μm
滤膜，取续滤液，即得。


A1 (B1)-226 nm A2 (B2)-254 nm 1-穿心莲内酯 2-脱水穿心莲内酯
A1 (B1)-226 nm A2 (B2)-254 nm 1-andrographolide 2-dehydroandrographolide
图 1 对照品 (A) 和样品 (B) 的 HPLC 色谱图
Fig. 1 HPLC chromatogram of reference substances (A) and samples (B)
4.0 8.0 12.0 16.0 20.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0
A1 B1
2
2
A2
1
2
B2
1
2
t / min



1 1
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2.2.4 样品测定 分别吸取对照品溶液 10 μL，供
试品溶液 10 μL，进样，按外标法测定穿心莲内酯
和脱水穿心莲内酯的量。
2.3 实时荧光定量 PCR[9]
2.3.1 RNA 提取和 cDNA 合成 在引种地区江苏南
京，于穿心莲各生长期收集叶片保存于液氮中。RNA
提取按照 TIANGEN 公司总 RNA 提取试剂盒操作步
骤进行，取 2 μg 总 RNA 以 Oligo dT18 为引物进行反
转录。反转录采用 2 步进行：第 1 步，4×gDNA wiper
Mix 2 μL，模板（RNA）250 ng，加 RNase free ddH2O
至 10 μL，混匀，42 ℃，2 min；第 2 步，5×qRT
SuperMixll 2 μL，第 1 步反应液 8 μL。反应条件：25
℃，10 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min。
2.3.2 荧光定量 PCR 采用实时荧光定量 PCR 仪，
以 β-actin 为内参基因，检测样品中 CPS 基因的相
对表达量。以不同生长期穿心莲叶片 cDNA 为模板，
运用设计的引物进行 PCR 扩增，actin-F 和 actin-R
及 QRT-PCR 引物见表 1。QRT-PCR 反应体系：cDNA
2 μL，引物各 0.4 μL，4×qPCR Master Mix 10 μL，
ddH2O 7.2 μL，总体积 20 μL。PCR 反应结束后分析
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物名称 引物序列
CPS-F CACCATCTCCGCCTGTCT
CPS-R ACCACCACTCACGCCACT
actin-F TTCACCACTACAGCAGAGCG
actin-R AAGGACCTCAGGGCATCG
荧光值变化曲线以及融解曲线。
2.4 相关性分析
使用 SPSS软件对不同生长期穿心莲中CPS 基因
表达量与药效成分穿心莲内酯的量进行相关性分析。
3 结果与分析
3.1 穿心莲不同生长期生物量变化
4 个产地穿心莲的物候期有所差异，江苏淮安的
穿心莲其生长期相对较长，于 9 月中旬出现花蕾，果
实成熟期相对较晚（10 月下旬），其茎较长，质脆，
生物量相对较高；广东的穿心莲一般于 8 月底出现花
蕾；福建的在 9 月下旬结果。表 2 为引种地江苏南京
的穿心莲不同生长期的生物量变化，穿心莲幼苗生长
缓慢，在 6～8 月，其株高增长较快，叶片数快速增
多，生长较快，为快速生长期。在 8 月中旬，穿心莲
出现花蕾，此后，植株生长缓慢，进入生殖生长期。
3.2 穿心莲不同生长期穿心莲内酯和脱水穿心莲
内酯的变化
4 个产地穿心莲不同生长期的穿心莲内酯量变
化趋势一致，其量均在始花期前快速增长，到始花
期达到最大值，此后呈下降趋势。南京、淮安、遂
溪、漳浦样品中，始花期穿心莲内酯量比叶期分别
高了 30.16%、20.06%、24.36%、19.04%，见表 3。
4 个产地样品中脱水穿心莲内酯在不同生长期
变化较平缓（表 4），其量总体为下降趋势。
3.3 穿心莲不同生长期 CPS mRNA 表达分析
实验结果显示，穿心莲 CPS 基因的相对表达量
在穿心莲蕾期前呈快速上升趋势，在蕾期至始花期
趋于平缓，之后缓慢下降（图 2）。
表 2 南京产穿心莲不同生长期生物量
Table 2 Biomass of A. paniculata from Nanjing at different growth periods
采收期 株高 / cm 叶片数 / 片 分叉数 鲜质量 / (g·株−1) 含水量 / %
叶期 30.2±0.2 96±1 5±1 35.22±0.65 72.62±0.11
蕾期 46.0±0.3 118±1 9±1 59.29±0.84 79.96±0.11
始花期 51.5±0.4 129±1 11±1 63.08±0.42 72.80±0.08
盛花期 52.6±0.1 134±1 13±1 65.61±0.44 72.50±0.04
果期 52.8±0.2 126±1 13±1 66.30±0.03 68.08±0.05

表 3 不同产地不同生长期穿心莲中穿心莲内酯的量
Table 3 Contents of andrographolide in A. paniculata from different habitats at different growth periods
穿心莲内酯 / % 产地
叶期 蕾期 始花期 盛花期 果期
江苏南京 2.510±0.049 3.026±0.013 3.267±0.046 2.889±0.018 2.638±0.043
江苏淮安 2.770±0.022 3.137±0.012 3.381±0.042 3.054±0.015 2.190±0.033
广东遂溪 2.471±0.015 2.593±0.013 3.073±0.036 2.745±0.027 2.275±0.031
福建漳浦 2.658±0.011 2.753±0.019 3.164±0.007 2.708±0.027 2.420±0.057
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表 4 不同产地不同生长期穿心莲中脱水穿心莲内酯的量
Table 4 Contents of dehydroandrographolide in A. paniculata from different habitats at different growth periods
脱水穿心莲内酯 / % 产地
叶期 蕾期 始花期 盛花期 果期
江苏南京 0.286±0.002 0.265±0.002 0.225±0.004 0.192±0.003 0.165±0.004
江苏淮安 0.303±0.002 0.269±0.003 0.265±0.002 0.206±0.001 0.163±0.003
广东遂溪 0.281±0.001 0.256±0.002 0.231±0.004 0.224±0.002 0.154±0.002
福建漳浦 0.262±0.002 0.222±0.003 0.216±0.003 0.184±0.005 0.163±0.001


图 2 不同生长期穿心莲 CPS 基因表达量
Fig. 2 CPS expression on mRNA at different growth
periods of A. paniculata
3.4 相关性分析
使用 SPSS 统计软件对南京地区穿心莲样品中
穿心莲内酯量与 CPS 基因表达量进行相关性分析，
其相关性为 0.909（P＜0.05），表明 CPS 基因表达
量与穿心莲内酯量呈显著正相关。
4 讨论
不同生长环境、不同采收季节等因素都有可能
影响中药材成分量。中医药传统理论中以季节作为
中药材采收期依据缺乏对不同地区物候期的考虑，
本实验各产地穿心莲生长物候期不完全一致，各地
栽培环境条件亦不相同，研究结果表明其最佳采收
期为始花期，最佳采收期的确定应以植物物候期作
为依据，与药材产量、活性成分量相结合。
中药材有效成分的形成与积累除受环境条件的
影响还受遗传因子的调控。焦磷酸香叶基香叶酯
（GGPP）环合形成 ent-焦磷酸古巴酯（ent-CDP）是
穿心莲内酯生物合成的关键步骤，而催化这步反应
的 CPS 是穿心莲内酯类成分合成的关键限速酶[5]，
对 CPS 基因不同生长期表达量与穿心莲内酯量积
累动态的相关性分析进一步证实了 CPS 基因是穿
心莲内酯类成分合成途径中的重要调控点，也为最
佳采收期的确定提供分子水平的佐证。CPS 基因在
蕾期前快速增长，表明这段时期为穿心莲生长旺盛
期，也是次生代谢产物合成的高峰期；开花后 CPS
基因 mRNA 表达水平下降，这可能是穿心莲植株
趋于衰老、代谢能力衰退所致[10]。
《中国药典》2010 年版穿心莲活性成分标准为
穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯之和不得低于 0.8%。
本实验所有样品中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯之
和均达到标准，引种地江苏南京及江苏淮安穿心莲
活性成分量也均高于《中国药典》2010 年版规定，
有效成分的积累动态与广东、福建基本一致，且生
物量也较高，表明穿心莲可以在江苏引种种植。
参考文献
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叶期 蕾期 始花期 盛花期 果期
50
40
30
20
10
0
CP
S
基
因
表
达
量