全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$江苏省自然科学基金"
12!"#%"+#$
#&农业部公益性行业"农业#科研专项"
!"#)"%"%!
#
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作者简介$陈龙正"
#3&"
#!男!博士!副研究员!主要从事蔬菜遗传育种研究
4(56.7
$
789:;0
!-
66/*69*90
!!"
通信作者$袁希汉!研究员!主要从事蔬菜遗传育种研究
4(56.7
$
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#,%*9?5
不结球白菜抗根肿病渐渗系的分子辅助选育
陈龙正!徐
!
海!宋
!
波!袁希汉"
"江苏省农业科学院 蔬菜研究所!南京
!#""#)
#
摘
!
要$该研究基于与大白菜抗根肿病连锁的分子标记!设计特异引物!获得简便实用的
@ABC
标记!并用于分子
标记辅助选择!创制不结球白菜抗根肿病新材料结果发现!在设计的
&
对特异引物中!有
#
对特异引物在抗(感
亲本间表现出多态性
D
!
群体验证发现!该标记与已有
@@C
标记及根肿病抗性共分离!能够用于抗根肿病鉴定!
定名为
ACE(C(!$
通过亚种间杂交并回交!利用标记
ACE(C(!$
辅助选择将大白菜根肿病抗性转入不结球白菜
中!获得抗根肿病不结球白菜渐渗系材料
FG#)(#(#$

关键词$不结球白菜&抗根肿病&
@ABC
标记&辅助选择
中图分类号$
G+&3
!!!
文献标志码$
B
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.
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56UZ;U6//./R;X(/;7;9R.?0
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不结球白菜 "
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V
*&+%,),-
$%$
#起源于中国!是国内尤其是南方重要的绿叶菜
之一根肿病是由芸薹根肿菌"
./#$01%0
(
+0"#
2"#$$%&#)Y?U?0.0
#侵染引起的一种世界性病害
以往关于抗根肿病的研究主要集中在大白菜和甘蓝
上)#(!*!近年来!由于不结球白菜栽培效益好!复种指
数高!土传病害逐渐成为制约不结球白菜发展的重
要因素!根肿病由过去不常见的病害逐渐显露出来!
并呈蔓延趋势然而!由于不结球白菜抗根肿相关
研究起步较晚!目前国内外还未发现不结球白菜根
肿病抗源通过种间或亚种间渐渗杂交可以为育种
提供新的种质资源!目前已在多种作物上建立起了
不同类型的渐渗系!如小麦)%*(棉花)*(水稻)$*(玉
米),*等主要大田作物!在这些作物上已经获得能够
直接用于作物品种改良的遗传稳定的渐渗系
大白菜与不结球白菜之间的亚种间杂交亲和性
较高!因此!可通过将大白菜抗根肿病基因导入不结
球白菜!提高不结球白菜根肿病抗性但是!一方面
种间杂交往往导致性状的剧烈分离而不易选择!另
一方面由于根肿病为土传病害!易受环境影响!不易
控制!接种鉴定比较困难因此!开发抗根肿病特异
分子标记!对提高育种效率!开展分子标记辅助育种
具有重要意义
.^6?
等)+*利用
@@C
标记
FAC"#
和
FAC"3
!将抗根肿病
342
基因定位在大白菜
B%
连
锁群并且标记间遗传距离为
!*39]
陈慧慧等)&*
根据
.^6?
等)+*的研究开发了
!
个大白菜
@@C
标记!
分别为
FAC#%
和
FAC+)
!标记间遗传距离为
"*#&9]
!这些研究为大白菜抗根肿病分子标记辅助
育种提供了理论基础本研究利用携带
342
基因
的大白菜种质!与不结球白菜进行亚种间杂交和回
交!通过已有的
@@C
标记设计特异引物!以期获得
更为简便快速的
@ABC
标记应用于分子标记辅助
选择!同时结合大白菜与不结球白菜亚种间杂交创
制不结球白菜抗根肿病新种质
#
!
材料和方法
>*>
!
植物材料
供体母本为携带
342
基因的大白菜材料
AAC#%"!$
!对根肿病表现为高抗!从云南省农业科
学院蔬菜研究所引进父本材料+
F
青,!为江苏省
农业科学院蔬菜研究提供
!"##
年春!将双亲及
D
#
代种植于江苏省农业科学院蔬菜研究所实验田
D
#
代自交获得
D
!
!用于标记准确性鉴定以+
F
青,为
轮回亲本连续回交!从
1A
#
代开始!根据分子标记
进行选择!选择性状接近轮回亲本并且含有
342
基
因的单株用于回交!获得回交后代群体
1A
%

>*?
!
方
!
法
>*?*>
!
各世代植株抗性鉴定
!
+
F
青,(
AAC#%"!$
(
D
#
(
D
!
及
1A
#
"
1A
%
每个材料每次
%"
株!
%
次重
复!随机排列!播种于
$"
孔穴盘接种方法及评价
分级标准同张慧等)3*
>*?*?
!
多态性标记开发
!
在大白菜基因数据
:RR
V
$%%
EU6//.96XE*?U
K
%
9
K
.(E.0
%
K
EU?\/;
%
1U6//.96
-
[#*$
中定位已报道的
!
个
@@C
标记
FAC#%
"上游
"*"39]
#和
FAC+)
"下游
"*"39]
#
)
&
*
!获得物理区
域为
B%
染色体
1U6!%+&+#%&
"
1U6!%&)+#)!
之间!
在该区间中间设计了
&
对特异引物"表
#
#!委托上
海生物工程公司进行引物的合成
>@?@A
!
B04
扩增
!
采用
AFB1
法提取幼嫩叶片
_IB
利用
#*"`
琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和
纯度!用紫外分光光度计检测
_IB
质量和浓度!并
稀释至
#$0
K
%
#
J

!"
#
J
反应体系中含
#a A^C
缓冲液(
!*"
55?7
%
J]
K
A7
!
(
!*"55?7
%
JXIF^
(
#$0
K
_IB
(
!
条引物各
"*$
#
5?7
%
J
!
#M5#
6
酶!用
XXH
!
N
补足
A^C
扩增程序$
3)b
预变性
!5.0
&
3)b
变性
%"/
!
$%b
退火
#5.0
!
+!b
延伸
!5.0
&
)"
个循环!
+!b
保温延伸
$5.0
!
)b
下保存扩增产物用
#*$`
琼
脂糖凝胶电泳检测!在培清凝胶图像分析系统中拍
照记录扩增反应在
F^A(#"" A^C
仪上进行
!
个
@@C
标记
FAC#%
和
FAC+)
反应体系及
扩增程序参考陈慧慧等)&*!扩增产物用
,`
聚丙烯
酰胺凝胶电泳分离!银染染色
!
!
结果与分析
?*>
!
抗根肿病
@ABC
分子标记的开发
利用
!
个标记
FAC#%
和
FAC+)
的
@@C
引物
进行双亲及杂交(自交分离后代鉴定!发现在大白菜
抗源
AAC#%"!$
和杂种
D
#
中分别携带
!
个标记!不
结球白菜+
F
青,未检到该标记在
+&
个
D
!
代分离
群体中按照
%c#
"
$3c#3
#的分离比例进行分离"图
#
#!并且
!
个标记表现出严格的共分离现象!标记与
实际接种鉴定结果相吻合!表明该标记能够用于抗
根肿病材料的分子标记辅助选择
在大白菜基因数据库
:RR
V
$%%
EU6//.96XE*?U
K
%
9
K
.(E.0
%
K
EU?\/;
%
1U6//.96
-
[#*$
中定位
!
个
@@C
标
表
>
!
基于
C04>A
和
C04DE
设计的特异引物
F6E7;#
!
@
V
;9.S.9
V
U.5;U/X;/.
K
0;X699?UX.0
K
R?FAC#%60XFAC+)
引物
U^.5;U
引物序列
@;
d
>;09;?S
V
U.5;U
"
$
,
#
%
,#
正向
D?U\6UX
反向
C;[;U/;
退火温度
F5
%
b
# 1#!$!% BAAFOOBABFFOOBFFOB BOBFOOFOBAOOAOBBOB $$
! 1#!$!) AOFOFABBBOBBFAFABFA FOAFBAFBFFFBOBBBAAFA $$
% 1#!$!$ AFFFOOBFFOFFOBAAFF BFOFFOBFOAFBAFOBOBA $"
) 1#!$!, AOABBBOBOAABFAAFBA BFAAABBBFABOABBAOA $$
$ 1#!$!+ FABOFFOFFFAFFOFOOO FOBBOOFBFOOOFFBFOO $"
, 1#!$!& FBBAOOOBBOFBBOABBF BBBOFABOFBOAAABBBO $$
+ 1#!$!3 OABAFFFOAFABFFOOFB ABAOBOBAFAAAFAAFBB $"
& 1#!$%" AOFBBBAAFAOFABBBFA FOOFOAFBBOBOFOFBBOB $$
#%$#
&
期 陈龙正!等$不结球白菜抗根肿病渐渗系的分子辅助选育
图
#
!
大白菜抗根肿病连锁分子标记
FAC#%
和
FAC+)
)
&
*
^
#
*AAC#%"!$
&
^
!
*F
青&
D
#
*AAC#%"!$aF
青&
D
!
*D
#
自交分离后代&
C*
抗根肿病后代&
@*
感根肿病后代&
FAC#%
(
FAC+)*
抗根肿病基因连锁
@@C
分子标记&箭头所示为差异位点&下同
D.
K
*#
!
FAC#%60XFAC+)7.0Z;XR?97>EU??RU;/./R609;.0A:.0;/;96EE6
K
;
)
&
*
^
#
*AAC#%"!$
&
^
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*FG
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D
#
*AAC#%"!$aFG
&
D
!
*@;7S/;
V
6U6R.0
KV
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K
;0
=
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#
&
C*A7>EU??RU;/./R60R?SS/
V
U.0
K
&
@*A7>EU??R/>/9;
V
R.E7;?SS/
V
U.0
K
&
FAC#%
!
FAC+)*@@C56UZ;U7.0Z;XR?
97>EU??RU;/./R609;

BUU?\//:?\;XR:;/
V
;9.S.9/.R;/
&
F:;/65;6/E;7?\*
图
!
!
抗根肿病特异
@ABC
引物扩增结果
#
"
&*
特异引物编号同表
#
&
]*_J!"""
D.
K
*!
!
C;/>7R/?S@ABC56UZ;U/7.0Z;XR?97>EU??RU;/./R609;
#
"
&*F:;9?X;?S
V
U.5;U6U;/65;6/F6E7;#
&
]*_J!"""
记!发现其分别位于大白菜
B%
染色体
1U6!%+&+#%&
"
1U6!%&)+#)!
之间!物理距离
#""",E
V
!在该区间
设计了
&
对特异引物"表
#
#!进行扩增结果发现!
在
&
对特异引物中!有
+
对在双亲和
D
#
中没有多态
性!
#
对引物
1#!$!$
在双亲和
D
#
之间有多态性"图
!
#将该多态性引物用
D
!
群体进行验证!结果发
现!该标记与
FAC#%
和
FAC+)
共分离!并且与田
间接种鉴定一致"图
%
#!在所有表现抗性的单株中
均能扩增到该标记!在感病单株中表现缺失表明
该
@ABC
标记能够用于抗根肿病分子标记辅助选
择!命名为
ACE(C(!$

?*?
!
不结球白菜抗根肿病回交后代分子选择
利用该标记进行辅助选择!以不结球白菜+
F
青,为轮回亲本!进行回交并用
ACE(C(!$
进行选
择!每代选取
#"
株表型性状最接近+
F
青,并且携带
标记
ACE(C(!$
的单株作为种株留种!在每个回交
世代中做自交分离!淘汰自交后代
ACE(C(!$
标记
发生分离的单株"其回交后代抗性位点为杂合的
B6
类型#!选择纯合的进行回交转育"抗性位点纯合
BB
类型#回交
%
代后!
1A
%
表型性状为典型的不
图
%
!
根肿病特异连锁分子标记
ACE(C(!$
扩增图谱
D.
K
*%
!
C;/>7R/?SACE(C(!$56UZ;U7.0Z;XR?
97>EU??RU;/./R609;
结球白菜性状!大白菜原有的叶翼(叶片绒毛(白梗(
包心等性状均已改良!综合性状基本接近轮回亲本
+
F
青,!渐渗系与轮回亲本理论遗传物质相似度为
3,*3`
将轮回亲本+
F
青,和
1A
%
接种根肿病菌
%$X
后检测!结果表明!+
F
青,在根部形成肿瘤!为
典型的根肿病病症!而携带
ACE(C(!$
条带的
1A
%
单株
FG#)(#(#$
表现抗病!根部发育正常"图
)
#
%
!
讨
!
论
利用分子标记进行辅助选择具有操作简便(速
!%$#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
)
!
回交后代接种试验"
B
#及
ACE(C(!$
特异条带"
1
#的检测
1A
%
"
C
#
*
回交后代抗病单株
FG#)(#(#$

D.
K
*)
!
Q0?9>76R.?0R;/R?SE69Z9U?//
K
;0;U6R.?0
"
B
#
60X9:;9Z?SACE(C(!$56UZ;U
"
1
#
1A
%
"
C
#
*C;/./R60R.0X.[.X>67FG#)(#(#$?SE69Z9U?//
K
;0;U6R.?0
度快(不受环境影响等优势!十字花科根肿病为十字
花科重要的土传病害!在接种鉴定中受温度(湿度(
V
H
值等环境因素的影响较大)#"*
.^6?
等)+*开发了
!
个与大白菜抗根肿病
342
基因连锁的分子标记!
FAC"$
和
FAC"3
连锁距离为
!*+#9]
陈慧慧
等)&*根据
FAC"$
和
FAC"3
等
!
个连锁标记!结合
大白菜基因组序列信息!开发了
FAC#%
"上游
"*"39]
#和
FAC+)
"下游
"*"39]
#
!
个
@@C
标记!
并将遗传距离定位在
"*#&9]
内在本研究中!基
于大白菜基因组数据库!将
!
个
@@C
标记
FAC#%
和
FAC+)
定位在大白菜
B%
染色体
1U6!%+&+#%&
"
1U6!%&)+#)!
之间在本区间中设计了
&
条特异引
物!其中
#
对引物与
@@C
标记
FAC#%
和
FAC+)
共
分离!表明将其成功转化为
@ABC
标记!命名为
ACE(C(!$
经接种鉴定验证发现!该标记能够用于
分子标记辅助选择
在分子标记辅助选择进行抗根肿病性状转育方
面!朴钟云等)##*利用
.^6?
等)+*开发的
!
个与大白菜
抗根肿病
342
基因连锁的分子标记
FAC"#
和
FAC"3
!进行大白菜与大白菜之间的抗性转育!获
得
3
个+
1WI%
,的近等基因系目前在不结球白菜
研究中未发现根肿病抗源!本研究利用抗根肿病大
白菜与不结球白菜进行亚种间杂交和回交!经过
%
代!利用分子标记进行辅助选择!在回交过程中大白
菜典型性状如叶毛(叶翼(包心等逐渐在各世代丢
失!回交后代综合性状趋于轮回亲本!最终获得了携
带根肿病抗性的不结球白菜种质资源
FG#)(#(#$
!
实现了提高育种效率的目的
本研究中!通过对大白菜基因组数据库检索!在
B%
染色体
1U6!%+&+#%&
"
1U6!%&)+#)!
之间!共计
有
3
个功能基因!这些基因既有编码细胞膜组分蛋
白!也有编码蛋白质合成调控蛋白!下一步根据结合
抗性鉴定!分析这些基因与根肿病抗性之间的关系!
将有利于根肿病抗性基因的分离和克隆
参考文献!
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