全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(１): ５７￣６６(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０３￣１１ꎻ 修回日期: ２０１４￣０９￣１２
基金项目: 国家自然科学基金(３１１７１８３１)ꎻ江苏省自然科学基金(ＢＫ２０１２０２７)ꎻ教育部博士点基金(２００９００９７１１００３２)
通讯作者: 窦道龙ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为植物与微生物互作ꎻＴｅｌ:０２５￣８４３９６９７３ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｄｄｏｕ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 柴春月ꎬ女ꎬ河南南阳人ꎬ博士ꎬ研究方向为植物抗病基因工程ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｃｃｙｕｅｒ１０１９＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０１.００８
大豆中疫霉诱导性 ＧｍＤＲＲＰ基因
启动子的克隆与功能分析
柴春月１ꎬ ２ꎬ 林艳玲１ꎬ 吴育人１ꎬ 沈丹宇１ꎬ 窦道龙１∗
( １南京农业大学植物保护学院ꎬ南京 ２１００９５ꎻ２南阳师范学院生命科学与技术学院ꎬ南阳 ４７３０６１)
摘要:本研究根据大豆与疫霉互作的基因芯片数据ꎬ筛选了一个受疫霉诱导表达的大豆抗病相关基因(ＧｍＤＲＲＰꎬ ｇｌｙｃｉｎｅ
ｍａｘ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ)ꎬ并对其启动子响应疫霉侵染的功能进行了研究ꎮ 序列分析表明该基因编码一个大
豆抗病相关蛋白ꎮ 分别用 ＳＡ、ＭｅＪＡ、ＡＢＡ、ＥＴＨ 和 ＧＡ３ 五种激素处理后ꎬ发现该基因的表达受激素的抑制ꎮ 克隆其转录
起始位点上游 １ ５９０ ｂｐ的启动子区ꎬ生物信息学分析发现该区域包含多个已知与逆境响应相关的顺式元件ꎮ 进一步将启
动子构建在融合 Ｇｕｓ报告基因的植物表达载体上ꎬ分别瞬时转化烟草和稳定转化大豆根毛ꎬ并检测了 Ｇｕｓ报告基因的表达
情况ꎮ 结果表明ꎬＧｍＤＲＲＰ启动子均能在两种体系中不同程度的受疫霉诱导ꎬ其表达模式为接种后 ０.５ ｈ被快速诱导ꎬ并在
２ ｈ时显著提高ꎮ 根据生物信息学对顺式元件的预测结果ꎬ对启动子进行了分段分析ꎬ获得了一个 ２２２ ｂｐ的小片段ꎬ其疫霉
诱导表达能力是全长启动子的 ３４％ꎮ 以上结果表明大豆的 ＧｍＤＲＲＰ启动子能被疫霉快速诱导ꎮ
关键词:大豆ꎻ 大豆疫霉ꎻ 病原菌诱导性启动子ꎻ ＧｍＤＲＲＰ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ ｉｎｄｕｃｅｄ￣ｐｒｏ￣
ｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｙｂｅａｎ ＧｍＤＲＲＰ ｇｅｎｅ　 ＣＨＡＩ Ｃｈｕｎ￣ｙｕｅ１ꎬ２ꎬ ＬＩＮ Ｙａｎ￣ｌｉｎｇ１ꎬ ＷＵ Ｙｕ￣ｒｅｎ１ꎬ ＳＨＥＮ
Ｄａｎ￣ｙｕ１ꎬ ＤＯＵ Ｄａｏ￣ｌｏｎｇ１ 　 ( １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ２Ｃｏｌ￣
ｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｎａｎｙａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｙａｎｇ ４７３０６１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｗｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａ ＧｍＤＲＲＰ (ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ) ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ
ｓｏｙｂｅａｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａꎬ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｄｕｒｉｎｇ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｓｏｙｂｅａｎ ＤＲＲＰ ｐｒｏｔｅｉｎ.
ｑＲＴ￣ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｉｔ ｗａｓ ｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ. Ｔｈｅｎꎬ ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ
ｔｈｅ ￣１ꎬ５９０ ｔｏ ＋１ ｒｅｇｉｏｎ ( ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ ｏｆ ＧｍＤＲＲＰ ｉｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｓ ＋１ ｐｏｓｉｔｉｏｎ) ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ
ｓｏｙｂｅａｎ (ｃｖ. Ｗｉｌｌｉａｍｓ) . Ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｂｏｔｈ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ
ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｏｙｂｅａｎ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＧｍＤＲＲＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｕｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｔ ０.５ ｈｐｉ (ｈｏｕｒｓ ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ)ꎬ ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ａｔ ２ ｈｐｉ. Ｗｅ ａｌｓｏ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａ ２２２ ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｗａｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｆｕｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｔｈｕｓꎬ ｗｅ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｔｈａｔ ｃａｎ ｃｏｎｆｅｒ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｓｏｙｂｅａｎꎻ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ ＧｍＤＲＲＰ
中图分类号: Ｓ４３５.６５１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０１￣００５７￣１０
　 　 化学防治和抗病育种一直是作物病害控制的
两条主要途径ꎬ但在生产中都有一定的局限性和问
题ꎮ 随着现代分子生物学和生物技术的发展以及
对植物抗病性的深入了解ꎬ人们设想利用转基因技
　
植物病理学报 ４５卷
术来培育抗病植物材料ꎬ然而对于真菌、卵菌、细菌
和线虫等引起的植物病害ꎬ转基因抗病还没有成功
应用的实例ꎬ其中一个主要原因是当组成型表达一
个抗病相关基因时ꎬ尽管能达到使植物抗病的目
的ꎬ但抗性蛋白往往会持续过量积累ꎬ从而影响植
物的正常生长与发育[１~３]ꎬ同时目的基因在收获器
官的表达也会引起公众对转基因产品安全性的疑
虑ꎮ 病原菌诱导性启动子能驱动目的基因仅在病
原菌侵染点表达ꎬ有望能解决抗病相关基因组成型
表达带来的问题[４ꎬ５]ꎬ因此获得这类启动子是植物
抗病转基因育种的一个重要环节ꎮ
　 　 近年来ꎬ多个来源于植物、病毒和细菌的启动
子已经在植物转基因中得到成功运用ꎬ这些启动子
根据其转录模式主要分为三种:组成表达启动子ꎬ
诱导表达启动子以及组织特异表达启动子ꎮ 其中
病原菌诱导性启动子因其能够控制目的基因适时、
适地、适度地表达ꎬ被认为是植物抗病基因工程应
用上最有潜力的一种[６~８]ꎮ 到目前为止ꎬ已经在拟
南芥ꎬ烟草和水稻上鉴定了一些病原菌诱导性启动
子[５ꎬ９]ꎬ其中比较典型的例子是烟草的 ｈｓｒ２０３Ｊ 基
因启动子ꎬ当发生非亲和互作时植物的侵染点会产
生过敏反应ꎬ该基因会在此过程快速诱导表达[１０]ꎮ
ｈｓｒ２０３Ｊ启动子与疫霉激发子融合转化烟草后ꎬ能
在亲和真菌和卵菌侵染时介导过敏反应的发生ꎬ使
得转基因植株抗病性显著增强ꎬ而在转基因梨上这
个启动子却表现出很弱的诱导表达特征[１１ꎬ１２]ꎬ说
明该启动子的应用还有局限性ꎮ 通过对已有的病
原诱导性启动子的结果分析发现ꎬ这些启动子一般
都包含有多个受病原菌诱导的顺式元件ꎬ它们在一
个或多个信号通路中起作用ꎬ如 ＷＲＫＹ 转录因子
家族蛋白结合位点 Ｗ￣ｂｏｘꎬ防卫基因启动子中的
ＧＣＣ￣ｍｏｔｉｆꎬ参与抗病和水杨酸通路的 ＧＴ￣１ 元件
等ꎬ寻找和鉴定参与不同信号通路的顺式元件ꎬ可
以根据不同的目的人工设计启动子[１３~１５]ꎬ从而实
现更精准地控制基因表达的目的ꎮ
　 　 大豆是世界上最重要的一种油料经济作物ꎬ也
是最大的食用油和蛋白的来源ꎮ 由大豆疫霉
(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ)引起的根茎腐烂病是一种毁
灭性病害ꎬ该病害在世界范围内的大豆种植区几乎
都可以检测到ꎬ严重影响着大豆的产量和质量ꎬ每
年都造成巨大的经济损失ꎮ 大豆疫霉属于卵菌ꎬ为
土传ꎬ很多控制真菌的常用方法对此病害的控制效
果都不明显ꎮ 目前控制大豆疫霉病害的主要方法
是选育抗病品种ꎬ到目前为止在大豆上已鉴定了至
少 １５个主效抗病基因(Ｒ ｇｅｎｅｓ) [１６]ꎬ在大豆疫霉
中也鉴定了 １２个相应的无毒基因(Ａｖｒ ｇｅｎｅｓ) [１７]ꎬ
这些无毒基因与对应的抗病基因符合“基因对基
因”假说ꎬ但在生产上持续种植具有单一抗性的品
种ꎬ其抗性会随着大豆疫霉菌的快速变异而丧失ꎮ
利用多基因控制的水平抗性也是生产上的一种常
用策略ꎬ这种抗性虽然是可遗传的ꎬ但是由于参与
抗性的基因较多ꎬ常规育种的方法很难将其聚合到
一个品种上ꎮ 因此转基因技术将是大豆抗疫霉根
腐病育种的一个补充ꎬ但目前在该作物中尚缺乏功
能清楚的有应用潜力的启动子ꎮ
　 　 本研究从大豆中筛选出了一个疫霉菌诱导的
启动子ꎬ功能分析发现它能介导报告基因在侵染点
的快速高效表达ꎬ研究结果将为大豆甚至其它作物
抗疫病基因工程奠定基础ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 实验材料
　 　 植物材料:本氏烟(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ)ꎬ大
豆感病品种 Ｗｉｌｌｉａｍｓꎮ 细菌:大肠杆菌 ＤＨ５αꎬ农
杆菌 ＧＶ３１０１ꎬ发根农杆菌 Ｋ５９９ꎮ 卵菌:大豆疫霉
Ｐ６４９７菌株ꎬ辣椒疫霉 Ｐｃ３５ 菌株ꎮ 植物表达载体:
ｐＢＩ１２１ꎬｐＭＤＣ１６２ꎮ
　 　 试剂:内切酶购于北京 ＮＥＢ 公司ꎻ连接酶ꎬ
ｒＴａｑ 酶ꎬＰｒｉｍｅｒ ｓｔａｒ 高保真酶ꎬＲＮＡ 反转录试剂
盒ꎬｑＲＴ￣ＰＣＲ试剂盒购自大连 ＴａＫａＲａ 公司ꎻＲＮＡ
提取试剂盒ꎬ引物合成ꎬ质粒提取试剂盒购自
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司ꎮ Ｘ￣ｇｌｕｃꎬＢＳＡ 购自索来宝公司ꎮ
其它均为国产分析纯试剂ꎮ
１.２　 大豆疫霉诱导及激素诱导处理
　 　 将参试的大豆(Ｗｉｌｌｉａｍｓ)种子播种在蛭石培养
基中ꎬ在 ２５℃ꎬ１６/ ８ ｈ光周期的温室中培养ꎮ 待大豆
生长至两片真叶完全展开后ꎬ轻轻将豆苗从蛭石中拔
出ꎬ用清水冲洗根部的蛭石ꎬ小心尽量不要弄伤根部ꎮ
将新鲜的大豆根浸泡在游动孢子悬浮液(浓度为
１０５个􀅰ｍＬ－１)中ꎬ以清水浸泡作为对照ꎬ分别在接种
后的 ０、０.５和 ２ ｈ 取样ꎬ迅速用滤纸吸干水分并剪下
根部ꎬ保存在液氮中待用ꎮ 把培养 ７ ｄ大的大豆苗从
培养基中拔出ꎬ用清水冲洗根部的蛭石ꎬ分别配置水
８５
　
　 １期 柴春月ꎬ等:大豆中疫霉诱导性 ＧｍＤＲＲＰ基因启动子的克隆与功能分析
杨酸(ＳＡ)ꎬ茉莉酸甲酯(ＭｅＪＡ)ꎬ脱落酸(ＡＢＡ)ꎬ乙烯
利(ＥＴＨ)和赤霉素 (ＧＡ３ )ꎬ并最终调配浓度至
１００ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ꎬ将大豆苗根部浸泡在不同激素中ꎬ以
ｄｄＨ２Ｏ作为对照ꎬ３ ｈ后取样ꎬ用液氮速冻备用ꎮ
１.３　 启动子克隆与载体构建
　 　 在大豆基因组库中寻找基因编号为 Ｇｌｙ￣
ｍａ０１ｇ３１７３０的基因ꎬ确定转录起始位点上游 １ ５９０
ｂｐ作为候选启动子区ꎬ根据其序列设计引物ꎬ分别
在上游引物中引入 Ｋｐｎ Ｉ酶切位点ꎬ下游引物中引
入 Ｂｇｌ ＩＩ酶切位点(表 １)ꎮ 以大豆的基因组为模
板ꎬ将克隆到的启动子片段经 Ｋｐｎ Ｉ 和 Ｂｇｌ ＩＩ 双酶
切后插入到携带有 Ｇｕｓ 报告基因的 ｐＭＤＣ１６２ 载
体上ꎬ将小片段构建在之前已经引入了 ３５Ｓ小启动
子的 ｐＭＤＣ１６２３５Ｓ－ｍｉｎｉ载体上ꎮ 热击转化入大肠杆
菌 ＤＨ５αꎬ用 ＰＣＲ和双酶切的方法鉴定阳性克隆ꎮ
以 ｐＢＩ１２１(含有 ＣａＭＶ ３５Ｓ全长序列和 Ｇｕｓ基因)
作为阳性对照ꎬ只引入了 ３５Ｓ 小启动子的 ｐＭ￣
ＤＣ１６２３５Ｓ－ｍｉｎｉ作为阴性对照ꎮ 利用电击法把这些植
物表达载体分别转入农杆菌 ＧＶ３１０１ꎬ或发根农杆
菌 Ｋ５９９ꎬ用 ＰＣＲ的方法鉴定阳性克隆ꎮ
１.４　 农杆菌介导的烟草瞬时转化与接种
　 　 农杆菌介导的烟草瞬时转化方法是在参考
Ｌｌａｖｅ等[１８]的方法基础上稍有改进ꎮ 挑取转化农
杆菌 ＧＶ３１０１的单克隆ꎬ在含有卡那霉素(５０ μｇ􀅰
ｍＬ－１)的液体 ＬＢ 培养基中ꎬ２８℃震荡培养 ４８ ｈꎬ
３ ０００ ｒｐｍ 离心 １０ ｍｉｎ收集菌体ꎬ用乙酰丁香酮缓
冲液(１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＭｇＣｌ２ꎬ１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ
－１ ＭＥＳꎬ
１５０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１乙酰丁香酮(ｐＨ ５.６))重悬浮 ３次ꎬ
最终稀释到 ＯＤ６００为 ０.５ ~ ０.６ꎬ黑暗室温放置 ３ ｈꎮ
用 １ ｍＬ的注射器将菌液注入 ６ 周大的烟草叶片
背面ꎬ在注射后 ７２ ｈ ꎬ剪下叶片ꎬ浸泡在辣椒疫霉
游动孢子悬浮液(浓度为 １０５个􀅰ｍＬ－１)中ꎬ分别在
接种后 ０、０.５和 ２ ｈ取样ꎬ检测 ＧＵＳ活性ꎮ
１.５　 农杆菌介导的大豆根毛转化与接种
　 　 大豆根毛转化主要参考 Ｓａｖｋａ 等[１９]的方法:挑
取转化发根农杆菌 Ｋ５９９ 的单克隆ꎬ在含有卡那霉
素(５０ μｇ􀅰ｍＬ－１)的液体 ＬＢ培养基中ꎬ２８℃震荡培
养 ４８ ｈꎬ３ ０００ ｒｐｍ 离心 １０ ｍｉｎ 收集菌体ꎬ用 １０
ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＭｇＣｌ２重悬浮ꎬ稀释至终浓度 ＯＤ６００为０.５
~０.６ 备用ꎮ 将无菌大豆种子种在 １ / ２ ＭＳ 培养基
中ꎬ在 ２５℃ꎬ１６ / ８ ｈ 光暗交替培养室中生长５~６ ｄꎬ
在超净台上剪下大豆子叶ꎬ用无菌手术刀在每个子
叶的背面挖洞ꎬ然后摆放在含有头孢和羧苄霉素
(２５０ μｇ􀅰ｍＬ－１)的Ｗｈｉｔｅｒ培养基上ꎬ将稀释好的菌
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ (ＰＣＲ) ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′ ｔｏ ３′) ａ Ｐｕｒｐｏｓｅ
Ｐ８－Ｆ ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＴ
ＧｍＤＲＲＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｌｏｎｅ
ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａ
Ｐ８－Ｒ ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＧＴＡＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡ
ＧｍＤＲＲＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｌｏｎｅ
ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｆ
Ｐ８Ｔ１－Ｒ ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＣＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＧ Ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａ
Ｐ８Ｔ２－Ｆ ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＣＴＣＡＣＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＣ Ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｂ
Ｐ８Ｔ２－Ｒ ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＡＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＣ Ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｂ
Ｐ８Ｔ３－Ｆ ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＴＡＡＧＧＡ Ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ
Ｐ８Ｔ３－Ｒ ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＡＧＡＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡＣＴＣ Ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ
Ｐ８Ｔ４－Ｆ ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴＣＴＡＴＣＣ Ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄ
Ｐ８Ｔ４－Ｒ ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡＴＡ Ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄ
Ｐ８Ｔ５－Ｆ ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣＡ Ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｅ
Ｐ８Ｔ５－Ｒ ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＡＧＧＧＧＡＣＧＴＧＡＧＧＡ Ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｅ
Ｐ８Ｔ６－Ｆ ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＴＣＣＡＡＴＧ Ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｆ
ａ: Ｔｈｅ ｂｏｌｄ ｓｉｔｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｏｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ Ｂｇｌ ＩＩ ａｎｄ Ｋｐｎ Ｉ.
９５
　
植物病理学报 ４５卷
液滴在挖好的洞里ꎬ放置在 ２５℃黑暗条件下的培
养箱中生长 １８~２０ ｄꎮ 待根毛长出 ４ ~ ８ ｃｍ 长时ꎬ
剪下根毛浸泡在大豆疫霉游动孢子悬浮液(１０５个
􀅰ｍＬ－１)中ꎮ 分别在接种后 ０、０.５ 和 ２ ｈ 取样ꎬ检
测 ＧＵＳ活性ꎮ
１.６　 ＧＵＳ活性分析
　 　 参照 Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等[２０]方法测定烟草叶片和根毛
中的 Ｇｕｓ报告基因的表达ꎮ 将需要染色的叶片或
根毛浸泡在 ＧＵＳ染液(５０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１磷酸钠缓冲
液 ｐＨ ７. ０ꎬ １０ ｍｏｌ 􀅰 Ｌ－１ ＥＤＴＡꎬ １ ｍｍｏｌ 􀅰 Ｌ－１
Ｘ￣Ｇｌｕｃꎬ０.１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００ꎬ１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１β￣巯基
乙醇)中ꎬ置于 ３７℃温育 １２ ｈꎬ７５％乙醇冲洗两次ꎬ
再用 ９５％乙醇脱色ꎬ直至底色完全消失ꎮ
　 　 将需要测定 ＧＵＳ酶活的材料置研钵中加液氮研
磨成粉末加入提取缓冲液(５０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＮａＨ２ＰＯ４ꎬ
ｐＨ ７. ０ꎬ １０ ｍｍｏｌ 􀅰 Ｌ－１ ＥＤＴＡꎬ ０. １％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ￣１００ꎬ ０.１(ｗ/ ｖ) 十二烷基磺酸钠ꎬ １０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１
β￣巯基乙醇)ꎬ４℃离心ꎬ上清为 ＧＵＳ 蛋白提取液ꎮ
用 ＢＳＡ 法测定蛋白浓度ꎮ 取出部分加 ＧＵＳ 反应
底物 ４￣ＭＵＧꎬ于 ３７℃ 反应 ３０ ｍｉｎꎬ在激发光
３６５ ｎｍ、发射光 ４５５ ｎｍ 的条件下进行荧光测定ꎬ
３次生物学重复ꎬ最终以单位时间内产物的相对变
化量来计算 ＧＵＳ活性值ꎮ
１.７　 实时荧光定量 ＰＣＲ (ｑＲＴ￣ＰＣＲ)
　 　 将所取植物材料ꎬ置研钵中加液氮研磨成粉末ꎬ
加入试剂盒 ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ (Ｔｉａｎｇｅｎ) 的相应试剂ꎬ提
取总 ＲＮＡꎮ 用 ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ (ＴａＫａ￣
Ｒａ) 反转录为 ｃＤＮＡꎬ并定量到 １００ ｎｇ􀅰μＬ－１ꎮ 以
大 豆 的 ＡＣＴ２０ ( ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ: ＸＭ ＿
００３５３１５１８.１)ꎬ或本氏烟的 ＥＦ１ａ (Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｏ: ＡＦ１２００９３. １) 分别做为内参基因ꎮ 用 ＳＹＢＲ
ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ (ＴａＫａＲａ) 试剂盒ꎬ在 ＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ￣
ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ 荧光定量仪上采用 ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎⅠ荧
光染料法进行 ｑＲＴ－ＰＣＲ分析ꎬ采用相对定量 ２－△△Ｃｔ
法[２１]分析基因的转录水平表达情况ꎮ 实验设计 ３
个生物学重复ꎮ 本实验用到的引物见表 １ꎮ
１.８　 进化树及启动子序列分析
　 　 启动子所包含的顺式元件的分析和预测ꎬ用在线
软件 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ (ｈｔｔｐ: / / ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ.ｐｓｂ.ｕｇｅｎｔ.ｂｅ /
ｗｅｂｔｏｏｌｓ / ｐｌａｎｔｃａｒｅ / ｈｔｍｌ)[２２]ꎮ 用 ＭＥＧＡ ４.０ 软件[２３]
并用邻接法来生成植物抗病反应蛋白的进化树ꎮ
１.９　 数据统计分析
　 　 用邓肯测验(Ｐ<０.０５ Ｄｕｎｃａｎ’ ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ
ｔｅｓｔｓ)分析 ＧＵＳ酶活数据ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 一个大豆疫霉诱导表达基因的鉴定
　 　 Ｚｈｏｕ 等[２４]最近利用基因芯片技术分析了不
同大豆品种在疫霉侵染后的基因表达情况ꎬ结果表
明几乎所有大豆基因的表达都受到疫霉侵染不同
程度地调节ꎮ 根据该基因芯片数据ꎬ我们筛选了
４２个可能受疫霉诱导高度表达的基因(结果未发
表)ꎬ其中一个为 ＧｍａＡｆｆｘ.７６３８４.１.Ｓ１＿ｓ＿ａ ꎬ在大
豆疫霉侵染后的 ３ ｄ 和 ５ ｄꎬ该基因在 ３ 个不同的
大豆品种中均受疫霉高效诱导上调表达(图 １￣Ａ)ꎮ
序列比对发现ꎬ该 ＥＳＴ 为预测的大豆基因 Ｇｌｙ￣
ｍａ０１ｇ３１７３０.１ 的一个片段ꎮ 为了进一步验证该基
因是否受大豆疫霉诱导早期表达ꎬ我们采用游动孢
子接种的方法ꎬ并在接种后的 ０、０.５ 和 ２ ｈ 分别取
样ꎬ通过 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 的方法分析其表达特征ꎮ 结果
表明ꎬ与 ０ ｈ 未接种相比ꎬ该基因能在接种后的
０.５ ｈ上调表达 ７倍左右ꎬ在接种后的 ２ ｈ上调表达
３０ 倍左右(图 １￣Ｂ)ꎮ 由此可见ꎬ大豆基因组中编
号为 Ｇｌｙｍａ０１ｇ３１７３０.１ 的基因是一个在大豆疫霉
侵染早期高效表达的基因ꎮ
２.２　 大豆疫霉诱导表达基因的功能分析
　 　 为了进一步研究该基因ꎬ我们从大豆基因组库
中下载了该基因的全长序列ꎬ通过生物信息学方法
预测其功能ꎮ 结果发现该基因的开放阅读框为 ５７０
ｂｐꎬ基因内没有内含子序列ꎬ编码一个含 １８９个氨基
酸残基的蛋白质ꎬＮ端的前 ２２个氨基酸残基组成信
号肽序列ꎮ 该蛋白与已知的蓖麻、拟南芥、苜蓿、芜
菁等植物来源的抗病相关蛋白[２５~２７]有很高的同源
性(图 ２￣Ａ)ꎬ其中与苜蓿中的抗病相关蛋白
(ＭｔＤＲＲＰ２)的相似性达到 ５４.３％ꎮ 用 ＳＭＡＲＴ在线
分析系统进一步分析其结构域ꎬ发现其蛋白序列从
４４位到 １８８位氨基酸的区域能形成完整的抗病反应
蛋白 所 特 有 的 结 构 域 ( ｄｉｒｉｇｅｎｔ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ )
(图 ２￣Ｂ)ꎮ 这些结果表明ꎬ该基因编码大豆中的一
个抗病相关蛋白ꎬ我们将其命名为 ＧｍＤＲＲＰꎮ
０６
　
　 １期 柴春月ꎬ等:大豆中疫霉诱导性 ＧｍＤＲＲＰ基因启动子的克隆与功能分析
Ｆｉｇ. １　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｍＤＲＲＰ ｇｅｎｅ
Ａ: Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＧｍＤＲＲＰ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａꎻ Ｂ: Ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｍＤＲＲＰ ｇｅｎｅ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｒｏｏｔｓ.
Ｆｉｇ. ２　 Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＧｍＤＲＲＰ
Ａ: Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ＤＲＲＰｓ. Ｔｈｅ ｔｒｅｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｈｅ ＭＥＧＡ ｐｒｏｇｒａｍꎻ Ｂ: Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ＤＲＲＰ.
２.３　 预测 ＧｍＤＲＲＰ基因启动子的顺式元件及激
素诱导表达分析
　 　 我们克隆该基因转录起始位点上游的 １ ５９０
ｂｐ为启动子区ꎬ并用 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ 在线软件预测启
动子区所包含的顺式元件ꎮ 结果表明ꎬ在 Ｇｍ￣
ＤＲＲＰ基因启动子区主要包含 ３ 类顺式作用元件
(图 ３):第一类是基础表达元件包括 ＣＡＡＴ￣ｂｏｘ 和
ＴＡＴＡ￣ｂｏｘꎬ说明 ＧｍＤＲＲＰ启动子是一个典型的由
１６
　
植物病理学报 ４５卷
ＲＮＡ聚合酶 ＩＩ结合的启动子ꎻ第二类是包括已经
研究报道很多的病原诱导性顺式作用元件ꎬ如有
１３个 ＧＴ－１ꎬ６ 个 ＷＲＫＹꎻ第三类是激素诱导反应
顺式作用元件ꎬ如一个生长素诱导相关的 Ａｒｆꎬ赤
霉素诱导相关元件包括 １４ 个 Ｄｏｆ、１ 个 ＧＡＲＥ、２
个 ＭＹＢ 等ꎬ一个 ＡＢＡ 诱导相关的 ＡＢＲＥꎮ 由此
推测ꎬＧｍＤＲＲＰ 启动子可能是一个受生物因素和
非生物因素诱导表达的启动子ꎮ
　 　 由于该启动子中包含有一些响应激素诱导的
顺式元件ꎬ我们检测了该基因是否也同时受激素诱
导ꎮ 将生长 ７ ｄ 的大豆苗根部分别浸泡在以下 ５
种激素中:水杨酸(ＳＡ)ꎬ茉莉酸甲酯(ＭｅＪＡ)ꎬ脱
落酸(ＡＢＡ)ꎬ乙烯(ＥＴＨ)和赤霉素(ＧＡ３)ꎬ以清水
作为对照ꎬ３ ｈ 后取样ꎬ提取总 ＲＮＡꎬ用荧光定量
ＰＣＲ方法检测该基因受不同激素诱导后转录水平
的表达(图 ４)ꎮ 结果显示ꎬ用不同激素处理后ꎬ该
基因的表达量均低于对照水平ꎬ说明该基因的表达
受到了激素的抑制ꎮ
２.４　 烟草瞬时表达体系中 ＧｍＤＲＲＰ 启动子诱导
表达能力的验证
　 　 为了进一步研究 ＧｍＤＲＲＰ启动子的诱导表达
能力ꎬ我们克隆了 ＧｍＤＲＲＰ 基因转录起始位点上
游 １ ５９０ ｂｐ的片段ꎬ将其构建在 ｐＭＤＣ１６２ 载体上
(图 ５￣Ａ)ꎬ由农杆菌(ＧＶ３１０１)介导瞬时表达烟草
(本氏烟)叶片 ７２ ｈ 后ꎬ剪下叶片并浸泡在辣椒疫
霉游动孢子悬浮液中ꎬ在处理前期取样ꎮ 化学组织
染色的结果表明(图 ５￣Ｂ):与阴性对照(３５Ｓ ｍｉｎｉ
启动子)相比ꎬＧｍＤＲＲＰ启动子能在瞬时转化烟草
叶片上驱动报告基因的表达ꎬ并且在疫霉接种过程
中其表达程度增强ꎻ但与阳性对照(３５Ｓ强启动子)
组成性启动子相比ꎬ其表达能力稍弱ꎮ 进一步通过
测定样品中 ＧＵＳ 酶活来量化这种变化(图 ５￣Ｃ)ꎬ
结果表明ꎬ与未接种样品相比ꎬＧｍＤＲＲＰ 启动子能
在接种后的 ０.５ ｈ驱动报告基因上调表达 ４.７倍ꎬ在
接种后的 ２ ｈ驱动报告基因上调表达 ５.６倍ꎮ 在阴
性对照样品中几乎检测不到 ＧＵＳ酶的活性ꎬ在阳性
对照样品中ꎬ组成性表达的３５Ｓ启动子能持续驱
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｃｉｓ￣ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＧｍＤＲＲＰ
Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅｓ (＋１) ａｒｅ ｓｈｏｗｎ ｕｎｄｅｒ ＡＴＧ. Ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅｓ (＋１)
ｉｓ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ. Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｏｔｉｆｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ
ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｓｈａｄｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｎａｍｅｓ ａｒｅ ｇｉｖｅｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ.
２６
　
　 １期 柴春月ꎬ等:大豆中疫霉诱导性 ＧｍＤＲＲＰ基因启动子的克隆与功能分析
Ｆｉｇ. ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｏｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ＧｍＤＲＲＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ
Ｆｉｇ. ５　 Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧｍＤＲＲＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｕｐｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ
ｃａｐｓｉｃｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｌｅａｖｅｓ
Ａ: Ｓｃｈｅｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｇｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ. Ｂ: Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＧＵＳ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ＧｍＤＲＲＰ: ＧＵＳ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｉｎ Ｎ. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｌｅａｖｅｓ. Ｃ: Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ６￣ｗｅｅｋ￣ｏｌｄ Ｎ. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｌｅａｖｅｓ.
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｏｎｅ ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ ｗｉｔｈ ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ.
动报告基因的高水平表达ꎬ并且其表达活性高于
ＧｍＤＲＲＰ启动子ꎮ 以上结果说明ꎬ烟草瞬时表达
体系中ꎬＧｍＤＲＲＰ 启动子能在疫霉的诱导下驱动
报告基因的上调表达ꎮ
２.５　 大豆根毛转化体系中 ＧｍＤＲＲＰ 启动子诱导
表达能力的研究
　 　 为了进一步研究该启动子是受疫霉诱导表达
的ꎬ我们将这些植物表达载体ꎬ通过发根农杆菌
(Ｋ５９９菌株)介导法稳定转化大豆(Ｗｉｌｌｉａｍｓ)根
毛ꎬ用大豆疫霉游动孢子接种ꎬ检测 ＧｍＤＲＲＰ 启动
子在大豆根毛中驱动报告基因的表达情况ꎮ 图 ６Ａ
显示了对转基因根毛化学组织染色的结果ꎬ表明
ＧｍＤＲＲＰ启动子能在转基因大豆根毛中持续驱动
报告基因的表达ꎬ并且随着疫霉接种的时间延长而
活性增强ꎮ 在阴性对照中没观察到颜色变化ꎬ而在
阳性对照的根毛中有较强的颜色变化ꎮ 测定 ＧＵＳ
酶活表明 ＧｍＤＲＲＰ启动子在接种后的 ０.５ ｈꎬ其表
达能力提高到对照的 ２.８ 倍ꎬ在接种后 ２ ｈ 其表达
能力提高到对照的 ３.１ 倍(图 ６￣Ｂ)ꎮ 上述实验结
３６
　
植物病理学报 ４５卷
果说明ꎬ在大豆根毛稳定表达体系中 ＧｍＤＲＲＰ 启
动子能在疫霉的诱导下驱动报告基因的诱导表达ꎮ
２.６　 ＧｍＤＲＲＰ启动子的缺失突变体分析
　 　 为了进一步找到启动子中控制其诱导表达的
顺式元件或 ｍｏｔｉｆꎬ我们结合前面对启动子区所包
含的已知和未知的顺式元件的生物信息学分析结
果ꎬ直接将启动子截分为不同长度的小片段(图
７)ꎬ并将这些小片段分别构建在 ｐＭＤＣ１６２３５Ｓ－ｍｉｎｉ载
Ｆｉｇ. ６　 Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＧｍＤＲＲＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ
Ａ: Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｏｙｂｅａｎ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ.
Ｂ: Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ.
Ｆｉｇ. ７　 Ｔｈｅ ｏｖｅｒａｌｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｓｏｙｂｅａｎ ＧｍＤＲＲＰ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
Ａ: Ｔｈｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ －４６ ＣａＭＶ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｐＭＤＣ１６２ ꎻ
Ｂ: Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｓｃｈｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｗｉｔｈ ａ ｌｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ.
Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｕｐｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｓｈｏｗｎ ａｔ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ.
Ｍｅａｎｓ ｔｈａｔ ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ (Ｐ< ０.０５ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔｓ) .
４６
　
　 １期 柴春月ꎬ等:大豆中疫霉诱导性 ＧｍＤＲＲＰ基因启动子的克隆与功能分析
体中(图 ５￣Ａ)ꎮ 瞬时表达烟草后ꎬ检测 ＧＵＳ酶活ꎮ
结果 显 示ꎬ 只 有 小 片 段 Ａ ( － １ ５９０ ｂｐ 至
－１ ３６８ ｂｐ)表现出部分疫霉诱导表达能力ꎬ能在接
种后 ２ ｈ 驱动报告基因上调表达 １.９ 倍ꎬ与全长启
动子在诱导后 ２ ｈ 上调表达 ５.６ 倍相比ꎬ其诱导表
达能力达到全长的 ３４％ꎬ依据邓肯分析(Ｐ < ０.０５
Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔｓ)结果ꎬ在 Ｐ < ０.０５的
水平下其活性显著高于其余小片段ꎮ 在小片段 Ａ
中包含了四个已知的与病原诱导相关的 ＧＴ￣１ 元
件[２８]ꎬ一个与赤霉素诱导相关的 Ｄｏｆ 元件[２９]ꎬ一
个ＷＲＫＹ转录因子结合区域[３０]ꎬ一个与生长素诱
导相关的 Ａｒｆ 元件[３１]ꎮ 对 ＧｍＤＲＲＰ 基因启动子
缺失突变的研究表明ꎬ片段 Ａ 具有一定的疫霉诱
导表达能力ꎬ但仍然低于全长启动子的活性ꎬ说明
该启动子诱导表达活性可能由整个片段决定ꎬ没有
明显的有高活性的区域ꎮ
３　 讨论
　 　 到目前为止ꎬ在大豆上已报道 ２２ 个疫霉侵染
诱导表达的基因ꎬ这些基因多为侵染后期受诱导表
达[２４ꎬ ３２ꎬ３３]ꎮ 在本研究中ꎬ发现大豆的抗病相关基
因 ＧｍＤＲＲＰ能在疫霉侵染后的 ０.５ ｈ就上调表达ꎬ
在 ２ ｈ表达量就达到较高水平ꎬＤＲＰＰ 存在于许多
植物中ꎬ并与植物的防卫反应相关ꎮ 我们进一步克
隆其启动子区ꎬ构建植物表达载体ꎬ通过烟草瞬时
表达和大豆根毛稳定转化体系ꎬ进一步研究了启动
子的疫霉诱导表达能力ꎬ发现它能在疫霉侵染后的
０.５和 ２ ｈ 驱动报告基因的高效表达ꎮ 有意思的
是ꎬ我们发现在转化表达体系中ꎬＧｍＤＲＲＰ 基因启
动子驱动报告基因受疫霉诱导表达能力弱于
ＧｍＤＲＲＰ基因启动子在大豆中驱动内源基因的表
达ꎬ分析其原因可能是因为启动子驱动内源基因的
表达与驱动外源报告基因表达是不同的ꎬ其机制还
尚不清楚[３４]ꎮ 另外ꎬ我们还发现在烟草实验体系
中ꎬ该启动子驱动报告基因的表达都有一定的背景
信号ꎬ也就是在接种 ０ ｈ的样品中也能检测到报告
基因的表达ꎬ我们分析其原因可能是在农杆菌注射
过程中ꎬ对叶片造成了伤害ꎬ而有研究证明很多病
原诱导性启动子也受伤口的诱导[３５]ꎮ
　 　 在大豆抗疫霉基因工程中ꎬ关于大豆疫霉诱导
性启动子的研究ꎬ报道相对较少ꎮ 本实验室还筛选
到一个大豆中的多酚氧化酶(ＧｍａＰＰＯ１２)基因启
动子ꎬ该启动子能在疫霉侵染早期高效的驱动报告
基因 ＧＵＳ的诱导表达[３６]ꎮ 在用同与本研究的激
素处理时ꎬＧｍａＰＰＯ１２启动子表现出受 ＡＢＡ 的诱
导上调表达ꎬ受其它四种激素的抑制ꎮ 而ＧｍＤＲＲＰ
这个抗病相关基因启动子同样是一个在疫霉侵染
早期诱导表达的ꎬ只是其诱导能力弱于ＧｍａＰＰＯ１２
启动子ꎮ 在用激素处理时ꎬＧｍＤＲＲＰ启动子表现
了受激素的抑制ꎬ但其受抑制的原因还尚不清楚ꎮ
　 　 为了寻找启动子中调控其疫霉诱导表达的核
心序列ꎬ我们根据启动子中所包含顺式元件的生物
信息学分析结果ꎬ将启动子截成不同长度的小片
段ꎬ进一步对小片段的疫霉诱导活性进行分析ꎬ结
果显示ꎬ只有－１ ５９０至 －１ ３６８ ｂｐ区域具有相对较
高的疫霉诱导活性ꎬ但总体这些缺失后的小片段疫
霉诱导活性都明显低于全长启动子ꎬ说明该启动子
诱导表达活性由整个片段决定ꎬ没有明显的有高活
性的区域ꎮ
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５６
　
植物病理学报 ４５卷
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７ (７): ３２５.
[１５] Ｌｉｕ Ｗꎬ Ｍａｚａｒｅｉ Ｍꎬ Ｒｕｄｉｓ Ｍ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒａｐｉｄ ｉｎ ｖｉｖｏ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｐｈｙｔｏｓｅｎｓｉｎｇ [ Ｊ] . ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ １１:
１０８－１１７.
[１６] Ｓａｎｄｈｕ Ｄꎬ Ｓｃｈａｌｌｏｃｋ Ｋ Ｇꎬ Ｒｉｖｅｒａ￣Ｖｅｌｅｚ Ｎꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｓｏｙｂｅａｎ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ Ｒｐｓ８ ｍａｐｓ
ｃｌｏｓｅｌｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｐｓ３ ｒｅｇｉｏｎ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｒｅｄｉｔｙꎬ
２００５ꎬ ９６ (５): ５３６－５４１.
[１７] Ｔｙｌｅｒ Ｂ Ｍ. Ｅｎｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｂｒｅａｋｉｎｇ: ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｏｏｍｙｃｅｔｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ [ Ｊ] . Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ １１ (１): １３－２０.
[１８] Ｌｌａｖｅ Ｃꎬ Ｋａｓｓｃｈａｕ Ｋ Ｄꎬ Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ Ｊ Ｃ. Ｖｉｒｕｓ￣ｅｎｃｏ￣
ｄｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ
ｔａｒｇｅｔｓ ａ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｓｔｅｐ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ
[Ｊ] . ＰＮＡＳꎬ ２０００ꎬ ９７ (２４): １３４０１－１３４０６.
[１９] Ｓａｖｋａ Ｍ Ａꎬ Ｒａｖｉｌｌｉｏｎ Ｂꎬ Ｎｏｅｌ Ｇ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｏｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｕｓｅ ｔｏ ｐｒｏｐａｇａｔｅ ｔｈｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ [ Ｊ ] .
Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９９０ꎬ ８０ (５): ５０３－５０８.
[２０] Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｒ Ａꎬ Ｋａｖａｎａｇｈ Ｔ Ａꎬ Ｂｅｖａｎ Ｍ Ｗ. ＧＵＳ
ｆｕｓｉｏｎｓ: ｂｅｔａ￣ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ａｓ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ
ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ [ Ｊ] . Ｔｈｅ ＥＭＢＯ
Ｊｏｕｒｎａｌꎬ １９８７ꎬ ６ (１３): ３９０１－３９０７.
[２１] Ｌｉｖａｋ Ｋ Ｊꎬ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ Ｔ Ｄ. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ
ｔｈｅ ２－ΔΔＣＴ ｍｅｔｈｏｄ [Ｊ] . Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ２００１ꎬ ２５ (４): ４０２－
４０８.
[２２] Ｒｏｍｂａｕｔｓ Ｓꎬ Ｄéｈａｉｓ Ｐꎬ Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｌａｎｔ￣
ＣＡＲＥꎬ ａ ｐｌａｎｔ ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｄａｔａｂａｓｅ
[Ｊ] . Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ １９９９ꎬ ２７ (１): ２９５ －
２９６.
[２３] Ｔａｍｕｒａ Ｋꎬ Ｄｕｄｌｅｙ Ｊꎬ Ｎｅｉ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. ＭＥＧＡ４: ｍｏｌｅｃｕ￣
ｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ (ＭＥＧＡ) ｓｏｆｔｗａｒｅ
ｖｅｒｓｉｏｎ ４. ０ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ
２００７ꎬ ２４ (８): １５９６－１５９９.
[２４] Ｚｈｏｕ Ｌꎬ Ｍｉｄｅｒｏｓ Ｓ Ｘꎬ Ｂａｏ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｒｅｍｏｄｅｌ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｓｏｙｂｅａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ
[Ｊ] . ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ ２００９ꎬ １０ (１): ４９－５９.
[２５] Ｔａｎｇ Ｄꎬ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ Ｋ Ｍꎬ Ｉｎｎｅｓ Ｒ Ｗ. Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎬ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓꎬ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈꎬ
ａｎｄ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ＥＤＲ１
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ ２００５ꎬ １３８ (２):
１０１８－１０２６.
[２６] Ｂｅｌｋｈａｄｉｒ Ｙꎬ Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ Ｒꎬ Ｄａｎｇｌ Ｊ Ｌ. Ｐｌａｎｔ
ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ: ＮＢＳ￣ＬＲＲ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐａｒｔｎｅｒｓ [ Ｊ ] . Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ
Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ ７ (４): ３９１－３９９.
[２７] Ｍｅｙｅｒｓ Ｂ Ｃꎬ Ｄｉｃｋｅｒｍａｎ Ａ Ｗꎬ Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ Ｒ Ｗꎬ ｅｔ
ａｌ. Ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ
ａｎ ａｎｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏ￣
ｔｉｄｅ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ [ Ｊ ] . Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ
１９９９ꎬ ２０ (２): ３１７－３３２.
[２８] Ｂｕｃｈｅｌ Ａ Ｓꎬ Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ Ｆ Ｔꎬ Ｂｏｌ Ｊ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｕｔａｔｉｏｎ
ｏｆ ＧＴ￣１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒ￣１Ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ
ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ [ Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９９ꎬ ４０ (３): ３８７－３９６.
[２９] Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｓ. Ｄｏｆ１ ａｎｄ Ｄｏｆ２ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｒｅ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ
ｉｎ ｃａｒｂｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｍａｉｚｅ [Ｊ] . Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ
２０００ꎬ ２１(３): ２８１－２８８.
[３０] Ｘｉｅ Ｚꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚ Ｌꎬ Ｚｏｕ Ｘꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ＷＲＫＹ ｇｅｎｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ
ｒｅｖｅａｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ａｌｅｕｒｏｎｅ ｇｅｌｌｓ. [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ.
２００５ꎬ １３７:１７６－１８９.
[３１] Ｍａｒｕｙａｍａ￣Ｎａｋａｓｈｉｔａ Ａꎬ Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙꎬ Ｗａｔａｎａｂｅ￣Ｔａ￣
ｋａｈａｓｈｉ Ａꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ
ｅｌｅｍｅｎｔ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｓｕｌｆｕｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ａｒａｂｉ￣
ｄｏｐｓｉｓ ｒｏｏｔｓ [ Ｊ] . Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２００５ꎬ ４２ (３):
３０５－３１４.
[３２] Ｍｏｙ Ｐꎬ Ｑｕｔｏｂ Ｄꎬ Ｃｈａｐｍａｎ Ｂ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ
ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｐｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２００４ꎬ １７ (１０): １０５１－１０６２.
[３３] Ｖｅｇａ￣Ｓáｎｃｈｅｚ Ｍ Ｅꎬ Ｒｅｄｉｎｂａｕｇｈ Ｍ Ｇꎬ Ｃｏｓｔａｎｚｏ Ｓꎬ ｅｔ
ａｌ. Ｓｐａｔｉａｌ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｅｆｅｎｓｅ￣
ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ
ｏｆ ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ [Ｊ] . Ｐｈｙｓｉｏ￣
ｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００５ꎬ ６６ (５):
１７５－１８２.
[３４] Ｋｏｈｌｉ Ａꎬ Ｔｗｙｍａｎ Ｒ Ｍꎬ Ａｂｒａｎｃｈｅｓ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｒａｎｓ￣
ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎꎬ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００３ꎬ ５２ (２): ２４７－
２５８.
[３５] Ｅｕｌｇｅｍ Ｔꎬ Ｒｕｓｈｔｏｎ Ｐ Ｊꎬ Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅａｒｌｙ
ｎｕｃｌｅａｒ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ: ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＷＲＫＹ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ [ Ｊ] . Ｔｈｅ
ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ １９９９ꎬ１８ (１７): ４６８９－４６９９.
[３６] Ｃｈａｉ Ｃꎬ Ｌｉｎ Ｙꎬ Ｓｈｅｎ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｙｂｅａｎ ＧｍａＰＰＯ１２
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ ｉｎｄｕｃｅｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ [Ｊ] . ＰＬｏＳ Ｏｎｅꎬ ２０１３ꎬ ８ (６): １－６.
责任编辑:李晖
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