全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(３): ２４７￣２５３(２０１４)
收稿日期: ２０１２￣０６￣０６ꎻ 修回日期: ２０１３￣１２￣１４
基金项目: 国家自然基金资助项目(３１０７１６５４ꎻ ３０５００３２５)ꎻ国家科技支撑计划(２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０３)ꎻ福建省教育厅科技项目(ＪＡ１３４１２)
通讯作者: 汪世华ꎬ教授ꎬ主要从事免疫学和微生物研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｗｓｈｙｙｌ＠ｓｉｎａ.ｃｏｍꎻ
鲁国东ꎬ教授ꎬ主要从事分子植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｇｕｏｄｏｎｇｌｕ＠ｙａｈｏｏ.ｃｏｍ
第一作者: 吴丽民ꎬ女ꎬ浙江温州人ꎬ博士ꎬ主要从事免疫学与植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｗｕｌｉｍｉｎ２０１１＠１６３.ｃｏｍꎮ
稻瘟病菌一假定几丁质酶多克隆抗体的制备及其检测
吴丽民１ꎬ ２ꎬ 连永乐２ꎬ 王宗华２ꎬ 汪世华２∗ꎬ 鲁国东２∗
( １福建生物工程职业技术学院ꎬ福州 ３５０００２ꎻ ２福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室ꎬ福州 ３５０００２)
摘要:为检测几丁质酶的表达ꎬ制备稻瘟病菌的一假定几丁质酶多克隆抗体ꎬ探索其可能运用ꎮ 将稻瘟病菌(Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ)
几丁质酶基因克隆入融合表达载体 ｐＥＴ￣３２ａꎬ并在大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３)中进行诱导表达ꎮ 表达菌株经０.５ ｍｍｏｌ / Ｌ
ＩＰＴＧ诱导 ４~６ ｈ后ꎬ用 Ｎｉ２＋￣ＮＴＡ亲和柱纯化蛋白ꎬ得到可溶的几丁质酶￣Ｈｉｓ融合蛋白ꎮ 以该融合蛋白免疫新西兰雄兔ꎬ制备多
克隆抗体ꎮ ＥＬＩＳＡ分析表明该抗体效价达 １ ∶ ２０４ ８００ꎬ特异性良好ꎮ 用该抗体 ＥＬＩＳＡ检测了稻瘟病菌 ４个不同田间菌株中ꎬ不同
的菌株表达量不同ꎮ 对稻瘟病菌侵染水稻 ３、５和 ７ｄ后的病叶进行抗原Ｗｅｓｔｅｒｎ验证ꎬ结果表明ꎬ稻瘟病菌不同的侵染时间其几丁
质酶表达量有明显差异ꎮ几丁质酶表达的差异是否与菌株间致病型等生物学和生理学差异有关ꎬ目前正在进一步研究ꎮ
关键词:稻瘟病菌ꎻ 几丁质酶ꎻ 多克隆抗体ꎻ ＥＬＩＳＡ
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ａ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ａｎｄ ｉｔｓ
ｕｓａｇｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＷＵ Ｌｉ￣ｍｉｎ１ꎬ ２ꎬ ＬＩＡＮ ｙｏｎｇ￣ｌｅ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｚｏｎｇ￣ｈｕａ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｓｈｉ￣ｈｕａ２ꎬ ＬＵ
Ｇｕｏ￣ｄｏｎｇ１ ( １ Ｆｕｊｉａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｆｕｚｈｏｕꎬ ３５０００２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏ￣ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ａｎｄ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎꎻ Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｆｕｚｈｏｕꎬ ３５０００２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ￣３２ａ
ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３) ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ.Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ４￣６ ｈｏｕｒｓ
ｂｙ ０. ５ ｍｍｏＬ ＩＰＴＧꎬ ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｕｐｐｅｒ ｌｉｑｕｉｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｅｄ ｂｙ Ｎｉ２＋ ￣ＮＴＡ ａｆｆｉｎｉｔｙ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ. Ｔｈｉｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ ｔｏ ｇｅｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ.
ＥＬＩＳＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗａｓ １: ２０４ ８００. Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｆｉｌｔｒａｔｅｓ ｏｆ ４ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ
ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ａｐｐｅａｒｅｄ ｔｏ ｂｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ７０￣１５. Ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏ￣
ｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｔｉｌｌ ｒｅｍａｉｎｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅꎻ ｃｈｉｔｉｎａｓｅꎻ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎꎻ ＥＬＩＳＡ
中图分类号: Ｑ９３９.９１ 文献标识码: Ｂ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０３￣０２４７￣０７
稻瘟病菌(Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ)引发的稻瘟病
是水稻最重要的病害之一ꎬ同时ꎬ该菌也是研究丝
状真菌的重要模式生物[１]ꎮ 该菌在侵染循环过程
中涉及到与植物之间的许多信号分子的识别与传
导[２]ꎮ 病原物的一些信号分子很可能是分泌到细
胞外的分泌蛋白ꎬ稻瘟病菌分泌蛋白基因大约有
１ ０００多个[３]ꎬ分泌蛋白可能起激发子和致病因子
的作用[４~６]ꎮ
几丁质(ｃｈｉｔｉｎ)又称甲壳质或甲壳素等ꎬ在自
然界中广泛分布ꎬ是真菌细胞壁的重要成分ꎮ 几丁
质酶(ＥＣ３.２.１.１４)是分解几丁质的一类蛋白质ꎬ广
泛存在于各种植物、动物及微生物细胞和组织中ꎬ
植物病理学报 ４４卷
参与多种生理过程[７]ꎮ Ｂｅｎｅｃｋｅ[８]首次分离到能产
生几丁质酶的微生物ꎬ发现 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｉｔｉｎｏｖｒｏｕｓ能
利用几丁质作为营养物ꎮ 据不完全统计ꎬ已发现的
产生几丁质酶的微生物约有 ４６个属近 ７０个种[９]ꎮ
几丁质酶能将几丁质降解为几丁质寡糖和几丁质
单糖ꎮ 几丁质的降解产物￣几丁质寡糖能诱导植物
的防御系统[９ꎬ１０]ꎮ 一些可利用几丁质为营养源的
微生物成为极具潜力的生物防治制剂[１１]ꎮ 因而ꎬ
几丁质酶在真菌生长发育、植物抗真菌感染以及几
丁质在自然界的物质循环过程中都起重要作用ꎬ在
环境保护、医药、食品和基础生命科学研究中、在植
物病害防治方面有重要的应用价值[１２]ꎮ
根据稻瘟病菌数据库与生物信息学分析结果
表明ꎬ稻瘟病菌基因组中有 １１ 个 Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ 家族蛋
白成员ꎬ预测他们中 ８ 个具有信号肽ꎬ以不同程度
分泌到细胞外ꎮ 通过比较 Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ 基因家族的结
构和功能ꎬ我们推测 Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ 基因家族在稻瘟病
菌侵染致病过程中可能起着关键的作用ꎮ 本论文
选择了具有代表性的一个稻瘟病菌几丁质酶编码
基因 ＭＧＧ＿０８０５４.６ꎮ 为研究该酶在稻瘟菌中的生
物学和生物化学的功能ꎬ在用遗传和生化方法分析
该酶作用的基础上[１３]ꎬ笔者制备了抗几丁质酶特
异高效价的多克隆抗体ꎬ利用该抗体通过间接
ＥＬＩＳＡ 对稻瘟菌田间菌株培养液进行了检测ꎬ结
果发现ꎬ不同菌株间几丁质酶表达量表现出明显差
异ꎮ 利用该抗体通过 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 对稻瘟菌侵
染水稻后不同感病阶段的水稻叶片进行检测ꎬ结果
表明ꎬ不同侵染时期几丁质酶表达量也表现出明显
差异ꎮ 这些结果为进一步研究该酶在稻瘟菌生长
发育和致病过程中的作用奠定了很好的基础ꎮ
１ 材料和方法
１.１ 几丁质酶家族信息查找
以 Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ 几 丁 质 酶
ＮＣＵ０４５５４的蛋白序列为靶蛋白ꎬ在稻瘟病菌基因
组数据库 ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ. ｏｒｇ / ａｎｎｏｔａ￣
ｔｉｏｎ / ｇｅｎｏｍｅ / ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ＿ｇｒｉｓｅａ / ＭｕｌｔｉＨｏｍｅ. ｈｔｍｌ)
中进行同源序列比对ꎬ查找几丁质酶家族基因ꎮ 利
用 ＥｘＰＡＳｙ服务器上的生物信息学软件 ＰｒｏｔＰａｒａｍ
(ｈｔｔｐ: / / ｕｓ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ. ｈｔｍｌ) 对所
获得的同源异型盒结构域 Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ 蛋白质的
理论分子量、等电点及不稳定指数进行分析ꎬ用
ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ来预测几丁质酶序列的结构域以及一些
潜在目标序列的结合位点ꎮ ＳｉｇｎａｌＰ ４. ０ Ｓｅｒｖｅｒ
(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / ＳｉｇｎａｌＰ / )进行信
号肽分析ꎬＰｒｏｔＣｏｍｐ ｖ. ９. ０ / Ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｈｅ ｓｕｂ￣ｃｅｌｌｕｌａｒ
ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ / Ｆｕｎｇｉ ｐｒｏｔｅｉｎｓ用于亚细胞定
位分析ꎮ
１.２ 供试菌株、培养基
ＭＧ０８０５４.６ＯＥ 菌株是将 ＭＧＧ＿０８０５４.６ 几丁
质酶基因克隆到表达载体 ｐＥＴ￣３２ａꎬ转化大肠杆菌
ＢＬ２１(ＤＥ３)后得到的重组转化子ꎮ 稻瘟病菌株
７０~１５和其他田间菌株均为本实验室保存ꎮ 所用
培养基为 ＬＢ培养基ꎬ每升含胰蛋白胨 １０ ｇ、酵母
粉５ ｇ、ＮａＣｌ １０ ｇ、琼脂粉 １６ ｇ(液体培养基不加)ꎻ
产孢培养基为米糠培养基(ｐＨ ６.０ ~ ６.５):每升含
米糠 ２０ ｇ、琼脂粉 １６ ｇꎮ
１.３ 几丁质酶￣Ｈｉｓ融合蛋白大量制备[１３]
挑取新培养的 ＭＧ０８０５４.６ＯＥ 单菌落于 ５ ｍＬ
ＬＢ(Ｋａｎａ )培养液中 ３７℃培养过夜ꎮ 次日以 ２％的
接种量接入 ３００ ｍＬ ＬＢ(Ｋａｎａ )培养液中ꎬ在 ＯＤ值
达到 ０.６时ꎬ加入 ＩＰＴＧ至终浓度 ０.５ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ在诱
导 ０、３、５和 ７ ｈ 时分别取出 １ｍＬ菌液ꎬ离心收集菌
体细胞并超声破碎ꎬ１０％ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳检测ꎮ
取 ３００ ｍＬ 经诱导表达后的菌液离心ꎬ收集菌
体经超声破碎后ꎬＮｉ２＋ ￣ＮＴＡ亲和柱纯化后ꎬ得到可
溶的几丁质酶ꎮ
分析所得的稻瘟病菌几丁质酶的纯度ꎬ采用
Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法[１４]ꎬ以牛血清白蛋白为标准蛋白测定
所分离蛋白的量ꎮ
１.４ 多克隆抗体的制备
按常规方法用纯化的目的蛋白免疫新西兰大白
兔ꎮ 首次免疫时ꎬ按每只 ０.４ ｍｇ 的剂量ꎬ加入等体
积的弗氏完全佐剂ꎬ充分混匀后皮下多点注射ꎻ３周
后加强免疫ꎬ抗原用量与初次免疫的相同ꎬ加等量弗
氏不完全佐剂ꎻ４次加强免疫后的第 ５天放血、取血
清、ＥＬＩＳＡ检测效价ꎬ收集兔多克隆抗体并保存[１５]ꎮ
ＨＲＰ标记的羊抗兔抗体购自华美公司ꎮ
１.５ 多克隆抗体的特异性测定
用间接 ＥＬＩＳＡ 检测抗体的特异性ꎬ实验中除
了包被抗原外ꎬ还包被木聚糖酶、ＧＳＴ 蛋白、脱脂
８４２
３期 吴丽民ꎬ等:稻瘟病菌一假定几丁质酶多克隆抗体的制备及其检测
牛奶、丝氨酸蛋白酶做阴性对照[１５ ]ꎮ
１.６ 稻瘟病菌不同菌株几丁质酶表达的检测
用丙酮法提取稻瘟病菌供试菌株培养液中总
蛋白ꎮ 用间接 ＥＬＩＳＡ 检测稻瘟病菌不同菌株几丁
质酶表达情况ꎮ 稻瘟病菌菌株 ０３１３Ａ１ꎬ ９７０５４ꎬ
８６５０１ꎬ７０￣１５的蛋白提取后ꎬ用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法定量总
蛋白ꎬ测定采用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法[１６]ꎮ
１.７ 稻瘟病菌感染水稻后不同时期几丁质酶表达
的检测
水稻培养和稻瘟病菌接种参考方中达的方
法[１７]ꎮ 野生型稻瘟病菌株 ７０￣１５ 感染水稻亲和品
种 Ｃ１０１Ａ５１ (Ｐｉ￣２) ３、５和 ７ ｄ 后的表达检测采用
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法[１６]ꎮ
用植物组织蛋白质提取法[１５ ]提取稻瘟病菌感
染水稻后的病叶总蛋白ꎮ 样品放在研钵中用液氮
研磨之后ꎬ置于离心管中ꎬ加入提取液(１ ｇ 样品加
入 ３.５ ｍＬ 提取液)ꎬ放在冰上静置于 ４℃冰箱过
夜ꎻ之后 １２ ０００ ｒｐｍꎬ４℃离心 ２０ ｍｉｎꎻ取上清ꎬ即得
样品ꎮ 蛋白提取液 ３００ ｍＬ:含 １ ｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ
(ｐＨ ８.０)ꎻ甘油(Ｇｈｙｃｅｒｏｌ)７５ ｍＬꎻ聚乙烯吡咯烷酮
(Ｐｏｌｙｖｉｒｒｙ ｐｏｌｙｐｒｒｏｒｃｌｏｎｅ)６ ｇꎮ
２ 结果与分析
２.１ 几丁质酶的生物信息学分析
根据稻瘟病菌基因组数据库注释ꎮ 通过反复
ｂｌａｓｔＰ得知稻瘟病菌基因组中有 １１个 １８家族几丁
质酶的蛋白序列ꎮ 其中ꎬＭＧＧ＿０８０５４.６ 属于糖水
解酶 ｌ８ 家族 ꎬ有 ３９７ 个氨基酸ꎬ分子质量为
４３ ８３３.５ (Ｄａ)ꎬ等电点 ５.２９ꎬ不稳定指数为 ４３.９６
不稳定ꎬ具信号肽ꎬ是胞外分泌蛋白(表 １)ꎮ 同源
比对发现ꎬ其它 １０个几丁质酶蛋白与 ＭＧＧ＿０８０５４
的氨基酸序列同源性在 ２４％ ~ ３９％ꎮ 说明ꎬ尽管它
们都为几丁质酶ꎬ但同源性较低ꎮ
２.２ 几丁质酶序列属性分析
笔者用 Ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ 来预测几丁质酶 ＭＧＧ＿
０８０５４.６序列的结构域以及一些潜在目标序列的结
合位点ꎮ Ⅰ为 ＭＧＧ＿０８０５４.６ 的氨基酸序列ꎬⅡ信
息表明 ＭＧＧ＿０８０５４.６属于糖水解酶 １８家族(Ｇｌｙ￣
ｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ１８)ꎬⅡ和Ⅳ共同显示了的
ＭＧＧ＿０８０５４.６糖苷水解酶的催化结构域(Ｃａｔａｌｙｔｉｃ
ｄｏｍａｉｎ)ꎬⅢ展示了 ＣｈｉｔｉｎａｓｅⅡ的区域ꎬⅤ可以看出
１８家族的共同结构域(图 １)ꎮ
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ
ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎ￣
ａｓ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａ￣
ｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ (Ｄａ)
Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｐＩ
Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｉｎｄｅｘ
Ａｌｉｐｈａｔｉｃ
ｉｎｄｅｘ
ＳｉｇｎａｌＰ
ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ
ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
ＭＧＧ＿０８０５４.６ ３９７ ４３ ８３３.５ ５.２９ ４３.９６ ｕｎｓｔａｂｌｅ ８２.５７ ＹＥＳ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ６.０
Ｆｉｇ. １ Ｄｏｍａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ＭＧＧ＿０８０５４.６
９４２
植物病理学报 ４４卷
２.３ 几丁质酶的纯化
为了制备纯度较高的几丁质酶ꎬ将几丁质酶的
工程菌在 ＬＢ液体培养基中旺盛生长后ꎬ经超声波
裂解ꎬ与 Ｎｉ２＋ ￣ＮＴＡ 混匀ꎬ在 ４℃下充分结合ꎬ过层
析柱纯化ꎬ可以高效纯化得到目的蛋白ꎮ 将纯化后
的蛋白进行 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 检测ꎬ结果所得蛋白只显
示一条蛋白带(图 ２)ꎬ表明纯化后的几丁质酶￣Ｈｉｓ
融合蛋白的纯度为单一组分ꎬ浓度较高ꎬ已达到抗
原的要求 ꎮ对菌株ＭＧ０８０５４ . ６ＯＥ在 ＩＰＴＧ诱导
Ｆｉｇ. ２ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ￣Ｈｉｓ ｆｕｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ Ｌａｎｅ １ꎬ ２ꎬ
３ꎬ ４: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ￣Ｈｉｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ３ꎬ ５ꎬ ７ ｈ ａｎｄ ０ ｈ ｂｙ ０.５ ｍｍｏＬ ＩＰＴＧ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
后ꎬ生长处于 ０、３、５ 和 ７ ｈ 时表达时间分析显示ꎬ
表达量在诱导 ５ ｈ后达到最高ꎮ
２.４ 抗体的效价测定
将所制备的几丁质酶￣Ｈｉｓ 融合蛋白注射新西
兰兔(２~３ ｋｇ /只)ꎬ在 ４ 次免疫后ꎬ用 ＥＬＩＳＡ 方法
对血清效价进行了测定ꎬ待测孔 ＯＤ值大于或等于
阴性对照孔的 ２.１倍为阳性ꎬ判定阳性的最大血清
稀释倍数为血清效价ꎮ 测得到瘟病菌几丁质酶多
克隆抗体效价最高可达 ２０４ ８００ꎮ
２.５ 抗体的特异性检测
分别以几丁质酶￣Ｈｉｓ 融合蛋白、ＧＳＴ 蛋白、木
聚糖酶、脱脂牛奶、丝氨酸蛋白酶、包被酶标板ꎬ用
间接 ＥＬＩＳＡ法测定抗体的特异性ꎮ 结果说明几丁
质酶抗血清与目标蛋白几丁质酶￣Ｈｉｓ 融合蛋白结
合的特异性较高(图 ３)ꎮ
２.６ 不同稻瘟病菌菌株几丁质酶表达的检测
供试稻瘟病菌 ４ 个菌株ꎬ经 ＣＭ 液体培养后ꎬ
用丙酮法提取培养液中的总蛋白ꎬ经 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法定
量后ꎬ在蛋白质总量一致的情况下ꎬ用间接 ＥＬＩＳＡ
测定几丁质酶的量ꎮ 以 Ｎｉ２＋ ￣ＮＴＡ 亲和柱提取的
几丁质酶为阳性对照ꎬ３ 次重复结果的平均值(图
４)显示ꎬ以 ＭＧ０８０５４.６ＯＥ细菌表达的纯化蛋白为
阳性对照ꎬ菌株 ９７０５４ 几丁质酶的表达量最高ꎬ菌
株 ７０－１５、８６５０１、０３１３Ａ１也有少量表达ꎮ
Ｆｉｇ. ３ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ
０５２
３期 吴丽民ꎬ等:稻瘟病菌一假定几丁质酶多克隆抗体的制备及其检测
２.７ 稻瘟病菌侵染水稻过程中几丁质酶表达的
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测
用野生型稻瘟病菌株 ７０－１５ 感染亲和性水稻
品种 Ｃ１０１Ａ５１ ３、５ 和 ７ｄ 后ꎬＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测
感病植株中几丁质酶的表达ꎮ 结果表明ꎬ受 ７０－１５
菌株侵染的植株中ꎬ在感病后的第 ３、５ ｄ 和 ７ ｄ 后
都能检测到几丁质酶的表达ꎬ而且ꎬ表达量逐渐升
高ꎮ 从水稻感染稻瘟病菌的外部症状看ꎬ感病 ３ ｄ
后开始出现病斑ꎬ５ ｄ 稍大ꎬ７ ｄ 的病斑已明显扩
散ꎬ这也表明了几丁质酶的表达与病斑的扩散有正
相关(图 ５)ꎮ 但在 ７０－１５ 菌株侵染非亲和性水稻
品种 ＩＲＢＬ２２ 后ꎬ未能在植株中检测到该酶的表
达ꎮ 其原因可能是在非亲和寄主中病菌无法增殖ꎬ
而原来接种所附在植株上的病菌孢子生物量太少
不足以检测ꎬ或者病菌已经死亡ꎮ 阳性和阴性对照
的结果进一步证明ꎬ本实验所制备的几丁质酶多克
隆抗体有高度的特异性ꎮ
３ 讨论
生物信息分析结果表明ꎬＭＧＧ＿０８０５４.６ 在稻
瘟病菌几丁质酶的蛋白序列中有糖苷水解酶的催
化结构域ꎬＣｈｉｔｉｎａｓｅⅡ的区域ꎬ是 １８ 家族的成员ꎬ
没有显示出其几丁质的结合区、细胞溶解区域以及
几丁质酶的活性位点等 (图 １)ꎬ同时也可看出
ＭＧＧ＿０８０５４.６ 有信号肽(表 １)ꎬ这些信息说明了
该酶是分泌到细胞外ꎬ参与胞外与宿主蛋白互作的
可能性比较大ꎮ
Ｆｉｇ. ４ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｅｖｅｒａｌ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｆｉｇ. ５ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
Ｌａｎｅ １: Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ７０－１５ ｓｔｒａｉｎ ｍｙｃｅｌｉａ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ＣＭ ｍｅｄｉｕｍꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ７０－１５ ｓｔｒａｉｎ
ｍｙｃｅｌｉａ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｂｒａｎ ｍｅｄｉｕｍꎻ Ｌａｎｅ ３ꎬ ４ꎬ ５: Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｃｖ. Ｃ１０１Ａ５１ (ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ) ａｆｔｅｒ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ７０－１５ ｓｔｒａｉｎ ａｔ ３ꎬ ５ ａｎｄ ７ｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｎａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ( ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｃｖ.
Ｃ１０１Ａ５１ ａｆｔｅｒ ｓｐｒａｙ ｗｉｔｈ ｗａｔｅｒ)ꎻ Ｌａｎｅ ７: Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｃｖ. ＩＲＢＬ２２ ( ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ) ａｆｔｅｒ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ７０－１５ ｓｔｒａｉｎ ａｔ ７ｄꎻ Ｌａｎｅ ８: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ) .
１５２
植物病理学报 ４４卷
几丁质酶 ＭＧＧ＿０８０５４.６ 基因以 Ｎ 端融合 ６
个组氨酸(Ｈｉｓ) 克隆入融合表达载体 ｐＥＴ￣３２ａ 中ꎬ
转化到 Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３) 菌中得到过量表达菌株
ＭＧ０８０５４.６ＯＥꎬ经 ＩＰＴＧ 诱导表达ꎬＮｉ２＋ ￣ＮＴＡ 柱纯
化ꎬ获得可溶性的目的蛋白ꎮ 免疫新西兰大白兔成
功制备了抗稻瘟病菌几丁质酶的多克隆抗体ꎬ间接
ＥＬＩＳＡ结果表明抗体效价高ꎮ 同时说明了没有发
生免疫耐受[１５]ꎮ
稻瘟病菌中虽然有 １１ 个假定几丁质酶蛋白ꎬ但它
们之间的同源性较低ꎬ本研究利用 ＭＧＧ＿０８０５４.６
制备的多克隆抗体ꎬ理论上与其它几丁质酶蛋白非
特异性交叉反应的几率低ꎮ 当然ꎬ要完全排除交叉
反应ꎬ今后需逐个表达同源蛋白并检测它们与
ＭＧＧ＿０８０５４.６抗体的识别情况ꎮ
检测ＭＧ０８０５４.６ＯＥ菌群在 ＩＰＴＧ诱导后的 ０、
３、５和 ７ ｈ的几丁质酶表达量ꎮ 发现ꎬ几丁质酶在
过量表达菌(ＭＧ０８０５４.６ＯＥ)的菌群细胞受 ＩＰＴＧ
诱导 ５ ｈ时表达量最高ꎮ 说明几丁质酶的表达量
受到细菌群体生长时期的影响ꎮ
利用制备的抗体ꎬ对不同的稻瘟病菌菌株用
ＥＬＩＳＡ初步的检测几丁质酶 ＭＧＧ＿０８０５４.６ 的表
达量ꎬ结果发现ꎬ菌株 ９７０５４ 的几丁质酶 ＭＧＧ＿
０８０５４.６ 的表达量最高ꎬ７０ － １５ 和其它供试菌株
８６５０１ꎬ０３１３Ａ１检测到几丁质酶(ＭＧＧ＿０８０５４.６)
的表达量教低ꎮ 说明不同稻瘟病菌菌株的几丁质
酶(ＭＧＧ＿０８０５４.６)的表达量有明显差异ꎮ
菌株 ７０－１５感染亲和水稻品种 Ｃ１０１Ａ５１ Ｐｉ￣２
植株后ꎬ随着侵染时间延长ꎬ几丁质酶的表达量增
加ꎬ表明几丁质酶的表达与病斑的扩散成正相关ꎮ
但 ７０－１５ 接种非亲和水稻品种后ꎬ则检测不到几
丁质酶的表达ꎮ 虽然ꎬ其中的原因可能是由于非亲
和反应中病菌生物体的量太少ꎬ然而ꎬ也不能排除
几丁质酶可能参与稻瘟病菌的致病过程ꎮ 我们目
前正在进一步的研究几丁质酶在稻瘟病菌致病中
的作用ꎬ以及该酶在不同菌株之间表达的差异与菌
株致病性等生物学和生理学特性的关系ꎮ
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版社)ꎬ １９９８ꎬ ６２－６４.
责任编辑:曾晓葳
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