全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)"!)"#
基金项目$西藏自然基金项目"
!"#&"#0
#&西藏特色农牧资源研发协同创新中心建设资助项目"
!"#&)!"#*
#
作者简介$袁
!
芳"
#01%(
#!硕士!讲师!主要从事药用植物分子生物学研究
2)34-5
$
6
7.434/894)"$
!
#$%+:;3
"
通信作者$兰小中!博士!教授!主要从事药用植物资源与开发利用
2)34-5
$
54/<-4;=9;/
>!
#$%+:;3
西藏八角莲与桃儿七根及根茎
$$%
文库的建立
袁
!
芳#!!甄梓娟#!徐元江#!兰小中#!"
"
#
西藏大学 农牧学院!西藏林芝
1$""""
&
!
西藏大学 农牧学院
)
西南大学药用植物联合研发中心!重庆
&""#*
#
摘
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要$以西藏八角莲"
!
"
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"
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#和桃儿七(
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-
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00(%/)1&*.2(%
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6
5A
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>
)为材料!
构建其根及根茎的
BBC
文库!从中筛选鬼臼类植物属种间与鬼臼毒素生物合成相关的差异表达基因从文库中
随机挑取
!"#
个阳性克隆测序后得到
#1%
条
2BD.
去除载体序列和冗余序列!聚类拼接得到
#
个西藏八角莲的
E/-
F
EA2BD.
经
GHIBD
同源比较和功能查寻!有功能注释的
E/-
F
EA2BD.
共
#!
个!占
"+$J
!所编码的蛋白涉
及光合作用*合成代谢*转录调控等功能&无功能注释和匹配结果的共
*
个!占
!0+&J
该研究成功构建了西藏八
角莲和桃儿七
BBC
文库!为进一步揭示鬼臼毒素生物合成途径及其调控机制奠定了基础
关键词$西藏八角莲&桃儿七&
BBC
文库&鬼臼毒素&
2BD
中图分类号$
K1*
文献标志码$
I
&"()*+,)#""-$+
..
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3
0*#!#41)#"5#0*1*
3
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2
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BBC
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F
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6
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BBC5-SQ4Q
6
&
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[
9
6
5)
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2BD
!!
鬼臼类植物隶属于小檗科"
GAQSAQ-R4:A4A
#!包
括八角莲属"
!
"
#$#%&V;;R.;/
#*足叶草"鬼臼#属
"
3$.$
-
/
"
00(% H+
#*桃儿七属"
,+*$
-
$.$
-
/
"
00(%
?-/
>
#和山荷叶属"
!+
-
/
"
00)+& W-:9<+
#
(
#)!
)
鬼臼
类植物是一类具有显著生物活性!又具有悠久应用
历史的药用植物中国汉代的+神农本草经,中就有
鬼臼的记载!在以后的本草典籍中亦多记载!鬼臼类
植物主要用于治疗蛇咬伤*痈疖肿毒*跌打*风湿筋
骨痛及气管炎等症(%)&)鬼臼类植物的活性成分主
要为木脂素类化合物!其中鬼臼毒素具有高效抗肿
瘤活性!已作为合成多种抗癌药物的前体物质(*)#")
由于过度采挖*生境破坏和植物自身生长缓慢
等原因!鬼臼类野生植物资源逐渐枯竭*物种濒危!
已难以满足鬼臼毒素生产的需求人工规范化栽培
势在必行!但目前桃儿七*八角莲的栽培刚刚起步!
其他来源植物的新资源开发也有待进一步深
入(##)#%)此外!虽然化学全合成技术已经有所突破!
但复杂的合成过程*极低的合成效率"约为
*+"J
#!
使人工全合成鬼臼毒素目前仍难以实现商业
化(#&)#*)近年来基于生物技术的植物代谢工程!为
鬼臼毒素替代资源的开发提供了更多途径!如植物
细胞或器官培养*生物转化等!但实现药用植物规范
化栽培和植物细胞或器官培养生产鬼臼毒素的前提
之一!是必须充分阐明鬼臼毒素的生物合成途径及
其调控机制目前!鬼臼毒素生物合成途径尚不十
分清楚!对合成途径中的中间产物*酶*限速步骤等
仍知之甚少(#$)#1)
就发现与某一性状相关基因的方法来讲!抑制
差减杂交"
BBC
#被认为是一种较为适合的技术!可
在转录水平上发现两材料间差异表达的基因自
#00$
年报道
BBC
的方法以来!已成功应用在多种
植物上!发现了多个与表型性状相关的功能基因!并
成功揭示了动植物中一些生命活动的分子机
理(#0)!%)本研究选用在鬼臼毒素含量上具显著差异
的西藏八角莲和桃儿七
!
种鬼臼类植物作为材料!
分别提取根及根茎的
3@MI
!以西藏八角莲材料的
:ZMI
作检测样品!桃儿七材料的
:ZMI
作参照样
品!构建
BBC
文库!测定和分析文库中的
2BD.
序
列从而发现西藏八角莲根及根茎优势表达的基因
以期为今后鬼臼毒素合成相关基因的确定*从分子
水平上探究鬼臼毒素生物合成机理以及功能基因辅
助鬼臼类药用植物品种的选育奠定基础
#
!
材料和方法
?+?
!
植物材料与处理
供试材料西藏八角莲*桃儿七采自西藏林芝市
米林县!为避免不同的遗传背景造成的假阳性!将植
株移栽至西藏大学农牧学院藏药材种质资源圃栽
培于
!"#&
年
#
月*
%
月*
*
月*
月和
0
月分别从
植物材料同一单株上采集根及根茎
#""
>
!置
(1"
_
冰箱保存备用
!
种植物不同月份采集的根及根
茎材料!分别等量混合后用于提取
@MI
?@A
!
$$%
文库的构建
西藏八角莲和桃儿七的根及根茎总
@MI
的提
取!采用
NQE-8)348A
DW
7;Q@MIXEQ-7-:48-;/
"
D4` 4)
@4
公司#和
@MI-.;X5E.
"
D4` 4@4
公司#进行总
@MI
经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测后
进行下一步
BBC
文库的构建工作双链
:ZMI
的
合成参照
BWI@DAQ
DW
X-:;XT@:ZMIB
6
/89A.-.
-`8
"
T5;/8A:9
公司#说明书完成以西藏八角莲的
:ZMI
为检测样品"
8A.8AQ
#!桃儿七的
:ZMI
为参照
样品"
RQ-UAQ
#!按
XT@)BA5A:8
DW
:ZMIBES8Q4:8-;/
-`8
"
T5;/8A:9
公司#的说明书进行抑制差减杂交
BBC
产物用
W-/-G2BDZMINQ4
>
3A/8XEQ-7-:4)
8-;/ -`8aAQ+&+"
"
D4` 4@4
公司#纯化后与
[
W)
ZDW#1)DaA:8;Q
连接过夜!转化大肠杆菌
ZC*
"
感受态细胞用含有氨苄青霉素的
HG
培养基除去
未能转化成功的大肠杆菌!采用蓝白斑筛选阳性克
隆挑取白色克隆摇培过夜后!经引物
MA.8ARXT@
[
Q-3AQ#
"
*b)DTcIcTccTTcTTTcccTIccD)
%b
#和
MA.8ARXT@
[
Q-3AQ!@
"
*b)IcTcDccDT)
cTccTTcIccD)%b
#扩增后进一步鉴定阳性克隆
?+B
!
阳性克隆测序及序列分析
随机选取文库中
!"#
个具有唯一扩增条带的阳
性克隆!经活化培养后!菌液用
W-/-G2BDX54.3-R
XEQ-7-:48-;/ -`8aAQ+&+"
"
D4` 4@4
公司#提取质粒
ZMI
!送上海瑞楚生物科技有限公司测序测序得
到的有效
2BD
序列经过
T;R;/:;RAI5-
>
/AQ&+"+&
软件的处理后!在
MTG"
988
[
$%%
]]]+/:S-+/53+
/-9+
>
;U
%
GHIBD
#上进行比对分析!并进行功能注
释和归类
!
!
结果与分析
A@?
!
总
8C<
的质量检测和抑制差减杂交效果分析
本研究中分别提取了西藏八角莲与桃儿七根及
根茎的
@MI
!
#J
琼脂糖凝胶电泳检测"图
#
#结
果显示总
@MI
样品的
!1B
*
#1B
和
*B
条带清晰!无
明显拖尾现象!说明提取的
@MI
完整性好!几乎无
降解用紫外分光光度计检测
@MI
的浓度和纯
度!结果表明!西藏八角莲和桃儿七
@MI
样品的
dZ
!$"
%
!1"
分别为
#+00
和
!+"!
!
dZ
!$"
%
!%"
分别为
!+""
和
!+"#
!
@MI
含量分别为
#+0"
和
#+$%
#
>
%
#
H
!说
1$&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
明提取的总
@MI
无降解!纯度较高!无多糖和蛋白
质污染!质量较好!符合建库要求
由图
!
可以看出!进行两轮杂交和两轮
XT@
以
后!富集了差异表达的基因!去除了共有的序列!因
此弥散的
:ZMI
片段数量减少!条带亮度降低!差
减以后
:ZMI
片段整体向下偏移说明差异表达
基因得到了有效地富集和扩增!富集的差异表达片
段集中在
&""
$
#"""S
[
小片段范围内
A@A
!
$$%
文库的
D&8
鉴定
经过
%_
培养箱倒置培养
!&9
和
&_
冰箱显
色
&9
后!
HG
琼脂平板上出现了明显的蓝色和白色
菌落!依据蓝白斑筛选的原理!对在含有氨苄青霉素
平板上白色的菌落进行筛选*确认和编号!共发现有
##0
个白色菌落和
#!
个蓝色菌落本实验得到
的文库重组率为
1+%J
!已达到构建文库的重组率
标准"
1"+"J
#
白色克隆经菌落
XT@
扩增后!扩增产物用
#J
琼脂糖凝胶电泳检测电泳图"图
%
#显示插入片段
呈随机分布!长度集中在
!*"
$
#*""S
[
之间!平均
大小在
*"S
[
左右有少数克隆无扩增条带!无扩
增条带的克隆将再次采用
XT@
扩增核实最后!确
W+ZH!"""
&
#+
西藏八角莲根及
根茎总
@MI
&
!+
桃儿七根及根茎总
@MI
图
#
!
总
@MI
凝胶电泳图
W+ZH!"""
&
#+D;845@MI;7Q;;84/RQ9-=;3A
7Q;3!
"
#$#%&#&
"
()*#+#
&
!+D;845@MI;7Q;;84/R
Q9-=;3A7Q;3,+*$
-
$.$
-
/
"
00(%/)1&*.2(%
"
@;
6
5A
#
?-/
>
+
N-
>
+#
!
25A:8Q;
[
9;QA.-.QA.E58.;78;845@MI
定出具有
#
个扩增条带的克隆共
0*#
个!这些克隆
所携带的
:ZMI
信息即为本研究所得的
:ZMI
基
因文库
A@B
!
E$F
测序分析
随机选取文库中
!"#
个阳性克隆进行测序!其
中
#1%
个测序成功!达到
0#J
2BD
序列在
T;R;)
/:;RAI5-
>
/AQ&+"+&
软件上分析!去除接头序列*载
体序列*信号模糊的片段和低质量序列片段!剩余
#*
条有效序列&聚类拼接得到
E/-
F
EA2BD.
共
#
个通过同源比对和功能查询!其中
%
个没有同源
匹配序列&
!
个为未知功能的假定蛋白!其余
#!
个
具有同源匹配序列
由表
#
可以看出!有同源匹配序列的
E/-
F
EA
2BD.
参与西藏八角莲植物体内的多种代谢反应!
其中次生代谢类序列的比例最大!达到
%%+%J
!其
次是能 量代 谢*转录 调控和 光合 作 用 类 序 列
"
#$+J
#!参与信号转导*防御反应等过程的序列相
对较少"
1+%J
#亚麻木脂素脱氢酶*
R-Q-
>
A/8
蛋
白*松脂酚
)
落叶松脂醇还原酶和羧基甲基转移酶是
W+ZH#"""
&
#+
差减样品第一轮
XT@
&
!+
未差减样品第一轮
XT@
&
%+
差减样品第二轮
XT@
&
+
未差减样品第二轮
XT@
图
!
!
抑制差减杂交效果的电泳检测
W+ZH#"""
&
#+N-Q.8XT@
[
Q;RE:8.;7.ES8Q4:8AR.43
[
5A
&
!+N-Q.8XT@
[
Q;RE:8.;7E/.ES8Q4:8AR.43
[
5A
&
%+BA:;/R4Q
6
XT@
[
Q;RE:8.;7.ES8Q4:8AR.43
[
5A
&
+BA:;/R4Q
6
XT@
[
Q;RE:8.;7E/.ES8Q4:8AR.43
[
5A
N-
>
+!
!
25A:8Q;
[
9;QA.-.RA8A:8-;/;7.E
[[
QA..-;/
.ES8Q4:8-UA9
6
SQ-R-=48-;/A77-:-A/:
6
W+ZH!"""
&
#
$
!&+BBC
文库中随机挑取的白色克隆
图
%
!
BBC
文库白色克隆的
XT@
扩增产物电泳图
W+ZH!"""
&
#(!&+@4/R;35
6[
-:^AR]9-8A:5;/A.7Q;389ABBC5-SQ4Q
6
N-
>
+%
!
25A:8Q;
[
9;QA.-.7;QXT@
[
Q;RE:8.;789A
[
4Q8-45
6
.:QAA/AR]9-8A:5;/A.7Q;389ABBC5-SQ4Q
6
0$&
%
期
!!!!!!!!!!!
袁
!
芳!等$西藏八角莲与桃儿七根及根茎
BBC
文库的建立
表
?
!
$$%
文库中部分
+#
G
+/E$F(
生物信息学分析结果
D4S5A#
!
G-;-/7;Q348-:.4/45
6
.-.7;Q47A]E/-
F
EA2BD.7Q;389ABBC:ZMI5-SQ4Q
6
2BD
编号
2BDM;+
同源基因片段编码的蛋白"生物种#
cA/A
[
Q;RE:8;7ZMI9;3;5;
>6
"
B
[
A:-A.
#
期望值
2)U45EA
功能分类
NE/:8-;/45:54..-7-:48-;/
#
亚麻木 脂 素 脱 氢 酶 "桃 儿 七#
BA:;-.;54Q-:-QA.-/;5RA9
6
RQ;
>
A/4.A
(
,+*$
-
$.$
-
/
"
00(%/)1&*.2(%
"
@;
6
5A
#
?-/
>
)
*A)0&
次生代谢
BA:;/R4Q
6
3A84S;5-.3
&
MIZC
脱氢酶亚基
N
基因&叶绿体"山荷叶属#
MIZCRA9
6
RQ;
>
A/4.A.ESE/-8N
>
A/A
&
:95;Q;
[
54.8
"
!+
-
/
"
00)+&4
"
%$#&
#
1A)#&
能量代谢
2/AQ
>6
3A84S;5-.3
*
受体信号蛋白丝氨酸%苏氨酸激酶"拟南芥#
@A:A
[
8;Q.-
>
/45-/
>[
Q;8A-/.AQ-/A
%
89QA;/-/A -^/4.A
"
52&6
7+.$
-
#+#/&0+&*&
#
&A)#%$
信号转导
B-
>
/458Q4/.RE:8-;/
W?G
转录因子"桃儿七#
W?G8Q4/.:Q-
[
8-;/74:8;Q
(
,+*$
-
$.$
-
/
"
00(%/)1&*.2(%
"
@;
6
5A
#
?-/
>
)
#A)&
转录
DQ4/.:Q-
[
8-;/
1 Z-Q-
>
A/8
蛋白"拟南芥#
Z-Q-
>
A/8
[
Q;8A-/
"
52&7+.$
-
#+#/&0+&*&
#
&A)#0
次生代谢
BA:;/R4Q
6
3A84S;5-.3
0
松脂酚
)
落叶松脂醇还原酶"亚麻属#
X-/;QA.-/;5)54Q-:-QA.-/;5QARE:84.A
"
8+*(%&07(%
#
!A)$0
次生代谢
BA:;/R4Q
6
3A84S;5-.3
#"
羧基甲基转移酶"拟南芥#
T4QS;<
6
53A89
6
58Q4/.7AQ4.A
"
52&7+.$
-
#+#/&0+&*&
#
%A)!
次生代谢
BA:;/R4Q
6
3A84S;5-.3
## #
!
*)
二磷酸核酮糖羧化酶"山荷叶属#
@-SE5;.A#
!
*)S-.
[
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合作用过程中光合电子传递和光合磷酸化所必需的
酶复合体的组分植物初生代谢通过光合作用*柠
檬酸循环等途径!为次生代谢提供能量和一些小分
子化合物原料
W?G
转录因子和
V@` ?
转录因
子参与植物的初生和次生代谢反应!在损伤*衰老*
发育*代谢物质调节等方面都起到了重要的作用
无功能注释和未匹配的
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F
EA2BD.
可能属于新的
功能基因!需进一步研究了解其可能的功能所有
这些
E/-
F
EA2BD.
可能与西藏八角莲与桃儿七根及
根茎的鬼臼毒素含量存在差异有关
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讨
!
论
西藏八角莲和桃儿七是国家三级保护植物!在
中国西藏东南部均有分布!其中西藏八角莲为西藏
特有的八角莲属植物种其植株内含量极微的具抗
肿瘤和抗病毒活性的鬼臼类木脂素!具有很高的药
用价值近年来的研究表明!桃儿七根及根茎的鬼
臼毒素含量在
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两者的鬼臼毒素含量相差较大!这与用
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法测定鬼臼毒素含量的溶液浓度和色谱条件
相关外!也表明鬼臼毒素合成能力在物种间与物种
内的变异*鬼臼毒素代谢对环境因子的响应与调控
机制等问题都值得进一步研究揭示
由于西藏八角莲的自然分布具有显著的地域局
限性!对其鬼臼毒素代谢途径的分子生物学研究较
桃儿七晚十余年至
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年
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月
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日!
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数据库中西藏八角莲只有
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序列达到
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异落叶松脂醇脱氢酶基因"
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)和松脂醇合成
酶基因"
Z8XB
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)被克隆外!其他众多功能基因尚未
被克隆鬼臼毒素来源植物遗传信息的匮乏是限制
鬼臼毒素生物合成途径及其调控机制研究的重要原
因构建
BBC
文库是发现差异表达基因!实施表达
序列标签"
2BD
#测序计划!进行功能基因研究较好
的方法!目前已成功应用于植物中差异表达基因的
研究
本研究首次成功构建了西藏八角莲与桃儿七根
及根茎
BBC
文库!获得西藏八角莲优势表达
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的克隆
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个随机挑选
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个克隆进行序列测定
和分析!聚类拼接得到
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共
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个!
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的
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F
EA2BD.
有同源匹配序列!新序列出
现的比例为
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所以!本研究的
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数目只
占
BBC
文库
2BD
总数的一小部分虽然部分测序
结果所获得的信息不够全面!但从这些有限的信息
里可以大致了解这
!
种鬼臼类药用植物根及根茎差
异表达基因的生物学功能及表达丰度!并为后续开
展西藏八角莲代谢途径功能基因的克隆和分析!以
及发掘影响鬼臼类药用植物鬼臼毒素合成能力的关
键因子奠定了基础
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参考文献!
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鬼臼类植物化学系统学和资源利用研究(
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国协和医科大学中国医学科学院!
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陈毓亨
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我国鬼臼类植物资源的研究(
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药学学报!
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