全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$*"1*!"
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基金项目$黑龙江省教育厅面上项目"
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!
#!$%##1
#&植物生物学黑龙江省高校重点实验室开放课题"
23!"#!"$
#&哈尔滨师范大学
青年学术骨干资助计划"
345!"#!#1
!
"&367*"#
#&黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划&哈尔滨师范大学硕士研究生
创新科研项目"
89:99;6!"#)*%!
#
!!
作者简介$陈
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默"
#&1&(
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究
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#,%+@C=
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通信作者$金晓霞!博士!讲师!主要从事植物分子生物学研究
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番茄
1)23$$
基因的克隆与表达
陈
!
默#!!金晓霞#"!于丽杰#!朱
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宏#!丁国华#!傅文上#!付
!
畅#
"
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哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院!植物生物学黑龙江省高校重点实验室!哈尔滨
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密山市第一中学!黑龙江密山
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#
摘
!
要$以番茄(哈大粉
1"#
)为试材!利用
EF*G;E
技术!克隆得到
#
个
<%
泛素蛋白连接酶基因
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4B05>0H
登录号
6I
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#对
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基因进行序列分析!并对
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基因在番茄植株的不同部位以及在非生
物胁迫"干旱+盐+碱+高温+低温#下的表达和生理特性进行研究!为培育和改良番茄品种提供理论依据结果表
明$"
#
#序列分析显示!
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基因的
@:JK
全长序列
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M
!编码
!)!
个氨基酸!分子量为
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!理论
M
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&同源分析显示!番茄
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蛋白与马铃薯的一致性最高"
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#"
!
#半定量
G;E
检测表明!
!"#$%#
基
因在番茄根+茎+叶+花+果实中均有表达!且表达差异不明显"
%
#干旱胁迫下!
!"#$%#
基因在番茄叶片中优势表
达!而在整个干旱过程中根部的
!"#$%#
基因表达量变化不明显&抗旱相关基因
!&
+
(#&)!
+
)*%
在干旱胁
迫过程中!番茄叶片中均有表达!且其表达量呈上升趋势!而在根部
(#&)!
+
)*%
基因基本没有检测到"
)
#干
旱胁迫过程中!番茄植株中丙二醛"
I:K
#含量呈显著升高趋势!质膜系统严重损伤!体内保护酶"
9Q:
+
GQ:
+
;KF
#
活性上升!且根部活性总体明显高于叶片"
$
#在非生物逆境"盐+碱+高温+低温#胁迫过程中!
!"#$%#
基因在番茄
叶片和根部的表达几乎都有增强的趋势!且在叶片中均是胁迫
%A
后诱导起始增强表达研究认为!
!"#$%#
基因
是一个受干旱胁迫诱导增强表达的基因!且在叶片中优势表达!说明
!"#$%#
基因对植物耐受干旱胁迫所起的作
用存在一定的组织差异性!而且
!"#$%#
基因可能参与番茄的干旱应答及信号转导过程!在番茄抵抗其他非生物
胁迫中
!"#$%#
基因也可能具有一定的作用
关键词$番茄&
!"#$%#
&克隆&表达
中图分类号$
71$
&
71,
!!!
文献标志码$
K
%&"()!*+
,
-(..#""/1)23$$/-"01
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M
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!
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U
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M
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[
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M
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8
9"-!.
$
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BD
M
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植物在生长发育过程中!经常遭遇到生物和非
生物胁迫的伤害在各种非生物胁迫中!干旱+高盐
和低温等非生物胁迫对植物的影响尤为突出!是制
约植物生长和农作物产量的最主要非生物胁迫因
子,#*!-番茄"
!
,
-.
/
"012-.3"1-45"364$ I.?+
#是重
要的经济作物!然而干旱环境严重影响了番茄的生
长发育和产量,%*-因此!如何提高番茄对干旱胁迫
的抗性以及通过分子生物学手段改良番茄抗逆性+
培育相关新品种!已成为中国乃至世界农业能否持
续高效发展的重大课题之一,1*#"-
<%
泛素蛋白连接酶"
VL.
_
V.^.0*
M
\C^B.0?.
U
>/B/
!
<%/
#是泛素%
!,9
蛋白酶体途径,##-中负责与底物蛋
白特异结合的关键酶!它可以通过泛素化降解与胁
迫信号有关的成分来响应对各种非生物的胁
迫,#!*#%-!通过其对无功能蛋白的降解!在植物抗逆中
发挥着重要作用
OBB
等,#)-从辣椒中分离出一个
ENJ4*Y.0
U
B类型,#$-
<%
连接酶
;>E=>#8#
!在拟南
芥中异源过表达
#$%#7#
明显增强了植物对干旱
的耐受性!说明
#$%#7#
基因正调控植物的干旱胁
迫响应过程
5>B
等,#,-报道!辣椒
E=>#8#
在水稻
中的同源蛋白
Q/E:;G#
参与对水稻干旱胁迫响应
过程的正调控!但是其具体作用机制仍不清楚同
样!
9BC
等,#-从辣椒中获得
8%#$%#7#
!并发现其
在番茄中异源过表达与野生型相比可以极大增强其
对干旱胁迫的耐性
尽管在其他植物中已有部分关于
<%
连接酶
E=>#
的研究!但在番茄中的
#$%#
基因至今尚未
报道本研究根据已有的基因序列数据库资源!同
源克隆出番茄的
!"#$%#
基因
@:JK
全长!在对其
进行生物信息学预测的基础上!分析
!"#$%#
基因
在番茄植株的不同部位以及干旱胁迫处理下的表达
情况!并对胁迫过程中的生理特性进行研究!为番茄
改良和培育抗旱品种提供一定的理论依据
#
!
材料与方法
$+$
!
试验材料及处理
供试材料为哈尔滨市农业科学院(哈大粉
1"#
)
番茄"
!
,
-.
/
"012-.3"1-45"364$ I.?+
#!五叶期"根+
叶#+成株期"根+茎+叶+花+果实#取材于哈尔滨师范
大学植物培养室
采用草炭土育种!当番茄长出子叶时!移植于
,
@=b@=
的小钵里当植株长至
$
叶期时!取番茄
叶片用于基因克隆五叶期番茄进行干旱控水处
理!分别于处理后
"
+
#
+
%
+
,
+
1
+
#"Z
和复水后
#Z
取
根和成熟叶!用于半定量表达分析与番茄植株部分
生理指标的测定干旱处理后
"
+
%
+
,
+
#"Z
和复水
后
#Z
取根和成熟叶!用于荧光定量表达分析五
叶期番茄进行盐 "
!"" ==C?
%
O J>;?
#+碱 "
#""
==C?
%
OJ>
!
;Q
%
#+高温"
)"c
#+低温"
)c
#胁迫处
理!并取胁迫后
"
+
%
+
,
+
#!
和
!)A
幼苗的根部和叶
片!用于半定量表达分析取番茄成株不同部位
"根+茎+叶+花+果实#用于基因的组织器官表达分
析以上材料均用锡箔纸包好后迅速用液氮冷冻
后!
(1"c
保存备用
$+:
!
方
!
法
$2:2$
!
;<3
提取和
6=<3
合成
!
对以上材料进行
总
EJK
的提取和
@:JK
第一链的合成!具体方法
参照
EJK
M
\B
M
GV\B
植物总
EJK
提取试剂盒"天
,%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
根生化科技有限公司#和反转录试剂盒"
FQSQ5Q
#
操作程序进行
$2:2:
!
番茄
1)23$$
基因
6=<3
序列克隆和
>%;
反应体系
!
以辣椒的
#$%#7#
的
@:JK
序列为信
息!与已公布的番茄基因组序列"
A^^
M
$%%
U
H@/V
-
>+
/C?
U
B0C=.@/+0B^
%
C^C?/
%
L?>/^
%#进行比对!获得编号
为
9C?
[
@"
U
"$)"1"+#
的基因序列!根据这个基因
@:JK
序列信息设计特异引物
O#
和
O!
"表
#
#以
叶片
@:JK
第一链为模板!进行
G;E
扩增!
G;E
体
系为模板
@:JK#
"
O
!上下游引物"
#"
"
=C?
.
O
(#
#
各
#
"
O
!
#"bG;E5VYYB\!+$
"
O
!
I
U
;?
!
!+$
"
O
!
ZJFGI.D^V\B
"
!==C?
.
O
(#
#
!+$
"
O
!
9%
:
:JK
聚合酶"
$T
.
"
O
(#
#
"+!
"
O
!加双蒸水至
!$
"
O

G;E
反应条件为
&)c
预变性
$=.0
&
)c
变性
,"
/
!
$1c
退火
,"/
!
!c
延伸
&"/
!共进行
%$
个反应
循环!
!c
延伸
#"=.0

G;E
扩增产物分别用
"+1P
琼脂糖凝胶进行电
泳检测电泳回收产物与
M
I:#1*F
载体连接!然
后将连接产物转化感受态大肠杆菌细胞!涂板筛选
白色克隆!菌液
G;E
和双酶切初步鉴定后送上海生
工公司测序
$+:+?
!
序列分析与系统进化树的构建
!
应用
J;*
5N
的
QEWW.0ZB程序分析蛋白质的开放读码区
应用
9.
U
0>NG
"
A^^
M
$%%
`` `+@L/+Z^V+ZH
%
/B\].@B/
%
9.
U
0>NG
%#预测蛋白的信号肽利用在线软件
FI*
M
\BZ
"
A^^
M
$%%
`` `+@A+B=L0B^+CU
%
/CY^ >`\B
%
FI*
GE<:
*
YC\=+A^=?
#对蛋白进行跨膜分析应用
G\BZ.@^G\C^B.0
"
A^^
M
$%%
`` `+
M
\BZ.@^
M
\C^B.0+CU
%#
在线蛋白质序列和结构预测网站对蛋白进行二级结
构的预测应用在线网站
A^^
M
$%%
`` `+BD
M
>/
[
+
CU
%
M
\C/.^B
%预测蛋白质具有生物学意义的位点+模
式和轮廓其他植物的
E=>#
蛋白序列均来自于
J;5N
数据库!使用
5OK9F
进行序列比对先用软
件
:JKIKJ
对序列进行多重比对!然后用软件
I<4K)
构建系统进化树
$2:2@
!
1)23$$
基因在番茄不同器官中的表达
!
根据
!"#$%#
基因的
@:JK
序列设计半定量表达
引物
O%
和
O)
"表
#
#提取番茄成株不同部位"根+
茎+叶+花+果实#的
EJK
!去除
:JK
后反转录成
@:JK
!测定
@:JK
浓度!使各自浓度一致!然后进
行半定量
EF*G;E
模板分别为不同组织的
@:JK
#
"
O
!引物
O%
和
O)
"
#"
"
=C?
.
O
(#
#各
#
"
O
!
G;E
体系同
#+!+!
!退火温度
$1c
同时以
!
+-623
基
因作为内参!用
!
+-623
引物"表
#
#对其进行扩增
表
$
!
引物名称及序列
F>L?B#
!
J>=B/>0Z/B
_
VB0@B/CY^AB
M
\.=B\/
名称
J>=B
序列
9B
_
VB0@B
"
$d
#
%d
#
长度
OB0
U
A^
%
L
M
基因
4B0B
O# W
$
KF44;;FFK4KK;K4;F44K; !& !"#$%#
O! E
$
F;KKKK;KK4KFFK4K;KF4F;K;K
O% W
$
F;;KF;;;KF;FK;FF;KK;4K; !)) !"#$%#
O) E
$
KF;K4;;F4F4KFKKFF4;;FF;
:# W
$
KK444KKK444KK4;;K4F4 %$" (#&)!
:! E
$
4;;4KKK;;K4KK4;KK;4
K# W
$
;;4KFF;4F;;F;F4FKK !& )*%
K! E
$
FK4;;KFF;F4KF;FF;;
O$
FFF;K;4;FKKK4F;F;; %)" !&
O$
;K;;;FF;;KFKKKF;F4
!
+-623*W W
$
KF44;K4K;44K4K44KFKFF;K #"1$
!
+-623
!
+-623*E E
$
4;;FFF4;KKF;;K;KF;F4;F4
!
+-623*# W
$
44KK;FF4K4KK44K4;;FKK4 #""
!
+-623
!
+-623*! E
$
;KK;K;;KK;K4;KK;K4F;F
$2:2A
!
干旱胁迫下
1)23$$
和其他抗旱相关基因
的表达分析
!
干旱处理后
"
+
#
+
%
+
,
+
1
+
#"Z
和复水
后
#Z
取根部和叶片!用于
!"#$%#
和其他抗旱相
关基因"
(#&)!
+
)*%
+
!&
#半定量表达分析!
方法同
#+!+)

$2:2B
!
干旱胁迫下
1)23$$
基因实时荧光定量表
达分析
!
分别提取番茄五叶期干旱处理
"
+
%
+
,
+
#"Z
和复水后
#Z
的根和叶的
EJK
!去除
:JK
后反转
录成
@:JK
!测定
@:JK
浓度!使其浓度一致!然后
进行实时荧光定量
EF*G;E
!以
!
+-623
基因作为内
参"表
#
#
反应体系为
G;E I>/^B\I.D*G?V/*!$
"
O
!
G?V//C?V^.C0$
"
O
!
#"
"
=C?
.
O
(#
O%
和
O)
引物
"表
#
#各
!
"
O
!模板
@:JK$
"
O
!加入双蒸水至
$"
"
O
反应程序为
&$c
变性
#"/
!
,"c
退火
#"/
!
!
c
延伸
%$/
!共进行
)"
个循环反应在
K5N$""
型实时荧光
G;E
仪"
K
MM
?.BZ5.C/
[
/^B=/;C+O^Z+
!
T9K
#上进行!采用两步法!在
,"c
进行荧光信号
采集!反应结束后绘制融解曲线样本和内参分别
设
%
个重复!
!
+-623
为内参"表
#
#采用比较
8
F
法"
##
8
F
#荧光定量
G;E
扩增数据进行处理!以干
旱胁迫
"Z
的根和叶为对照样品
$+:+C
!
干旱胁迫下番茄植株生理指标测定
!
以五
叶期番茄植株干旱处理
"
+
#
+
%
+
,
+
1
+
#"Z
和复水后
#
Z
的根和叶为材料!进行丙二醛"
I:K
#含量及抗氧
化酶活性"
GQ:
+
;KF
+
9Q:
#的测定
丙二醛"
I:K
#含量测定采用硫代巴比妥酸
"
F5K
#法,#1-过氧化物酶"
GQ:
#活性测定采用愈
创木酚显色法,#&-!以每克鲜重每分钟
K
)"
变化
"+"#
%#
&
期 陈
!
默!等$番茄
!"#$%#
基因的克隆与表达
的酶量为一个酶活性单位过氧化氢酶"
;KF
#活
性测定采用紫外吸收法,#&-!以每克鲜重每分钟
K
!)"
光密度降低
"+#
的酶量为一个酶活性单位超氧化
物歧化酶"
9Q:
#活性测定采用氮蓝四唑光还原
法,#&-!以每克鲜重抑制
J5F
光化学还原
$"P
为一
个酶活性单位以上试验均进行
%
次重复!所得数
据用
9G99#+"
软件进行统计分析
$2:2D
!
盐!碱!高温!低温胁迫下
1)23$$
基因的表
达分析
!
对五叶期番茄进行盐"
!""==C?
%
OJ>;?
#+
碱"
#""==C?
%
OJ>
!
;Q
%
#+高温"
)"c
#+低温"
)c
#
胁迫处理!并取胁迫后
"
+
%
+
,
+
#!
+
!)A
幼苗的根部和
叶片!用于半定量表达分析!方法同
#+!+)

!
!
结果与分析
:2$
!
番茄
1)23$$
基因
6=<3
序列的获得
以番茄叶片的
@:JK
为模板!进行
G;E
扩增!
得到
#
条约
$"L
M
左右的条带"图
#
#将回收产物
与
M
I:#1*F
载体连接!然后将连接产物转化感受
态大肠杆菌细胞!涂板筛选白色克隆!菌液
G;E
后
进行双酶切"图
!
#!得到目的条带
图
#
!
!"#$%#
基因全长
@:JK
序列扩增结果
I+:O!"""
&
#+
扩增片段
W.
U
+#
!
K
U
>\C/B
U
B?B?B@^\C
M
AC\B/./CY^AB@:JK
/B
_
VB0@BCY!"#$%#
U
B0B
I+:O!"""
&
#+FABY\>
U
=B0^/CYEF*G;E
图
!
!M
I:#1F*!"#$%#
双酶切电泳
I+:O!"""
&
#+
M
I:#1F*!"#$%#
&
!+
M
I:#1F*!"#$%#
质粒酶切产物
W.
U
+!
!
G?>/=.Z
M
I:#1F*!"#$%#ZCVL?BZ.
U
B/^BZ
I+:O!"""
&
#+
M
I:#1F*!"#$%#
&
!+<0a
[
=B
M
\CZV@^/CY
M
I:#1F*!"#$%#
M
?>/=.Z
:2:
!
1)23$$
基因的序列分析
应用
J;5N
的
QEWW.0ZB程序显示开放读码
区为
!&L
M
!编码
!)!
个氨基酸"图
%
#对番茄
OB*
E=>#
蛋白氨基酸组成分析!
!)!
个氨基酸中有
#1
个强负极性氨基酸"
:
+
<
#!
!"
个强正极性氨基酸
"
3
+
E
#!
,
个弱碱性氨基酸"
8
#!
&)
个疏水性氨基酸
"
K
+
N
+
O
+
W
+
X
+
e
+
G
+
I
#!
#")
个极性氨基酸"
J
+
;
+
7
+
9
+
F
+
S
+
4
#&其分子量为
!+"$H:
!理论
M
N
为
+&
预测
OBE=>#
蛋白信号肽发现!番茄
OBE*
=>#
蛋白质不含有信号强烈的信号肽
对番茄
OBE=>#
蛋白进行跨膜分析表明!按膜
的取向来分!由内向外有
%
个显著的跨膜螺旋!由外
向内有
%
个明显的跨膜螺旋对番茄
OBE=>#
蛋白
进行二级结构的预测!结果表明该蛋白二级结构主
要由
?CC
M
环"
1+&P
#+
$
螺旋"
#&+"P
#构成!此外
还有少量的
%
折叠"
!+#P
#应用在线网站
A^^
M
$%%
`` `+BD
M
>/
[
+CU
%
M
\C/.^B
%预测番茄
OBE=>#
蛋白
质的生物学意义的位点+模式和轮廓!发现该蛋白在
%
&
1,
氨基酸残基处有
#
个
ENJ4*^
[M
B
锌指蛋白
结构区
采用
5?>/^6
分析番茄
OBE=>#
氨基酸序列与
4B05>0H
中其他植物的
E=>#
蛋白的同源关系!蛋
白氨基酸序列分析结果"图
)
#表明!番茄
OBE=>#
氨基酸序列与马铃薯的一致性为
&#P
!与甜椒的一
致性为
1,P
!与毛果杨+大豆+黄瓜等作物为
,"P
以
图
%
!
OBE=>#@:JK
的核苷酸及编码氨基酸序列
W.
U
+%
!
JV@?BC^.ZB/B
_
VB0@B>0ZZBZV@BZ>=.0C>@.Z
/B
_
VB0@BCY^ABYV?*?B0
U
A^OBE=>#@:JK
1%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
)
!
番茄
OBE=>#
与其他物种
E=>#8#
氨基酸序列保守区域的多重比对
;/EIK#8#+
黄瓜"
6G
*
"")#%)"
#&
;=EIK#8#+
甜瓜"
6G
*
""1)$$%!
#&
4=EIK#8#+
大豆"
6G
*
""%$)%%)!
#&
e]EIK#8#+
葡萄"
6G
*
""!!!#%,
#&
G^GQGFE+
毛果杨"
6G
*
"",%,$"!
#&
W]EIK#8#+
野草莓"
6G
*
"")%"%#$"
#&
IZEIK#8#+
苹果"
6G
*
""1%)&$"#
#&
9?EIK#8#+
番茄"
6G
*
"")!)%1#!
#&
9^EIK#8#+
马铃薯"
6G
*
"",%$)1$
#&
;>EIK#8#+
甜椒"
EIK#
*
;KJGKJ
#&
括号内为
4B05>0H
登录号&下同
W.
U
+)
!
K?.
U
0=B0^ CY@C0/B\]BZZC=>.0/CYE=>#8#Y\C= C^=>^C>0ZC^ABM
?>0^/
M
B@.B/
;/EIK#8#+8;1%62<41
"
6G
*
"")#%)"
#&
;=EIK#8#+8;$"5.
"
6G
*
""1)$$%!
#&
4=EIK#8#+=;$%>
"
6G
*
""%$)%%)!
#&
e]EIK#8#+?;<232
@
"0%
"
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*
""!!!#%,
#&
G^GQGFE+A;602-B.-%0
/
%
"
6G
*
"",%,$"!
#&
W]EIK#8#+C;<"1-%
"
6G
*
"")%"%#$"
#&
IZEIK#8#+D;E.$"16-%
"
6G
*
""1%)&$"#
#&
9?EIK#8#+F;5
,
-.
/
"012-4$
"
6G
*
"")!)%1#!
#&
9^EIK#8#+F;64G"0.14$
"
6G
*
"",%$)1$
#&
;>EIK#8#+8;%3344$
"
EIK#
*
;KJGKJ
#&
4B05>0H>@@B//.C00V=LB\/>\B.0
M
>\B0^AB/B/
&
FAB/>=B>/LB?C`
下!这说明
!"#$%#
基因在这些植物中的一致性
较低
:2?
!
番茄
E(;0)$
的进化树分析
选取在氨基酸序列比对中相似度较高的
&
种植
物!分析番茄
OBE=>#
与其他物种中相关蛋白的进
化关系!用
I<4K)
绘制进化树结果"图
$
#显示!
番茄的
OBE=>#
与马铃薯和甜椒同属
#
个分支!且
与马铃薯进化最近!其次是甜椒葡萄和毛果杨的
E=>#
属于同
#
个分支&野草莓和苹果的
E=>#
属
于同
#
个分支&大豆+黄瓜和甜瓜的
E=>#
属于同
#
个分支!其中黄瓜和甜瓜的进化关系较近
:2@
!
1)23$$
基因在番茄不同器官中的表达
采用半定量
G;E
方法!检测番茄
!"#$%#
基因
在不同器官"根+茎+叶+花+果实#的表达情况如图
,
所示!番茄
!"#$%#
基因在根+茎+叶+花+果实中
均有表达!且表达差异不明显
:2A
!
干旱胁迫下
1)23$$
及其他抗旱相关基因的
表达分析
!!
采用半定量
EF*G;E
方法!检测干旱胁迫下!
!"#$%#
基因和其他抗旱相关基因在番茄叶片和根
&%#
&
期 陈
!
默!等$番茄
!"#$%#
基因的克隆与表达
部中的表达水平"图

#结果显示!干旱胁迫下!
!"#$%#
基因在番茄叶片和根部均有表达随着干
旱胁迫进行!番茄叶片中
!"#$%#
的表达量呈先上
升后下降又上升又下降的趋势在干旱处理
#
和
%
Z
时!表达量有所增强!之后表达量下降!而在干旱
#"Z
时!表达量又增加并达到最大!复水后表达减
弱番茄根部中
!"#$%#
基因虽在干旱
#Z
时表达
图
$
!
部分物种的
E=>#
氨基酸序列的系统进化树
分支上的数值表示
5CC^/^\>
M
验证中基于
#"""
次重复
该节点的可信度&标尺表示遗传距离
W.
U
+$
!
GA
[
?C
U
B0B^.@^\BBCY>=.0C>@.Z/B
_
VB0@B/CY^AB
E=>#Y\C=/B]B\>?
M
?>0^/
M
B@.B/
FAB0V=LB\/C0^ ABL\>0@AB/\B
M
\B/B0^ A^B\B?.>L.?.^
[
M
B\@B0^ CY5CC^/^\>
M
]>?VB/L>/BZC0#"""\B
M
?.@>^.C0/
&
FAB/@>?BL>\\B
M
\B/B0^/
U
B0B^.@Z./^>0@B
图
,
!
番茄
!"#$%#
基因在不同器官的表达
I+:O!"""
&
#+
根&
!+
茎&
%+
叶&
)+
花&
$+
果实
W.
U
+,
!
FABBD
M
\B//.C0CY!"#$%#.0
Z.YYB\B0^ CU
>0/CY^C=>^C
I+:O!"""
&
#+ECC^
&
!+9^B=
&
%+OB>Y
&
)+W?C` B&
$+W\V.^
量有所下降!但在整个干旱过程中!其表达量变化并
不明显
干旱胁迫下!抗旱相关基因
!&
在番茄叶片
和根部均有表达!在叶片中!其表达量呈上升趋势!
而在根部的表达量变化不明显&抗旱相关基因
(#&)!
+
)*%
在番茄叶片中均有表达!与对照相
比!表达量均增加!说明该基因在叶片中增强表达!
且在整个干旱过程中!表达量的变化不明显&而在根
部中!这
!
个基因基本没有被检测出来"图

#
:2B
!
干旱胁迫下
1)23$$
基因实时荧光定量表达
分析
!!
采用荧光定量
G;E
方法!检测番茄
!"#$%#
基
因在干旱胁迫条件下的表达水平结果"图
1
#显
示!干旱胁迫下该基因在番茄叶片和根部均有表达
随着干旱胁迫进行!番茄叶片中
!"#$%#
的表达量
呈先上升后下降再升高的趋势!且与对照相比表达
量呈现上升趋势在干旱处理
%Z
时有一次应激反
应的上升!之后表达量下降&在干旱处理
#"Z
时表
达量又升高并达到最大!约为对照的
&
倍
!"#$%#
图
1
!
番茄
!"#$%#
基因干旱胁迫下在叶片和根部的表达
W.
U
+1
!
FABBD
M
\B//.C0CY!"#$%#.0?B>]B/>0Z\CC^/CY
C^=>^CV0ZB\Z\CV
U
A^ /^\B//
图

!
干旱胁迫下番茄
!"#$%#
基因和干旱相关基因在叶片"
K
#和根部"
5
#的表达
I+:O!"""
&
EB*#+
复水后
#Z
!下同
W.
U
+
!
FABBD
M
\B//.C0CY!"#$%#>0ZZ\CV
U
A^*\B?>^BZ
U
B0B/.0?B>]B/
"
K
#
>0Z\CC^/
"
5
#
V0ZB\Z\CV
U
A^ /^\B//
I+:O!"""
&
EB*#+FABY.\/^Z>
[
>Y^B\\BA
[
Z\>^.C0
!
A^B/>=B>/LB?C`
")#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
在复水后
#Z
其在叶片中的表达量下降干旱胁迫
下!基因表达量在根部的变化趋势与叶片相反!呈现
总体下降的趋势在干旱处理
,Z
时!表达量达到
最低!约为对照的
"+$
倍&与叶片相似!该基因在根
部复水后
#Z
其表达又呈下降趋势"图
1
#
:+C
!
干旱胁迫对番茄植株生理指标影响
在干旱胁迫处理下!对其五叶期番茄植株的叶
片和根部的生理指标进行了测定结果"图
&
#显
示!在干旱及复水处理过程中!
I:K
含量呈先升高
后降低的趋势干旱胁迫导致叶片
I:K
含量明显
增加其中!干旱处理
#"Z
时!
I:K
含量增加最
多!高出对照
!
倍之多!膜脂过氧化程度加重&而在
复水后
#Z
时!
I:K
含量得到了降低!但仍高于对
照!说明复水处理部分缓解了干旱胁迫导致的膜脂
过氧化根部
I:K
含量变化趋势与叶片相似!均
呈先升高后下降趋势
GQ:
+
;KF
+
9Q:
是植物体内清除活性氧对细
胞膜系统伤害的重要保护酶从图
&
可知!在干旱
及复水过程中!番茄叶片
9Q:
和
;KF
活性均呈先
上升后下降再上升趋势干旱处理
%Z
!二者活性均
明显上升!而后逐渐下降&复水后活性得以上升两
者根部变化趋势同叶片相似虽然根部
;KF
活性
在干旱处理
%Z
时略低于对照!但二者之间差异并
不显著番茄叶片
GQ:
活性在干旱胁迫及复水过
程中也呈先上升后下降再上升趋势在干旱处理
,
Z
时!
GQ:
活性达到最大随后下降!复水后活性显
著上升根部
GQ:
的活性在干旱胁迫与复水过程
中整体高于叶片!呈先下降后上升再下降趋势尽
管在干旱处理
%Z
时!
GQ:
活性略有下降!但与
"Z
相比!二者差异也均并不显著而在复水后!与叶片
不同!根部
GQ:
活性显著下降
以上结果表明!干旱胁迫引起膜脂过氧化程度
加剧!使番茄植株体内
I:K
含量升高!植物为维持
正常生长!
GQ:
+
;KF
+
9Q:
保护酶系统均发挥作
用干旱胁迫后复水!清除活性氧保护酶
9Q:
+
GQ:
和
;KF
的活性提高!
I:K
得到清除!膜系统
的损伤得到恢复!透性降低!恢复原有正常的生理代
谢机能
:2D
!
在不同逆境胁迫下
1)23$$
基因的表达分析
利用半定量
EF*G;E
方法!检测番茄中
!"#+
$%#
基因在盐+碱+高温+低温逆境胁迫的响应表达
情况结果"图
#"
#显示!盐胁迫下!番茄
!"#$%#
基因在叶片的表达有增强的趋势!在
%
和
,A
处有
明显增强!根部变化的趋势与叶片相似!也在
%A
处
增强"图
#"
!
K
#&碱胁迫下!
!"#$%#
基因在叶片的
表达也是从
%A
起呈增强趋势"图
#"
!
5
#&高温胁迫
图
&
!
番茄植株在干旱胁迫下
I:K
含量与抗氧化酶活性变化
小写字母表示干旱胁迫下
"+"$
水平显著性差异
W.
U
+&
!
;A>0
U
B/CYI:K@C0^B0^ >0Z>0^.CD.Z>0^B0a
[
=B>@^.].^.B/V0ZB\CY^C=>^C
M
?>0^/V0ZB\Z\CV
U
A^ /^\B//
FAB0C\=>??B^^ B\/.0Z.@>^B/.
U
0.Y.@>0^ Z.YYB\B0@B/LB^ B`B0Z\CV
U
A^ /^\B//^\B>^=B0^/>^"+"$+
#)#
&
期 陈
!
默!等$番茄
!"#$%#
基因的克隆与表达
图
#"
!
不同逆境胁迫下番茄
!"#$%#
基因在叶片和根部的表达
K+!""==C?
%
OJ>;?
盐胁迫&
5+#""==C?
%
OJ>
!
;Q
%
碱胁迫&
;+)"c
高温胁迫&
:+)c
低温胁迫&
I+:O!"""
W.
U
+#"
!
FABBD
M
\B//.C0CY!"#$%#.0?B>]B/>0Z\CC^/CY^C=>^CV0ZB\Z.YYB\B0^ /^\B//^\B>^=B0^/
K+!""==C?
%
OJ>;?CY/>?^/^\B//
&
5+#""==C?
%
OJ>
!
;Q
%
CY>?H>?./^\B//
&
;+)"cCYA.
U
A^ B=
M
B\>^V\B/^\B//
&
:+)cCY@A.?.0
U
/^\B//
&
I+:O!"""
下!
"#$%#
基因在叶片的表达量在
%
和
,A
处均
增加!在根部
%A
处表达略有增强"图
#"
!
;
#&低温
胁迫下!
!"#$%#
基因在叶片的表达量从
%A
开始
持续增加!
)A
时达到最大!根部在
,
和
!)A
时表
达量增多!但不明显"图
#"
!
:
#
以上结果表明!在盐+碱+高温+低温胁迫下!
!"#$%#
基因在番茄叶片和根部的表达几乎都有增
强的趋势!且在上述胁迫下!该基因在叶片中均是胁
迫
%A
后诱导起始增强表达
%
!
讨
!
论
自从
#$%#7#
被作为干旱诱导基因被最初鉴
定出来,!"-!就使人们猜想!它在其他物种是否也具
有抗非生物胁迫 功能!进而陆续对 它 进 行 研
究,#)!#,*#-然而虽然在部分植物中
!"#$%#
基因已
被克隆!但在栽培经济作物番茄中尚未见报道本
试验中采用
EF*G;E
的方法!获得番茄
!"#$%#
基
因
@:JK
全长序列对番茄
OBE=>#
蛋白进行跨
膜分析!发现该蛋白具有跨膜螺旋并且在
%
&
1,
氨基酸残基处有
#
个
ENJ4*^
[M
B
锌指蛋白结构区
这与
OBB
等,#)-在辣椒中的
OBE=>#
序列分析相类
似!在其
;
末端具有跨膜结构域!在
J
末端附近具
有
ENJ4
结构域!氨基酸残基具
20
!f结构在其他
<%
泛素连接酶同样具有该
20
!f 结构,!#*!!-番茄
OBE=>#
与其他
&
种植物进行同源性分析!发现番
茄
OBE=>#
氨基酸序列与马铃薯的一致性最高为
&#P
!与毛果杨+大豆+黄瓜等作物一致性为
,"P
以
下!说明
!"#$%#
基因在这些植物中的一致性较低
这同样与
OBB
等,#)-在辣椒中的
OBE=>#
同源性分
析结果相似!其选择与
E=>8#
高度同源的
E=>#
+
E=>!
+
E=>%
进行相互比对!发现在杨树+拟南芥+
水稻等植物的一致性均在
$"P
以下!一致性同样
较低
基因表达模式能够反映基因特定的生物学功
能半定量分析表明!
"#$%#
在番茄根+茎+叶+花
和果实中均有表达!说明此基因编码的蛋白在番茄
各器官中普遍存在而该基因编码的蛋白即是
<%
泛素连接酶!前人研究发现植物体内多种
<%
泛素
连接酶在各器官中大都均有表达
;>^>?>E
等,!%-
发现一个
9TIQ<%
泛素连接酶
9N2#
!其在拟南芥
中各组织均有表达
H$#CA#
是玉米中
#
个编码
ENJ4*8!<%
泛素连接酶的基因,!)-!该基因与拟南
芥
F(*##
同源,!$-
H$#CA#
在各组织!包括叶+
茎+穗和幼穗均有表达拟南芥
<%
泛素蛋白酶
K^*
9KG$
,
!,
-在根+茎+叶+花中均有表达烟草
ENJ4*8!
型基因
#7C#
编码
#
个
<%
连接酶
J^E8W#
在根+
茎+叶+花+成熟的果实不同器官中也均有表达,!-
干旱胁迫下!半定量分析表明
!"#$%#
基因在
!)#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
番茄叶片和根部均有表达随着干旱胁迫进行!番
茄叶片中
!"#$%#
的表达量呈先上升后下降又上升
又下降的趋势根部中
!"#$%#
基因在整个干旱过
程中表达量变化并不明显抗旱相关基因
!&
+
(#&)!
+
)*%
在叶片中表达量呈上升趋势进
而对
!"#$%#
基因进一步实时荧光定量
G;E
检测
结果表明$在干旱胁迫处理下!
"#$%#
基因在番茄
叶片的表达量在胁迫初期呈现一次明显的上升!略
有下降后又上升!表达量总体上与对照相比呈现明
显的上升趋势这与玉米中鉴定出的一个与水稻
Q/4X!
同源的
ENJ4
型
<%
泛素连接酶
2=4X!
相似!在玉米苗期不同胁迫处理下!
H$=I!
基因在
根和叶中均被诱导表达!在干旱胁迫条件下!该基因
前期表现出上调表达!而后表达量逐渐下降,!1-
!"#$%#
在根中表达量虽有变化!但相对于叶片还
是稳定的!且表达水平整体低于叶片表明
!"#+
$%#
基因是一个受干旱胁迫诱导增强表达的基因且
在叶片中优势表达干旱胁迫诱导时叶+根中基因
表达水平的不同说明该基因对植物耐受干旱胁迫所
起的作用存在一定的组织差异性这与
OBB
等,#)-
结果相似!其试验结果表明!叶组织是
#$%#7#
诱
导辣椒响应干旱胁迫的主要部位
以上通过荧光定量
G;E
技术!证明了干旱胁迫
处理对
!"#$%#
基因表达有一定诱导作用因此!
可初步认定
!"#$%#
是一个受干旱诱导表达的基因
且在叶片中优势表达&进一步表明该基因可能参与
番茄的干旱应答及信号转导而
OBB
等,#)-对辣椒
中的同源基因
8%#$%#
转入拟南芥的研究!发现
8%#$%#
可以参与干旱胁迫诱导!其作用机制是可
能通过抑制水通道蛋白
GNG!
&
#
从内质网到质膜的
转运!并伴随蛋白酶体对其的降解来减少
GNG!
&
#
在转基因植物原生质体中的水平!从而来响应转基
因拟南芥对干旱的胁迫因此!推测番茄
!"#$%#
基因是否也是通过该机制来实现干旱胁迫响应的!
还需进一步研究
与基因表达检测的同时!本试验还对干旱处理
番茄植株生理方面进行检验!
I:K
是膜脂过氧化
的主要产物之一干旱胁迫下!植物膜脂过氧化物
I:K
大量积累!而
I:K
含量的上升与膜透性的增
加呈显著的正相关!导致细胞膜系统的严重损伤!其
积累是活性氧毒害作用的表现,!&*%"-
I:K
能与细
胞膜上的蛋白质+酶等结合!引起蛋白质分子内和分
子间的交联!使之失活!从而破坏生物膜的结构与功
能,%#-因此!
I:K
被广泛用作衡量膜脂过氧化损
伤的指标!可用
I:K
含量表示细胞遭受氧化损伤
的程度其含量高低反映了细胞膜脂过氧化作用的
强弱!
I:K
含量增加!表明膜脂过氧化程度加剧
干旱胁迫使质膜受损同时!可以使植物体内活性氧
"
EQ9
#大量积累!
EQ9
的产生对细胞具有一定的损
伤作用植物体内存在清除活性氧的抗氧化酶系统
"
GQ:
+
9Q:
+
;KF
#在正常生长条件下!植物体内
活性氧的产生和清除处于动态平衡状态!从而使植
物体内活性氧维持在较低的浓度范围内干旱等逆
境胁迫破坏了这种平衡,%!*%%-!导致细胞膜破坏使植
物受损本实验结果表明!干旱胁迫下!质膜系统在
一定程度上受损!体内
I:K
含量呈升高趋势番
茄植株为维持正常生长!保护酶系统相应发挥作用
该结果与何乘坤等,%)-和孙三杰等,%$-报道相似干
旱胁迫下!引起膜脂过氧化程度加剧!使番茄植株体
内
I:K
含量升高!
GQ:
+
;KF
+
9Q:
保护酶系统活
性上升!干旱处理后期酶活下降&干旱胁迫后复水!
清除活性氧保护酶
9Q:
+
GQ:
和
;KF
的活性重新
提高!
I:K
得到清除!膜系统的损伤得到恢复!透
性降低!恢复正常的生理代谢机能,%)-
此外!植物体内多数
<%
泛素连接酶除具抗旱
性外!还具有其他抗非生物胁迫的功能!比如!耐盐
碱+高低温+外源激素
K5K
+乙烯等,#)!#!!!,!1!%,*%-
推测
!"#$%#
基因也可能在植物抵抗以上非生物胁
迫中发挥作用本试验在对番茄
!"#$%#
进行干旱
相关研究的同时!也对它在其他非生物胁迫中的作
用进行了初步研究对五叶期番茄进行盐+碱+高
温+低温胁迫处理!并用半定量
EF*G;E
方法检测
了
!"#$%#
基因在以上非生物胁迫下的表达量变
化结果显示!在上述胁迫下!
"#$%#
基因在番茄
叶片和根部的表达几乎都有增强的趋势!且在叶片
中是胁迫
%A
后诱导增强表达!推测
!"#$%#
基因
可能在番茄抵抗以上非生物胁迫中发挥作用其结
果也 与
OBB
等,#)-相 似!在 盐 和 低 温 处 理 下!
#$%#7#
上调表达因此!推测
!"#$%#
基因可能
作为上调基因在以上非生物胁迫中发挥作用!且该
基因是否具有上述功能还需进一步的研究
本研究通过克隆番茄泛素
<%
连接酶
!"#$%#
基因并对其表达进行研究表明!该基因在番茄成株
不同器官中均有表达!且差异不显著在干旱胁迫
下!
"#$%#
基因在叶片中增强表达!而在根中表达
相对稳定!叶片中的表达水平整体高于根!可见该基
因可能参与番茄的干旱应答及信号转导过程!且在
不同器官所起的调节作用有一定的差异!其机理需
%)#
&
期 陈
!
默!等$番茄
!"#$%#
基因的克隆与表达
进一步研究此外!研究结果表明该基因在番茄抵
抗其他非生物胁迫中也可能发挥一定作用!其功能
还需通过转基因方法进一步进行验证本研究结果
为理解番茄的抗旱分子机理提供了试验基础!为番
茄抗旱及其他抗非生物胁迫遗传改良提供了理论依
据和候选基因资源
致谢!本研究在植物生物学黑龙江省高校重点实验室内完成"
参考文献"
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