全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(5): 449-455(2012)
收稿日期: 2011-03-29; 修回日期: 2012-04-16
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项(200903049-07); 国家科技支撑计划项目(2009BADB8B01); 国家大宗蔬菜产业技术体系
(CARS-25-G-01); 北京市基金重大项目(6120001); 北京市农林科学院科技创新专项(KJCX201101010)
通讯作者: 柴敏,研究员,主要从事番茄遗传育种研究; Tel: 010-51503009, E-mail: chaimin@nercv. org
第一作者: 耿丽华,副研究员,主要从事蔬菜病害研究; Tel: 010-51503094, E-mail: genglihua@nercv. org。
番茄颈腐根腐病病原鉴定及不同条件对其生长的影响
耿丽华1, 李常保1, 迟胜起2, 王丽君2, 柴 敏1*
( 1北京市农林科学院蔬菜研究中心, 北京 100097; 2青岛农业大学农学与植保学院, 青岛 266109)
摘要:作者于 2007 年在北京郊区大棚内发现番茄(Lycopersicon esculentum Mill. )颈腐根腐病。 为了促进我国开展番茄颈
腐根腐病的防治研究和抗病品种培育工作,有效控制番茄颈腐根腐病的危害,采集表现典型症状的发病植株进行病原分
离、纯化,结合传统的形态学方法和 rDNA-ITS序列分析方法,并进行了该病原菌的适宜发病土壤温度测定和致病范围试
验,在此基础之上对病原菌进行了鉴定。 本论文还对该病原菌生长的影响条件进行了研究,确定该病由尖孢镰刀菌番茄颈
腐根腐专化型(Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici)侵染所致;该病原菌在 PDA培养基上生长适宜温度为 25℃,最
适 pH为 8;其较适宜的氮源是有机氮和硝态氮,铵态氮不适宜其生长;菌丝致死温度为 63℃、10 min;分生孢子萌发的最适
相对湿度是 100% ,最适温度为 25℃,分生孢子致死温度为 61℃、10 min。 这是首次关于尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐专化型导
致番茄病害在我国发生和研究的报道。
关键词:番茄; 颈腐根腐病; 病原; 鉴定; 影响条件
Identification of the pathogen causing Fusarium crown and root rot of tomato and
its growth affecting factors 　 GENG Li-hua1, LI Chang-bao1, CHI Sheng-qi2, WANG Li-jun2,
CHAI Min1 　 ( 1Beijing Vegetable Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097,
China; 2College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)
Abstract: Crown and root rot disease of tomato(Lycopersicon esculentum Mill. )was first observed in green-
houses in Beijing suburb in 2007. In order to lay the basis for resistance breeding and find controlling measures
for the disease, the typical diseased plants were collected and the pathogen was isolated and identified accor-
ding to the morphology, the sequence of internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA ( ITS), the
host range along with the optimal soil temperature at which the disease occurred. The major affecting factors of
the pathogen growth were also studied. The results were showed as follows: the pathogen of the disease was
identified as Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. The optimal temperature for the pathogen growth
on PDA was 25℃ and pH at 8; Nitrate-nitrogen [NO3 -N] and organic nitrogen were suitable for its growth,
but ammonium-nitrogen [NH4 -N] was not; The mycelium lethal temperature was 63℃, 10 minutes lasted;
100% relative humidity at 25℃ was optimal for conidia germination; The conidial lethal temperature is 61℃,
10 minutes lasted. This is the first report on tomato disease caused by Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lyco-
persici in China.
Key Words: tomato; crown and root rot; pathogen; identification; affecting factors
中图分类号: S436. 412　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)05-0449-07
　 　 从 2007 年夏秋季开始,在北京郊区北京市农 林科学院蔬菜研究中心多年连作的番茄(Lycoper-
　
植物病理学报 42 卷
sicon esculentum Mill. )育种大棚中发生番茄颈腐
根腐病,病情逐年加重。 主要症状表现为在土壤与
植株茎基部交接处、环绕茎基部有明显的深褐色病
斑,被侵染的植株在 3 ~ 5 片叶的幼苗期从发病部
位折倒而萎蔫死亡。 5 叶期以后至开花结果期发
病,则表现为茎基部缢缩、呈深褐色,植株仍然直立
而萎蔫致死,发病严重的品种病死率高达 100% 。
在我国尚无番茄颈腐根腐病研究报道,而国外
相关的研究报道较多。 番茄颈腐根腐病最早发现
于日本[1],之后在很多国家发生并成为影响温室
番茄生产的重要病害[2 ~ 4]。 该病最初被误认为由
番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. lycoper-
sici (Sacc. ) . Snyder &. Hans. )一个新的生理小
种(J3)侵染引起[1,5],Jarvis 和 Shoemaker 后来发
现该病病原导致的发病症状、发病适宜的土壤温度
和寄主范围等与番茄枯萎病菌有明显的差异,并于
1978 年鉴定其病原是番茄枯萎病菌的一个新的专
化型———尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型
(F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici) [6]。 番茄
颈腐根腐病菌与番茄枯萎病菌在三个方面有明显
差异:(1)症状不同,番茄枯萎病菌为害维管束造
成植株萎蔫,而番茄颈腐根腐病菌主要造成番茄茎
基部和根部褐变腐烂,茎部维管束变色通常不超过
根茎交接部以上 25 cm;(2)要求的土壤适宜温度
不同,番茄枯萎病最适发病土壤温度是 27℃左右,
而颈腐根腐病是 18℃左右[1,5,7];(3)致病范围不
同,番茄枯萎病菌只能侵染番茄,而颈腐根腐病菌
除了番茄外,还能侵染豆科、葫芦科、藜科的一些植
物[8,9]。 以往的研究还表明番茄颈腐根腐病能在
温室区迅速蔓延,在连作栽培区造成的损失逐年加
大[10,11],选育抗病品种和选用抗性砧木进行嫁接
栽培是最有效的防治方法[12 ~ 14]。
本文针对番茄颈腐根腐病的发生,采用传统的
形态学方法和 rDNA-ITS序列分析方法,并结合该
病原菌的适宜发病土壤温度测定和致病范围试验,
对病原菌进行鉴定,同时对病原菌生长的影响条件
进行了初步研究,为开展番茄颈腐根腐病抗病材料
的挖掘、筛选和综合防治提供参考。
1　 材料与方法
1. 1　 病原菌鉴定
1. 1. 1　 病原菌的分离和纯化 　 2008 年 8 月于北
京市农林科学院蔬菜研究中心农场大棚内采集典
型发病植株,按常规方法用 PDA 平板 25℃条件下
进行病原分离培养,挑取单孢纯化。
1. 1. 2　 致病性测定和适宜发病的土壤温度测定
对分离纯化得到的分离物,在 PDA 平板培养 7 d
后,配成浓度为 107个·mL -1的孢子悬浮液。 供接
种的番茄材料为 Q167。 种子用 52℃温水浸种 30
min,清水冲洗后催芽。 用浸根法进行接种:种子
催芽后播种在盛有灭菌蛭石营养钵内,番茄 1 片真
叶时,将幼苗轻轻拔起,用水将根系冲干净,放入接
种液中浸根 10 min,然后移栽入盛有灭菌蛭石和草
炭(蛭石 1∶ 草炭 2)的苗钵内,设清水浸根为对照。
接种后分为两部分,分别置于 18℃和 27℃条件下
培养,番茄苗发病后,从发病部位的病健交界处分
离纯化病原菌,并与接种前的分离物菌株进行形态
比较。 于接种后 1 个月调查两种温度下植株的发
病率。
1. 1. 3　 病原菌的形态特征观察　 将纯化的病原菌
接种到 PDA 平板上,25℃黑暗培养,观察菌落形
态;在 CLA培养基(2%水琼脂,20 g 琼脂,1 L 水,
康乃馨叶片块)上培养,观察大型分生孢子、小型
分生孢子和厚垣孢子,并在 100 倍倒置显微镜下直
接观察小型分生孢子的产生方式。
1. 1. 4　 病原菌 rDNA-ITS的扩增及序列分析　 将
病原菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中,在
25℃、125 rpm·min -1条件下振荡培养 3 ~ 4 d,过
滤收集菌丝体用于 DNA 提取。 DNA 提取参照
Lee等的方法[15]。 利用真菌核糖体基因转录间隔
区( ITS)通用引物 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAAC-
CTGCGG-3′)和 ITS4 ( 5′-TCCTCCGCTTATTGA-
TA-TGC-3′)对病原菌的 rDNA-ITS区进行 PCR扩
增[16]。 扩增条件为:94℃预变性 5 min;94℃变性 1
min,57℃退火 1 min,72℃延伸 1 min,共 30 个循
环;最终 72℃延伸 10 min。 PCR 产物经琼脂糖凝
胶电泳检测后,由上海英骏生物技术有限公司进行
测序,测序结果在 GenBank 数据库(www. ncbi.
nlm. nih. gov)中进行 BLAST比对分析。
1. 1. 5　 致病范围测定　 供试植物有番茄(L. escu-
lentum Mill. (Q-167))、黄瓜(Citrullus sativus L.
(102))、甜菜(Beta vulgaris L. (紫叶甜菜))和菜
豆(Phaseolus vulgaris L. ),其中番茄、黄瓜和甜菜
种子由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供,菜豆
054
　
　 5 期 　 　 耿丽华,等:番茄颈腐根腐病病原鉴定及不同条件对其生长的影响
从北京聚宏种苗技术有限责任公司购买。 接种方
法同 1. 1. 2,接种之后的环境温度为 18℃,对照为
清水浸根,接种 4 周后调查发病情况。
1. 2　 病原菌生长条件的研究
1. 2. 1　 温度对菌落生长的影响　 用 5 mm打孔器
从病原菌菌落边缘打取菌饼,将其置于 PDA 平板
中央,将平板分别放在 5,10,15,20,25,30,35 和
40℃下 8 个梯度的无光培养箱中培养,每个处理 4
次重复,5 d后用十字交叉法测量菌落直径。
1. 2. 2 　 菌丝的致死温度测定 　 设 55,60,61,62,
63,64 和 65℃共 7 个温度处理,每个处理用 4 个灭
菌的玻璃试管,在无菌条件下各装入 10 mL 灭菌
水、各加入 5 枚 5 mm的菌饼,封好棉塞,置于恒温
水浴锅中加热,预热 1 min 后开始计时,10 min 后
取出立即用冷水进行冷却,然后从每个试管中随机
取出 3 枚菌饼放到 PDA平板上,25℃培养 4 d。 观
察菌饼是否长出菌丝,确定致死温度。
1. 2. 3　 氮源对菌落生长的影响　 以固体查彼克培
养基为基础,用等量的硝酸钠、硝酸钾、蛋白胨、氯
化铵、硫酸铵、甘氨酸作为氮源,每处理 4 次重复。
25℃培养 4 d。 用十字交叉法测量菌落直径。
1. 2. 4　 pH对菌落生长的影响　 先灭菌 PDA培养
基,然后用 1 mol·L -1 NaOH 和 1 mol·L -1 HCl
调节其 pH,设 pH为 4,5,6,7,8,9,10 等 7 个梯度,
每处理 4 次重复;病菌培养条件及菌落直径测定同
1. 2. 3。
1. 2. 5 　 温度对分生孢子萌发的影响 　 设 5,10,
15,20,25,30,35 和 40℃共 8 个温度梯度,取病菌
分生孢子悬浮液,采用载玻片上萌发法[17],24 h 后
检查,每处理随机检查 100 个孢子,计算并比较孢
子萌发率。
1. 2. 6　 分生孢子的致死温度测定　 将分生孢子悬
浮液置于大小一致的试管中,每试管约 5 mL,分别
放入 50,55,60 和 65℃的恒温水浴锅中加热 10
min,预热 1 min 后开始计时。 处理过程中随时缓
缓摇匀试管,以保证温度均匀。 取出后立即在冷水
中冷却。 采用载玻片萌发法,于室温下培养 24 h。
镜检记录 500 个孢子萌发情况,确认范围在 60 ~
65℃范围内后,又分别在 61,62,63,64℃条件下进
行试验。
1. 2. 7　 湿度对分生孢子萌发的影响　 采用小容器
空气湿度调节法[17],在密闭容器内用不同浓度的
硫酸溶液控制相对湿度,置于 25℃下定时镜检孢
子萌发率,处理的相对湿度分别为 75% ,90% 和
100%共 3 个处理,3 次重复。
2　 结果与分析
2. 1　 病原菌鉴定
2. 1. 1　 病原菌分离纯化、致病性及适宜发病的土
壤温度测定　 从采集的病株中分离到 1 个分离物。
通过浸根接种法进行致病性测定,结果在土壤温度
18℃条件下幼苗发病率 100% ,在土壤温度 27℃条
件下发病率 70% ,而对照植株均未发病。 从接种
后发病植株的病健交界处分离纯化病菌,与原接种
菌株在形态上相同,确认所分离到的分离物是发病
植株的病原菌。
2. 1. 2　 病原菌的形态特征观察 　 病原菌在 PDA
培养基上呈淡紫灰色,菌落圆形,菌丝绒毛状,25℃
条件下在 PDA上黑暗培养 5 d菌落直径 60 mm左
右;大型分生孢子镰刀型,以 3 个隔膜为主;小型分
生孢子长椭圆形,通常无隔;分生孢子梗短、生于菌
丝侧面,单生,无分枝;厚垣孢子顶生或间生,圆形,
多为单独生长,偶尔也对生或串生。 依据 Leslie
等[18]鉴定该病原菌为尖孢镰刀菌(F. oxysporum)
(图 1)。
2. 1. 3 　 ITS 序列测定分析 　 采用真菌通用引物
ITS1 / ITS4 对该病原菌进行 rDNA-ITS 的 PCR 扩
增,电泳检测得到大小约 500 bp的片段,经测序分
析该病原菌 ITS 序列片段全长 503 bp,进行 Gen-
Bank注册,收录号为 HQ603784。 将该病原菌的
rDNA-ITS序列与在 GenBank 中相关真菌菌株的
ITS序列进行比对分析,表明该病原菌序列与 Gen-
Bank中 EU839387 等尖孢镰刀菌的序列同源性达
到 99% ,这一分析结果表明该病原菌属于尖孢镰
刀菌。
综合上述的形态学观察结果和 ITS 序列同源
性分析结果,确认该病原菌为尖孢镰刀菌。
2. 1. 4　 致病范围测定结果　 供试的番茄、黄瓜、甜
菜和菜豆品种接种后,发病率均为 100% ,清水对
照的植株没有发病,说明该病原菌不仅能使番茄致
病,还能使黄瓜、菜豆和甜菜致病。
154
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 1　 Colony Morphology of the pathogen
A: Colony morphology; B: Macroconidia; C: Microconidia; D: Microconidia in situ on CLA.
2. 2　 病原菌生长的影响条件
2. 2. 1　 温度对菌落生长的影响　 病原菌在 5℃时
几乎无生长,在 10 ~ 25℃范围内,随着温度升高病
原菌生长量增加,25℃时生长量最大,之后随着温
度升高生长量下降,40℃时没有生长(表 1)。 病原
菌生长适宜温度范围是 20 ~ 30℃,最适温度为
25℃。
菌丝在 55、60、61 和 62℃处理 10 min 条件下
均能生长,在 63、64、65℃处理 10 min 条件下均不
能生长(表 1),因此该病原菌菌丝的致死温度为
63℃、10 min。
Table 1　 The effect of temperature on mycelium growth of the pathogen
Temperature / ℃
Colony
diameter / mm
Significance
level / 5%
Significance
level / 1%
Temperature / ℃
( treated for 10 min)
Pathogen
growth
5 6. 0 EF D 55 +
10 6. 5 EF D 60 +
15 21. 6 D C 61 +
20 45. 5 B B 62 +
25 59. 5 A A 63 -
30 40. 3 C B 64 -
35 9. 9 E D 65 -
40 5. 0 F D
254
　
　 5 期 　 　 耿丽华,等:番茄颈腐根腐病病原鉴定及不同条件对其生长的影响
2. 2. 2　 氮源对菌落生长的影响　 不同氮源对该病
原菌生长的影响差异显著,适宜的氮源是蛋白胨和
硝酸钾,菌落直径分别为 70. 0 mm和 69. 8 mm,其
次是甘氨酸和硝酸钠,菌落直径分别为 66. 3 mm
和 64. 8 mm,而氯化铵和硫酸铵做为氮源的菌落直
径分别为 52. 9 mm 和 54. 6 mm,不适于该病原菌
的生长(图 2)。
2. 2. 3　 pH 值对菌落生长的影响 　 在 pH 4、5、6、
7、8、9 和 10 试验条件下,平均菌落直径分别为
45． 1、55. 0、55. 4、58. 9、59. 5、58. 0 和 52. 1 mm。
在 pH 4 条件下该菌生长量最小;在 pH5 ~ 8 范围
内,生长量逐渐加大,pH8 时生长量最大,之后生长
量有所下降(图 3)。 因此,该病原菌最适宜 pH
为 8。
2. 2. 4　 温度对分生孢子萌发的影响　 在 5 ~ 10℃
条件下孢子不能萌发,15℃时孢子萌发率开始增
加,25℃时,孢子萌发率最大,温度超过 30℃后,分
生孢子萌发率开始下降(图 4),因此,25℃是孢子
萌发的适宜温度。
　 　 病原菌分生孢子在 55℃处理 10 min,萌发率
为 55% ;60℃处理 10 min,萌发率为 1% ;65℃条件
下没有孢子萌发。 61℃和 62℃处理 10 min 时,均
没有孢子萌发。 因此认为该病原菌分生孢子致死
温度为 61℃、10 min。
Fig. 2　 The effect of nitrogen sources on mycelium growth of the pathogen
Fig. 3　 The effect of pH on mycelium growth of the pathogen
354
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 4　 The effect of temperature on conidia germination of the pathogen
2. 2. 5　 湿度对分生孢子萌发的影响　 相对湿度为
100%时,培养 10. 5 h 孢子萌发率为 50. 2% ,培养
23 h萌发率达 91. 4% ;湿度为 95%时,培养 10. 5 h
后孢子萌发率为 0. 1% ,23 h后萌发率仅为 17. 6% ;
相对湿度为 75% 时分生孢子几乎不能萌发(表
2)。 说明分生孢子萌发对湿度的要求很高,100%
是最适宜分生孢子萌发的相对湿度。
Table 2 　 The effect of relative humidity on
conidia germination of the patho-
gen
Relative
humidity / %
Conidia germination rate / % (Incubated time)
10. 5 h 16. 5 h 23 h
75 0 0　 0. 1
95 0. 1 0. 6 17. 6
100 50. 2 78. 2 91. 4
3　 结果与讨论
对病原菌的形态鉴定和 rDNA-ITS 序列分析
结果显示,番茄颈腐根腐病病原菌为尖孢镰刀菌。
其在土壤温度 18℃条件下导致的幼苗发病率远远
高于在土壤温度 27℃条件下的发病率,表明该病
原菌致病的适宜土壤温度为 18℃左右,这与 Sato
等的研究结果一致 [1,2,5,19]。 研究还发现,番茄颈
腐根腐病病原菌不仅能浸染番茄造成病害,人工接
种还能侵染瓜类、甜菜和菜豆等植物,这与 Rowe
等[8]和 Menzies等[9]的研究结果一致,证明番茄颈
腐根腐病病原菌与番茄枯萎病菌(F. oxysporum f.
sp. lycopersici)相比,虽然同为尖孢镰刀菌,但其
寄主范围更宽,危害范围更大,对此,番茄研究工作
者应给予高度重视。 该结果为生产中进行轮作栽
培提供了参考。
本研究结果表明,发生在北京郊区的番茄颈腐
根腐病的病原菌符合 Jarvis 和 Shoemaker 提出的
尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐专化型(F. oxysporum f.
sp. radicis-lycopersici)的特征[6],因此确定该病病
原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐专化型。 这是我
国首次关于尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐专化型导致
番茄病害的研究报道。
本文中温度对该病原菌的影响研究结果显示,
该病原菌在 PDA 培养基上的适宜生长温度为
25℃左右,而发病适宜土壤温度为 18℃左右,这与
Sato等的研究结果相同[1,5,7,19],表明该病原菌在
人工培养基上对温度的要求与在土壤条件下相比
是有显著差异的,因此在进行人工接种抗病性鉴定
时应充分考虑到这种差异,分别给予适宜的接种体
制备所需温度和接种后番茄苗发病需要的温度。
本文中番茄颈腐根腐病病原菌生长的影响条
件研究结果将为开展抗病品种的选育和综合防治
工作提供依据。
据作者了解,近年来在设施番茄主产区山东寿
光等地番茄颈腐根腐病均普遍发生,有的棚室损失
严重。 但是,目前番茄颈腐根腐病在我国尚未引起
454
　
　 5 期 　 　 耿丽华,等:番茄颈腐根腐病病原鉴定及不同条件对其生长的影响
足够关注。 国外同行的研究表明该病是土传病害,
能在设施栽培区迅速蔓延,在连作栽培区造成的损
失逐年加大,是设施番茄生产的限制因素之
一[10,11,19]。 我国是番茄生产和出口大国,近年来番
茄设施栽培的面积逐年加大且往往连续种植,该病
一旦流行将会给番茄生产造成严重损失,番茄研究
者应该密切监测番茄颈腐根腐病在主要番茄栽培
区的发生发展情况,同时尽快开展抗病种质资源筛
选和抗病品种培育等进一步的研究工作。
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