全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(３): ２７０￣２７９(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０４￣１１ꎻ 修回日期: ２０１５￣０１￣１８
基金项目: 江苏省自然科学基金(ＢＫ２０１２３６２)
通讯作者: 张海峰ꎬ副教授ꎬ主要从事植物病原真菌分子生物学研究ꎻＴｅｌ: ０２５￣８４３９６４３６ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｈｆｚｈａｎｇ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 洪 丽ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事真菌遗传与分子生物学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ２０１１１０２０５７＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０３.００６
亚甲基四氢叶酸还原酶参与调控稻瘟病菌的
生长、发育和致病性
洪 丽ꎬ 杜 艳ꎬ 张海峰∗ꎬ张正光ꎬ 郑小波
(南京农业大学植物保护学院 /农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室ꎬ南京 ２１００９５)
摘要:稻瘟病菌(Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈ ｏｒｙｚａｅ)引起的稻瘟病是水稻上一种毁灭性病害ꎬ每年给全球水稻生产造成 １０％ ~ ３０％的产量
损失ꎬ严重威胁着全球的粮食生产安全ꎮ 从分子水平探究该病菌的致病机制ꎬ对于挖掘潜在的控制稻瘟病的药剂靶标具有
重要的理论和实践意义ꎮ 本研究在稻瘟病菌中鉴定到 ２个分别与酿酒酵母亚甲基四氢叶酸还原酶 Ｍｅｔ１２和 Ｍｅｔ１３同源的
蛋白ꎬ命名为 ＭｏＭｅｔ１２和 ＭｏＭｅｔ１３ꎮ ＭｏＭｅｔ１２和 ＭｏＭｅｔ１３分别含有 ６９０和 ６３１ 个氨基酸ꎬ两者的一致性为 ３２％ꎮ 对这 ２
个蛋白编码基因分别进行敲除突变ꎬ发现 ΔＭｏｍｅｔ１２和 ΔＭｏｍｅｔ１３突变体在 ＣＭ营养丰富培养基上生长减慢、气生菌丝减
少ꎮ ΔＭｏｍｅｔ１３在 ＭＭ 基本培养基上不能生长ꎬ在 ＳＤＣ 和 ＯＭ 营养饥饿培养基上生长显著减慢ꎬ气生菌丝稀薄ꎮ
ΔＭｏｍｅｔ１２在 ＭＭ、ＳＤＣ和 ＯＭ培养基上生长均显著减慢ꎻ对突变体进行产孢和致病性测定发现ꎬΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体在 ＣＭ
和 ＳＤＣ培养基上均丧失了产孢能力ꎬ而 ΔＭｏｍｅｔ１２在 ＣＭ 培养基上产孢量显著下降ꎬ在 ＳＤＣ 上产孢能力丧失ꎻΔＭｏｍｅｔ１３
突变体侵染菌丝扩展和致病力显著下降ꎬΔＭｏｍｅｔ１２突变体致病力与野生型比较无明显变化ꎮ 加入外源的甲硫氨酸可恢复
ΔＭｏｍｅｔ１２和 ΔＭｏｍｅｔ１３突变体在不同培养基上的生长和产孢缺陷ꎬ且能部分恢复 ΔＭｏｍｅｔ１３突变体的致病能力ꎮ 上述结
果表明ꎬＭｏＭｅｔ１２和 ＭｏＭｅｔ１３通过参与甲硫氨酸的生物合成ꎬ从而控制稻瘟病菌的生长和无性繁殖ꎮ ＭｏＭｅｔ１３ 同时是一
个重要的致病相关因子ꎬ参与病菌侵染菌丝的生长和致病过程ꎮ
关键词:稻瘟病菌ꎻ 亚甲基四氢叶酸还原酶ꎻ 甲硫氨酸ꎻ 无性繁殖ꎻ 致病力
Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈꎬ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ＨＯＮＧ Ｌｉꎬ ＤＵ Ｙａｎꎬ ＺＨＡＮＧ
Ｈａｉ￣ｆｅｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ￣ｇｕａｎｇꎬ ＺＨＥＮＧ Ｘｉａｏ￣ｂｏ (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ / Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ
Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｐｅｓｔ Ｉｎｓｅｃｔｓꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔꎬ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅꎬ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ ｆｕｎｇａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｒｉｃｅ
ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ. Ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗｉｌｌ ｈｅｌｐ ｔｏ ｆｉｎｄ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ
ｎｅｗ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅꎬ ａｎｄ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｗａｙ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｔｗｏ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ ＭｏＭｅｔ１２ ａｎｄ ＭｏＭｅｔ１３ ｉｎ Ｍ. ｏｒｙｚａｅꎬ ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍｅｔ１２ ａｎｄ Ｍｅｔ１３
ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄꎬ ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ６９１ ａｎｄ ６３２ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ａｎｄ ｓｈａｒｅｓ ３２％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ. Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏ￣
ＭＥＴ１２ ａｎｄ ＭｏＭＥＴ１３ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｅｒｉａｌ ｈｙｐｈａｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ＣＭ ｍｅｄｉａ.
ΔＭｏｍｅｔ１３ ｗａｓ ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｏｎ ＭＭ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｅｒｉａｌ ｈｙｐｈａｅ ｏｎ
ＯＭ ａｎｄ ＳＤＣ ｍｅｄｉａ. Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ΔＭｏｍｅｔ１２ ｗａｓ ａｌｓｏ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｏｎ ＭＭ、ＳＤＣ ａｎｄ ＯＭ
ｍｅｄｉａ. Ｆｕｒｔｈｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ΔＭｏｍｅｔ１３ ｌｏｓｔ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｏｎ ｂｏｔｈ ＣＭ ａｎｄ ＳＤＣ ｍｅｄｉａꎬ
ａｎｄ ΔＭｏｍｅｔ１２ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ ｏｎ ＣＭ ａｎｄ ｗａｓ ｕｎａｂｌｅ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｏｎ ＳＤＣ ｍｅｄｉａ.
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ΔＭｏｍｅｔ１３ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｈａｄ ａ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈｙｐｈａｌ ｇｒｏｗｔｈ.
３期 洪 丽ꎬ等:亚甲基四氢叶酸还原酶参与调控稻瘟病菌的生长、发育和致病性
Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｃｏｕｌｄ ｒｅｓｔｏｒｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ΔＭｏｍｅｔ１２ ａｎｄ ΔＭｏｍｅｔ１３ ｍｕｔａｎｔｓꎬ
ａｎｄ ａｌｓｏ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｃｕｅ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ ΔＭｏｍｅｔ１３. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＭｏＭｅｔ１２ ａｎｄ ＭｏＭｅｔ１３ ｈａｖｅ
ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｓｅｘｕａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅꎬ ａｎｄ
ＭｏＭｅｔ１３ ｉｓ ａ ｋｅｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈｙｐｈａｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈ ｏｒｙｚａｅꎻ ＭＴＨＦＲꎻ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅꎻ ａｓｅｘｕａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
中图分类号: Ｓ４３５.１１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０３￣０２７０￣１０
亚甲基四氢叶酸还原酶(ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ￣
ｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅꎬ ＭＴＨＦＲ)催化 ５ꎬ１０￣亚甲基四氢叶
酸 ( ＣＨ２￣ＴＨＦ) 还原为 ５￣甲基四氢叶酸 ( ＣＨ３￣
ＴＨＦ)ꎬ而 ５￣甲基四氢叶酸是甲硫氨酸合成过程中
必需的[１]ꎮ 在人体中ꎬＭＴＨＦＲ 缺乏是叶酸代谢最
常见的遗传缺陷ꎬ导致高同型半胱氨酸血症和高胱
氨酸尿症[１~３]ꎮ 此外ꎬＭＴＨＦＲ 的缺陷引起同型半
胱氨酸的升高ꎬ还会增加血管疾病和神经管疾病的
风险[１ꎬ４]ꎮ 很多物种包括细菌、真菌、植物和哺乳
动物都含有 ＭＴＨＦＲｓꎬ其中有些生物的 ＭＴＨＦＲｓ
功能已研究得比较清楚[５]ꎮ 在大多数真菌中ꎬ有 ２
个编码 ＭＴＨＦＲ的基因ꎬ如酿酒酵母(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ￣
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)和禾谷镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａ￣
ｒｕｍ)的 ＭＴＥ１２ 和 ＭＥＴ１３ꎻ粟酒裂殖酵母(Ｓｃｈｉｚｏｓ￣
ａｃｃｈａｒｏｍｖｃｅｓ ｐｏｍｂｅ)的 ＭＥＴ１１ 和 ＭＥＴ９[５]ꎻ构巢
曲霉(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ)的 ＭＥＴＡ 和 ＭＥＴＦꎮ 在
酿酒酵母中ꎬ缺失 ＭＥＴ１３ 导致甲硫氨酸营养缺陷
型ꎬ而缺失 ＭＥＴ１２ 并未有此表型ꎮ 而在构巢曲霉
中ꎬ缺失 ＭＥＴＦ (ＭＥＴ１３ 的同源基因)或 ＭＥＴＡ
(ＭＥＴ１２ 的同源基因)均导致甲硫氨酸营养缺
陷[６]ꎮ 与构巢曲霉相似ꎬ缺失禾谷镰刀菌的 Ｆｇ￣
ＭＥＴ１３或 ＦｇＭＥＴ１２ 均导致甲硫氨酸营养缺陷并
影响色素的合成[７]ꎮ 但是ꎬ关于 ＭＥＴＨＦｓ 在病原
真菌产孢及致病中作用机理的研究尚少ꎮ
稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻生产上最具破
坏性的病害之一[８]ꎮ 稻瘟病菌的侵染由分生孢子
附着在水稻叶表面开始ꎬ分生孢子萌发形成的附着
胞是该病菌重要的侵染结构ꎬ在自然条件下该结构
对该病菌成功侵染寄主是必需的ꎮ 附着胞在分化
过程中产生巨大的膨压迫使侵入钉穿透水稻角质
层从而成功进入植物组织内部ꎮ 稻瘟病菌是半活
体营养寄生菌ꎬ在侵染早期并不杀死寄主细
胞[９ꎬ１０]ꎮ 在侵染后期ꎬ由于大量侵染菌丝的生长ꎬ
寄主细胞会被杀死ꎬ５~７ ｄ后产生典型的稻瘟病病
斑ꎮ 病斑上产生大量的分生孢子梗和分生孢子ꎬ引
起再侵染[１１~１３]ꎮ 稻瘟病菌目前已成为研究植物与
病原物互作的模式生物ꎮ 在过去 ２０ 多年中ꎬ人们
对很多参与调控稻瘟病菌生长、产孢、附着胞形成、
侵入及致病性的信号途径、代谢途径的相关基因进
行了鉴定和研究ꎬ但是ꎬ对氨基酸代谢途径在该病
菌的生长发育及致病过程中的调控机制研究相对
较少ꎮ 目前ꎬ只有少数几个与氨基酸代谢相关的基
因被鉴定ꎮ 本研究室近期发现ꎬ乙酰乳酸合成酶
ＭｏＩｌｖ２和 ＭｏＩｌｖ６主要通过参与亮氨酸、异亮氨酸
和缬氨酸的生物合成调控稻瘟病菌的生长、产孢、
侵染菌丝生长及致病性等生物学过程[１４]ꎮ 此外ꎬ
有报道表明胱硫醚 β￣裂解酶编码基因 ＭｏＳＴＲ３ 参
与甲硫氨酸的生物合成ꎬ缺失该基因导致病菌出现
甲硫氨酸营养缺陷并影响侵染菌丝的扩展[１５]ꎮ
本研究中ꎬ我们在稻瘟病菌中鉴定到 ２个编码
亚甲基四氢叶酸还原酶的基因 ＭｏＭＥＴ１２ 和
ＭｏＭＥＴ１３ꎬ缺失ＭｏＭＥＴ１３导致病菌出现甲硫氨酸
营养缺陷型ꎬ且两者的缺失突变体均生长减慢、气
生菌丝减少、在 ＳＤＣ 培养基上产孢能力丧失ꎮ 致
病性测定发现ꎬＭｏＭＥＴ１３ 是该病菌致病性必需的
基因ꎬ但缺失 ＭｏＭＥＴ１２ 对其致病能力没有影响ꎮ
添加外源的甲硫氨酸能够完全恢复 ΔＭｏｍｅｔ１２ 和
ΔＭｏｍｅｔ１３突变体的生长和产孢缺陷、部分恢复
ΔＭｏｍｅｔ１３的致病性缺陷ꎮ 研究结果有助于深入
了解稻瘟病菌的致病分子机理ꎬ将为新型杀菌剂的
开发提供潜在的靶标位点ꎮ
１ 材料与方法:
１.１ 供试菌株及培养条件
稻瘟病菌野生型菌株 Ｇｕｙ１１ 由本实验室保
存ꎬΔＭｏｍｅｔ１３、ΔＭｏｍｅｔ１２ 突变体及互补菌株均为
本研究获得ꎮ 所有菌株在完全培养基(ＣＭ:ｃｏｍ￣
ｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ)上活化ꎬ于 ２８℃黑暗培养[１６]ꎮ 大肠
杆菌菌株 ＤＨ５α用于细菌转化ꎬ３７℃培养于 ＬＢ 培
１７２
植物病理学报 ４５卷
养基ꎮ 酵母菌株 ＸＫ１￣２５ 用于互补载体的构建ꎬ
３０℃培养于 ＹＰＤ培养基ꎮ
１.２ 分生孢子的产生及附着胞的形成
切取 ３×３ ｍｍ 大小的野生型 Ｇｕｙ１１、突变体及
互补菌株的菌丝块ꎬ接种至 ＳＤＣ[１７] 平板中央ꎬ
２８℃、黑暗培养 ７ ｄ 后置于黑光灯下连续光照 ３ ｄ
诱导产孢ꎮ 用 ４ ｍＬ无菌水收集孢子ꎬ二层擦镜纸
过滤后显微镜下统计产孢量ꎮ 每次试验至少 ３ 个
重复ꎬ试验重复 ３次ꎬ结果取平均值ꎮ
１.３ 致病性测定
大麦和水稻菌丝丛离体接种:将在 ＣＭ液体培
养基中培养 ２ ｄ 的菌丝丛(添加或不添加甲硫氨酸
溶液)分别接种于离体的大麦和水稻叶片上ꎬ黑暗
培养 ２４ ｈ后置于 １２ ｈ 光照 / １２ ｈ 黑暗交替培养ꎬ
５ ｄ 后观察结果并拍照ꎮ
水稻喷雾接种:将在 ＣＭ平板上活化的菌株分
别接种到添加了 １ ｍＭ 和 ５ ｍＭ 甲硫氨酸的 ＳＤＣ
平板上诱导产孢ꎬ收集分生孢子ꎬ用含有 ０.２５％的
明胶溶液将分生孢子浓度调到 ５×１０４个ｍＬ－１ꎬ然
后将孢子悬浮液均匀地喷洒到生长 ２ 周的水稻叶
片上ꎮ 保湿培养 ７ ｄ 后观察结果ꎮ 每菌株至少使
用 ３０株水稻幼苗ꎬ试验至少重复 ３次ꎮ
孢子液梯度稀释接种:剪取生长 ７ ｄ 大麦叶片
平铺于水琼脂平板上ꎬ将收集到的分生孢子浓度调
至 １.０×１０５个ｍＬ－１ꎬ并依次稀释至 １.０×１０４个
ｍＬ－１和 １.０×１０３个ｍＬ－１ꎬ各添加 ０.２５％的明胶ꎬ
分别吸取 ２０ μＬ上述不同浓度的孢子悬浮液滴于
大麦叶片上ꎬ保湿培养ꎬ５ ｄ后观察结果ꎮ
水稻根部接种:参照 Ｔｕｃｋｅｒ 等的方法[１８]ꎮ 将
供试水稻种子经 ２％次氯酸钠浸泡 １０ ｍｉｎꎬ然后用
无菌水反复冲洗种子ꎮ 将约 ３０ ｍＬ 的潮湿无菌蛭
石装入 ５０ ｍＬ 无菌离心管中ꎬ切取 ４ ~ ５ 块适量大
小的菌丝块ꎬ均匀的置于蛭石上ꎬ再用约 ５ ｍＬ 蛭石
覆盖ꎬ取 ４ ~ ５ 粒已消毒的种子置于第二层蛭石表
面ꎬ再用约 ５ ｍＬ蛭石覆盖种子ꎬ用封口膜将管口密
封ꎮ 置于 ２８℃ꎬ光暗交替培养(１６ ｈ 光照 / ８ ｈ 黑
暗)ꎬ１０ ｄ后观察结果并拍照ꎬ试验至少重复 ３次ꎮ
１.４ 载体构建和真菌转化
ＭｏＭＥＴ１２、ＭｏＭＥＴ１３ 敲除载体的构建参照
Ｚｈａｎｇ等的方法[１７]ꎮ 根据稻瘟病菌全基因组数据
库中 ＭｏＭＥＴ１２ 和 ＭｏＭＥＴ１３ 基因两侧的 ＤＮＡ 序
列ꎬ选取这两个基因开放阅读框上、下游各 １ ｋｂ 的
序列作为同源重组的上、下臂构建基因敲除载体ꎮ
将测序正确的质粒用于稻瘟病菌的原生质体转化ꎮ
稻瘟病菌转化参照 Ｔａｌｂｏｔ的方法[１９]ꎮ
１.５ 基因组提取和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析
基因组 ＤＮＡ 的提取参照 Ｔａｌｂｏｔ 的方法[１９]ꎮ
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析:分别提取野生型 Ｇｕｙ１１ 和候选
敲除转化子的基因组 ＤＮＡꎬ用 Ｋｐｎ Ｉ 进行酶切消
化ꎮ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 具体过程参照罗氏地高辛标记
及检测试剂盒(Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ｐｅｎｚｂｅｒｇꎬ
Ｇｅｒｍａｎｙ)操作手册ꎮ
１.６ 生物学表型测定
从活化的菌落边缘切取 ３×３ ｍｍ 大小的菌丝
块接种于平板中央 (添加或不添加外源甲硫氨
酸)ꎬ以 Ｇｕｙ１１ 为对照ꎬ２８℃黑暗培养 ７ ｄꎬ测量菌
落直径并拍照ꎮ 每次设 ３ 个重复ꎬ试验重复 ３ 次ꎬ
结果取平均值ꎮ 所使用的 ４种培养基分别为:完全
培养基 (ＣＭ)、基本培养基 (ＭＭ)、燕麦培养基
(ＯＭ)和产孢培养基(ＳＤＣ)ꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＭｏＭＥＴ１２ 和 ＭｏＭＥＴ１３ 基因的鉴定与突
变体的获得
对稻瘟病菌全基因组数据库[２０]进行 ＢＬＡＳＴＰ
比对ꎬ分别鉴定到与酵母亚甲基四氢叶酸还原酶编
码基因 ＭＥＴ１２ 和 ＭＥＴ１３ 同源的基因 ＭＧＧ ＿
０８１７１.７ 和 ＭＧＧ＿０１７２８.７ꎬ分别命名为 ＭｏＭＥＴ１２
和 ＭｏＭＥＴ１３ꎮ ＭｏＭＥＴ１２全长 ２ ０７３ ｂｐꎬ编码一个
６９０个氨基酸的蛋白ꎮ ＭｏＭＥＴ１３全长 １ ９６３ ｂｐꎬ含
有一个 ６７ ｂｐ内含子ꎬ编码一个 ６３１ 个氨基酸的蛋
白ꎮ 对这两个蛋白的结构域进行预测发现ꎬ
ＭｏＭｅｔ１２和 ＭｏＭｅｔ１３ 均含有一个保守的 ＭＴＨＦＲ
结构域(图 １)ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭｏＭｅｔ１２ ａｎｄ
ＭｏＭｅｔ１３
２７２
３期 洪 丽ꎬ等:亚甲基四氢叶酸还原酶参与调控稻瘟病菌的生长、发育和致病性
为了进一步揭示 ＭｏＭＥＴ１２和 ＭｏＭＥＴ１３基因
在稻瘟病菌中的生物学功能ꎬ根据同源重组原理对
这 ２个基因分别进行敲除突变ꎮ 敲除载体的构建
策略如图 ２￣Ａ所示ꎮ 采用 ＰＥＧ介导的原生质体转
化法获得具有潮霉素抗性的转化子ꎮ 利用探针引
物对转化子进行 ＰＣＲ 验证ꎬ分别获得多个候选敲
除突变体ꎮ 进一步对候选突变体进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
ｂｌｏｔ验证ꎬ结果显示ꎬ以目标基因 ＤＮＡ片段为探针
(ｐｒｏｂｅ １: ＭｏＭＥＴ１３ 基因片段ꎻ ｐｒｏｂｅ ３: ＭｏＭＥＴ
１２基因片段)ꎬ野生型菌株能检测到目的条带ꎬ而
候选敲除突变体检测不到目的条带ꎻ相反ꎬ以 ＨＰＨ
基因为探针(ｐｒｏｂｅ ２)ꎬ候选敲除突变体中检测到
目的条带ꎬ而野生型菌株检测不到目的条带(图
２￣Ｂ)ꎮ 上述结果表明ꎬＭｏＭＥＴ１２ 和 ＭｏＭＥＴ１３ 基
因在野生型 Ｇｕｙ１１中均被成功敲除ꎮ 同时ꎬＳｏｕｔｈ￣
ｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示ꎬＭｏＭＥＴ１２ 和 ＭｏＭＥＴ１３ 基因在
稻瘟病菌全基因组中都只存在一个拷贝ꎮ
２.２ ＭｏＭＥＴ１２ 和 ＭｏＭＥＴ１３ 参与稻瘟病菌的
菌丝生长和营养应答
为了阐明 ＭｏＭＥＴ１２和 ＭｏＭＥＴ１３基因在稻瘟
病菌生长过程中的作用ꎬ将野生型菌株 Ｇｕｙ１１、
ΔＭｏｍｅｔ１２、ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体菌株及 ΔＭｏｍｅｔ１３ 突
变体互补菌株分别接种到 ＣＭ、ＭＭ、ＯＭ 和 ＳＤＣ
平板上ꎬ置于 ２８℃、黑暗下培养 ７ ｄ 后观察各菌株
生长情况并测量其直径ꎮ 结果发现ꎬ与野生型比
较ꎬΔＭｏｍｅｔ１２和 ΔＭｏｍｅｔ１３突变体在 ＣＭ营养丰富
培养基上生长减慢、气生菌丝减少ꎻΔＭｏｍｅｔ１３ 在
ＭＭ基本培养基上不能生长ꎬ在 ＳＤＣ 和 ＯＭ 营养
饥饿培养基上生长显著减慢ꎬ气生菌丝稀薄ꎮ
ΔＭｏｍｅｔ１２在 ＭＭ、ＳＤＣ和 ＯＭ培养基上生长均显
著减慢 (图 ３￣Ａ、Ｂ)ꎮ 上述结果表明ꎬＭｏＭＥＴ１２和
ＭｏＭＥＴ１３基因参与调控稻瘟病菌的菌丝生长和营
养应答ꎮ
２.３ ＭｏＭＥＴ１２ 和 ＭｏＭＥＴ１３ 参与甲硫氨酸的
生物合成
在酵母菌中ꎬＭＥＴ１２ 和 ＭＥＴ１３ 参与甲硫氨酸
的生物合成[５]ꎮ 本文发现稻瘟病菌的 ΔＭｏｍｅｔ１２
和 ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体具有营养依赖性ꎮ 为验证
ＭｏＭＥＴ１２和 ＭｏＭＥＴ１３是否与酵母的同源物具有
相似的功能ꎬ将野生型菌株 Ｇｕｙ１１、 ΔＭｏｍｅｔ１２、
ΔＭｏｍｅｔ１３突变体及 ΔＭｏｍｅｔ１３突变体互补菌株分
别接种到外源添加了 １ ｍＭ 和 ５ ｍＭ 甲硫氨酸的
ＣＭ、ＭＭ、ＯＭ和ＳＤＣ平板上ꎬ２８℃、黑暗培养７ ｄ后
Ｆｉｇ. ２ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ (Ａ) ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆ ＭｏＭＥＴ１３ ａｎｄ ＭｏＭＥＴ１２ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ (Ｂ)
３７２
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ３ Ｃｏｌｏｎｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ (Ａ) ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ (Ｂ) ｏｆ ｔｅｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ
Ａｓｔｅｒｉｓｋ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ａｔ Ｐ<０.０１.
Ｆｉｇ. ４ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｅｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ １ ｍＭ ａｎｄ ５ ｍＭ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ
观察各菌株生长情况并测量其直径ꎮ 结果显示ꎬ
ΔＭｏｍｅｔ１２和 ΔＭｏｍｅｔ１３突变体的生长速率和气生
菌丝缺陷均得到了明显恢复ꎬ且在含高浓度
(５ ｍＭ)甲硫氨酸的平板中均能恢复到野生型状
态(图 ４)ꎮ 进一步将上述添加了甲硫氨酸的 ＳＤＣ
平板置于黑光灯下诱导产孢发现ꎬΔＭｏｍｅｔ１２ 和
ΔＭｏｍｅｔ１３突变体的产孢量均显著提高ꎬ且在高浓
度(５ ｍＭ)甲硫氨酸条件下能恢复到野生型水平
(图 ５)ꎮ 上述结果表明ꎬＭｏＭＥＴ１２ 和 ＭｏＭＥＴ１３
通过参与甲硫氨酸的生物合成ꎬ从而影响稻瘟病菌
的营养生长和无性繁殖ꎮ
在植物和部分细菌中ꎬ甲硫氨酸只能由半胱氨
酸催化合成ꎬ而在真菌中甲硫氨酸可同时通过半胱
氨酸和同型半胱氨酸催化合成[８]ꎮ 为阐明稻瘟病
菌中的甲硫氨酸是否由同型半胱氨酸催化合成ꎬ将
野生型 Ｇｕｙ１１、ΔＭｏｍｅｔ１２ 和 ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体及
互补菌株接种到分别添加了 １ ｍＭ 甲硫氨酸和
１ ｍＭ同型半胱氨酸的 ＭＭ 平板中ꎬ黑暗培养 ７ ｄ
后观察菌落生长情况并测量直径ꎮ 结果显示ꎬ在含
有同型半胱氨酸的培养基中ꎬΔＭｏｍｅｔ１２突变体的
４７２
３期 洪 丽ꎬ等:亚甲基四氢叶酸还原酶参与调控稻瘟病菌的生长、发育和致病性
Ｆｉｇ. ５ Ｃｏｎｉｄｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｎ ＳＤＣ ｐｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ １ ｍＭ ｏｒ ５ ｍＭ ｍｅｔｈｉｎｉｏｎｅ
Ｆｉｇ. ６ Ｃｏｌｏｎｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ (Ａ) ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ (Ｂ) ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ
ｏｎ ＭＭ ｐｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ＤＬ￣ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ (Ｍｅｔ)
Ａｓｔｅｒｉｓｋ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ (Ｐ<０.０１) .
生长恢复到了野生型状态ꎬ而 ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体不
能生长ꎮ 同时ꎬ 在含有甲硫氨酸培养基中ꎬ
ΔＭｏｍｅｔ１２突变体和 ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体能均恢复
到野生型状态(图 ６)ꎮ 该结果表明ꎬ在稻瘟病菌
中ꎬＭｏＭＥＴ１３参与了同型半胱氨酸催化合成甲硫
氨酸的过程ꎬＭｏＭＥＴ１２不参与该过程ꎮ
２.４ ＭｏＭＥＴ１３参与稻瘟病菌的致病过程
由于突变体 ΔＭｏｍｅｔ１２ 和 ΔＭｏｍｅｔ１３ 均不产
生分生孢子ꎬ我们采用菌丝丛离体接种大麦及水稻
叶片进行致病性测定ꎮ 结果显示:ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变
体不能引起大麦和水稻叶片发病ꎬ而野生型、
ΔＭｏｍｅｔ１２和互补菌株可导致其发病并形成典型
病斑ꎮ 外源添加不同浓度的甲硫氨酸不能互补突
变体 ΔＭｏｍｅｔ１３ 在大麦及水稻叶片上的致病性
(图 ７￣Ａ、 Ｂ )ꎮ 外源 添 加 甲 硫 氨 酸 后ꎬ 采 用
ΔＭｏｍｅｔ１２ 和 ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体产生的分生孢子
分别喷雾和点滴水稻和大麦叶片进行致病性测定ꎬ
结果发现 ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体在水稻和大麦上的致
病力均显著下降ꎬ而 ΔＭｏｍｅｔ１２与野生型没有明显
差别(图 ７￣Ｃ、Ｄ)ꎮ 进一步在 ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体的
分生孢子悬浮液中添加 １ ｍＭ 甲硫氨酸进行大麦
点滴实验ꎬ发现突变体的致病力得到了部分恢复
(图 ７￣Ｄ)ꎮ 上述结果表明:ＭｏＭＥＴ１３ 不仅参与甲
硫氨酸的合成ꎬ而且参与稻瘟病菌的致病过程ꎬ而
ＭｏＭＥＴ１２不参与该病菌的致病过程ꎬ仅参与甲硫
氨酸的生物合成过程ꎮ
有报道表明ꎬ稻瘟病菌除了侵染寄主叶片外ꎬ
还能侵染根部ꎮ 参照 Ｄｕｆｒｅｓｎｅ等的方法[２１]将菌丝
块接种水稻根部ꎬ进行活体侵染实验ꎮ 结果发现
ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体不能引起水稻根部发病ꎬ而
ΔＭｏｍｅｔ１２突变体、野生型和互补菌株都能正常侵
染引起水稻根部发病(图 ８)ꎮ 该结果表明ꎬＭｏ￣
ＭＥＴ１３不仅参与稻瘟病菌的叶片侵染过程ꎬ同时
还参与根部侵染过程ꎮ
５７２
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ７ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ ｏｎ ｂａｒｌｅｙ ａｎｄ ｒｉｃｅ ｌｅａｖｅｓ
Ａ: Ｄｅｔａｃｈｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｏｎ ｂａｒｌｅｙ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｔｈ ｍｙｃｅｌｉａ ｍａｔｓꎻ Ｂ: Ｄｅｔａｃｈｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｏｎ ｒｉｃｅ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｔｈ ｍｙｃｅｌｉａ ｍａｔｓꎻ
Ｃ: Ｓｐｒａｙｉｎｇ ａｓｓａｙ ｏｎ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｃｏｎｉｄｉａꎻ Ｄ: Ｄｅｔａｃｈｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ａｓｓａｙ ｏｎ ｂａｒｌｅｙ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｃｏｎｉｄｉａ ｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｃｏｎｉｄｉａ ｗｉｔｈ １ ｍＭ Ｍｅｔ.
Ｆｉｇ. ８ Ｒｉｃｅ ｒｏｏｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ
Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ ８ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
６７２
３期 洪 丽ꎬ等:亚甲基四氢叶酸还原酶参与调控稻瘟病菌的生长、发育和致病性
Ｆｉｇ. ９ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ (Ａ) ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ (Ｂ) ａｓｓａｙｓ ｏｎ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ａｎｄ ｂａｒｌｅｙ ｅｐｉｄｅｒｍａｌｓ
Ｔｙｐｅ １: Ｎｏ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｐｅｇꎻ Ｔｙｐｅ ２: Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｈｙｐｈａｅ ｗｉｔｈ ｎｏ ｂｒａｎｃｈꎻ Ｔｙｐｅ ３: Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｈｙｐｈａｅ ｗｉｔｈ １￣４ ｂｒａｎｃｈｅｓꎻ
Ｔｙｐｅ ４: Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｈｙｐｈａｅ ｗｉｔｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ４ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｏｎｅ ｃｅｌｌ.
２.５ ＭｏＭＥＴ１３参与稻瘟病菌侵染菌丝的生长
进一步采用叶鞘注射接种法进行致病性测定
发现ꎬ与野生型 Ｇｕｙ１１ 比较ꎬΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体的
病斑显著减少ꎬ致病力显著下降ꎻ而 ΔＭｏｍｅｔ１３ 与
野生型无明显差别(图 ９Ａ)ꎮ 为揭示 ΔＭｏｍｅｔ１３突
变体致病力下降的原因ꎬ将分生孢子悬浮液接种于
大麦表皮上ꎬ２４ ｈ 分别观察野生型和突变体的附
着胞形成及侵入情况ꎮ 结果发现ꎬ突变体与野生型
一样均能在大麦表皮上形成附着胞ꎬ但 ΔＭｏｍｅｔ１３
突变体 ８０％的附着胞不能侵入寄主细胞ꎬ且侵入
的附着胞侵染菌丝在大麦细胞内的扩展能力显著
下降ꎬ侵染菌丝分支减少且局限于一个细胞内ꎮ 相
反ꎬ野生型和 ΔＭｏｍｅｔ１２突变体 ９５％的附着胞均能
侵入植物细胞ꎬ且 ７８％的侵染菌丝能形成多个分
支并迅速扩展到相邻细胞中(图 ９Ｂ、９Ｃ)ꎮ 上述结
果表明ꎬΔＭｏｍｅｔ１３突变体致病力的下降是由于其
附着胞侵入率下降及侵染菌丝扩展受到抑制所引
起的ꎮ ＭｏＭＥＴ１３参与了稻瘟病菌侵染菌丝的生长
过程ꎮ
３ 讨论
ＭＴＨＦＲ的主要作用是在叶酸代谢通路中将
５ꎬ１０￣亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的
５￣甲基四氢叶酸ꎬ后者随后进入甲基传递通路ꎬ为
同型半胱氨提供甲基形成甲硫氨酸ꎮ ＭＴＨＦＲ 是
人体叶酸代谢中的一个重要的酶ꎮ 大多数真菌ꎬ包
括酵母和丝状真菌均含有两种类型的 ＭＴＨＦＲｓꎮ
在本研究中ꎬ通过同源比对在稻瘟病菌全基因
组数据库中分别鉴定到酿酒酵母 Ｍｅｔ１２ 和 Ｍｅｔ１３
的同源蛋白编码基因 ＭｏＭＥＴ１２ 和 ＭｏＭＥＴ１３ꎮ 缺
７７２
植物病理学报 ４５卷
失 ＭｏＭＥＴ１３ 导致甲硫氨酸营养缺陷型ꎬ缺失 Ｍｏ￣
ＭＥＴ１２ 在不含甲硫氨酸的 ＭＭ 培养基中生长缓
慢ꎬ表明这 ２个基因都参与了稻瘟病菌的甲硫氨酸
合成ꎮ 此外ꎬＭｏＭＥＴ１３ 还参与调控稻瘟病菌的产
孢、附着胞侵入、侵染菌丝生长及致病过程ꎬ而缺失
ＭｏＭＥＴ１２仅只导致产孢能力丧失ꎮ 表明ꎬ在稻瘟
病菌中ꎬＭｏＭＥＴ１３ 和 ＭｏＭＥＴ１２ 分别行使不同的
生物学功能ꎮ ＭｏＭＥＴ１３ 主要调控细胞的 ＭＴＨＦＲ
活性ꎬ参与甲硫氨酸的生物合成ꎬ影响病菌的生长
和无性繁殖ꎮ 此外ꎬ外源添加甲硫氨酸只能部分恢
复 ΔＭｏｍｅｔ１３ 突变体的致病能力ꎬ表明 ＭｏＭＥＴ１３
还参与了独立于甲硫氨酸代谢途径的其它途径来
影响病菌与侵染相关的生物学过程ꎮ
在酿酒酵母中ꎬ缺失 Ｍｅｔ１３ 导致甲硫氨酸营
养缺陷和ＭＴＨＦＲ活性丧失ꎬ而Ｍｅｔ１２维持约 １５％
的 ＭＴＨＦＲ 活性[１]ꎮ 同样ꎬ在粟酒裂殖酵母中ꎬ
ＭＴＨＦＲ活性分析表明ꎬＭｅｔ９ (Ｍｅｔ１３同源物)主要
负责调控 ＭＴＨＦＲ 活性[５]ꎮ 在构巢曲霉中ꎬ缺失
ＭｅｔＦ (Ｍｅｔ１３同源物)或 ＭｅｔＡ (Ｍｅｔ１２ 同源物)均
导致甲硫氨酸营养缺陷型[６]ꎮ 酶活性分析表明ꎬ
ＭＥＴＡ编码的酶仅具有 １０％~１５％的总 ＭＴＨＦＲ活
性[６]ꎮ 与 ｍｅｔＡ突变体不同ꎬＭＥＴＦ 缺失至少需要
外源添加 １ ｍＭ 甲硫氨酸才能恢复其生长和产孢ꎮ
此外ꎬ外源添加同型半胱氨酸可恢复 ｍｅｔＡ 的表型
而不能恢复 ｍｅｔＦ 突变体的表型[６]ꎮ 在禾谷镰刀
菌中ꎬ缺失两个 ＭＴＨＦＲ 编码基因ꎬＦｇＭＥＴ１３ 和
ＦｇＭＥＴ１２均导致甲硫氨酸营养缺陷型[７]ꎮ 然而ꎬ
与构巢曲霉不同ꎬ外源加入同型半胱氨酸无法恢复
突变体的营养缺陷ꎮ 这些研究表明ꎬＭＴＨＦＲ１ 对
维持细胞的 ＭＴＨＦＲ 活性具有更重要的作用ꎬ且
ＭＴＨＦＲ１和 ＭＴＨＦＲ２ 可能具有重叠的催化功能ꎮ
在本研究中ꎬ甲硫氨酸而非同型半胱氨酸可以恢复
ΔＭｏｍｅｔ１３突变体的营养缺陷型ꎬ而同型半胱氨酸
可部分恢复 ΔＭｏｍｅｔ１２突变体的生长缺陷ꎬ表明稻
瘟病菌与构巢曲霉在调控甲硫氨酸生物合成过程
中具有相似的机制ꎬ而与禾谷镰刀菌具有不同的调
控机制ꎮ 而在 Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ (原生动物寄生
虫)中ꎬＬｍＭＴＨＦＲ 基因缺失突变体在甲硫氨酸限
制的条件下生长不良ꎬ且外源半胱氨酸不能恢复其
生长ꎬ但突变体仍对小鼠具有较强的毒性[２２]ꎮ 迄
今为止ꎬ对植物病原真菌 ＭＴＨＦＲ基因对毒力的作
用报道尚少ꎮ 最近有报道显示ꎬＭＴＨＦＲ 参与丝状
真菌色素生物合成的质膜氧化还原系统[２３]ꎮ 禾谷
镰刀菌的 ＦｇＭＥＴ１３ 或 ＦｇＭＥＴ１２ 参与病菌色素的
生物合成[７]ꎮ 但 ＭＴＨＦＲ 在稻瘟病菌中的生物学
功能尚未见报道ꎮ
在本研究中ꎬ我们鉴定并分析了稻瘟病菌 ２ 个
ＭＴＨＦＲｓ编码基因 ＭｏＭＥＴ１２和 ＭｏＭＥＴ１３的生物
学功能ꎮ 发现 ＭｏＭＥＴ１２和 ＭｏＭＥＴ１３通过参与甲
硫氨酸生物合成ꎬ影响稻瘟病菌的生长和无性繁
殖ꎮ 此外ꎬ还发现 ＭｏＭＥＴ１３对稻瘟病菌附着胞的
侵入、侵染菌丝生长及致病性具有重要的调控作
用ꎮ 我们的研究结果与近期报道的 ＭｏＭＥＴ１２ / １３
结果一致[２４]ꎮ 研究结果对阐明稻瘟病菌的致病分
子机理具有重要的理论意义ꎬ同时对开发针对以甲
硫氨酸生物合成途径关键基因为靶标的新型杀菌
剂靶标具有重要的参考价值ꎮ
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８７２
３期 洪 丽ꎬ等:亚甲基四氢叶酸还原酶参与调控稻瘟病菌的生长、发育和致病性
ｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ ａｒｅ ｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ [ Ｊ] .
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[１８] Ｔｕｃｋｅｒ Ｓ Ｌꎬ Ｂｅｓｉ Ｍ Ｉꎬ Ｇａｌｈａｎｏ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｍｍｏｎ ｇｅ￣
ｎｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｏｒｇａｎ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ￣ｒｅｌａｔｅｄ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ
２０１０ꎬ ２２: ９５３－９７２
[１９] Ｔａｌｂｏｔ Ｎ Ｊ. Ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｉｌ ｏｆ ａ ｃｅｒｅａｌ ｋｉｌｌｅｒ: Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ
ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ [Ｊ] . Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００３ꎬ ５７: １７７－２０２.
[２０] Ｄｅａｎ Ｒ Ａꎬ Ｔａｌｂｏｔ Ｎ Ｊꎬ Ｅｂｂｏｌｅ Ｄ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ
[Ｊ] . Ｎａｔｕｒｅꎬ ２００５ꎬ ４３４: ９８０－９８６.
[２１] Ｄｕｆｒｅｓｎｅ Ｍꎬ Ｏｓｂｏｕｒｎ Ａ Ｅ. Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ
ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２００１ꎬ １４(３): ３００－３０７.
[２２] Ｖｉｃｋｅｒｓ Ｔ Ｊꎬ Ｏｒｓｏｍａｎｄｏ Ｇꎬ ｄｅ ｌａ Ｇａｒｚａ Ｒ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａ￣
ｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ
ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ ２００６ꎬ
２８１: ３８１５０－３８１５８.
[２３] Ｍａｌｚ Ｓꎬ Ｇｒｅｌｌ Ｍ Ｎꎬ Ｔｈｒａｎｅ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ａ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｕｒｏ￣
ｆｕｓａｒｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘ
[Ｊ] . Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００５ꎬ ４２: ４２０ －
４３３.
[２４] Ｙａｎ Ｘꎬ Ｑｕｅ Ｙ Ｗꎬ Ｗａｎｇ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ＭＥＴ１３
ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ － ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ
ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ [Ｊ] . ＰＬｏＳ Ｏｎｅꎬ ２０１３ꎬ ８:
ｅ７６９１４.
责任编辑:李晖
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