全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４３(４): ３３７￣３４３(２０１３)
Ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｄａｔｅ: ２０１２￣０５￣１０ꎻ Ｒｅｖｉｓｅｄ ｄａｔｅ: ２０１３￣０４￣１９
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｉｔｅｍ: Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (“９７３” Ｐｒｏｇｒａｍ: ２００２ＣＢ１１１４０６)ꎻ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (２００２ＣＢ１１１４０６) ａｎｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｃｈａｎｇｊｉａｎｇ Ｓｃｈｏｌａｒｓ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｔｅａｍ ｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ( ＩＲＴ１０４２)
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ: ＺＨＡＮＧ Ｇｕｏ￣ｚｈｅｎꎬ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒꎬ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｆｕｎｇａｌ ｂｉｏｌｏｇｙꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｚｈａｎｇｇｚｈ＠ｃａｕ. ｅｄｕ. ｃｎ.
Ｂｉｏｇｒａｐｈｙ: ＬＩＡＮＧ Ｈｏｎｇꎬ ｆｅｍａｌｅꎬ Ｐｈ. Ｄ. ꎬ ｍａｊｏｒ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｉａｎｇｈｏｎｇ＿２００４＠１２６. ｃｏｍ.
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ
Ｋüｈｎ ｂｙ Ｉｎｔｅｒ￣ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ Ｍａｒｋｅｒ
ＬＩＡＮＧ Ｈｏｎｇ１ꎬ ２ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｇｕｏ￣ｚｈｅｎ１∗
( １ Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ / Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ
Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ Ｋüｈｎ ( ＴＣＫ)ꎬ ｃａｕｓｉｎｇ ｗｈｅａｔ ｄｗａｒｆ ｂｕｎｔꎬ ｉｓ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｌｙ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ
ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ. Ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ
ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＫ. Ｉｎｔｅｒ￣ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ( ＩＳＳＲ) ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ＴＣＫ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ. Ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａꎬ
ＴＣＫＦ / ＴＣＫＲꎬ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ １ １１３ ｂｐ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ＩＳＳＲ
ｐｒｉｍｅｒ Ｐ４. Ａｎ ａｍｐｌｉｃｏｎ ｏｆ ８８２ ｂｐ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ｉｎ １２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ＴＣＫ ｂｕｔ ａｂｓｅｎｔ
ｉｎ １４ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｔ. ｃａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｔ. ｆｏｅｔｉｄａ. Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｒｉｍｅｒｓ ＴＣＫＦ / ＴＣＫＲ ｗａｓ １ ｎｇ ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ｉｎ ａ ２５ μＬ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ. Ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ￣
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃｏｕｌｄ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ＴＣＫ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｌｏｓｅ￣
ｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ Ｔ. ｃａｒｉｅｓ. Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＫ ｕｓｉｎｇ ＩＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ
ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｏｆ ＴＣＫ ａｎｄ ｉｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｄｗａｒｆ ｂｕｎｔ ｏｆ ｗｈｅａｔꎻ ＩＳＳＲ ｍａｒｋｅｒꎻ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
基于 ＩＳＳＲ标记开发的一种用于小麦矮腥黑穗病菌的分子鉴定方法 梁 宏１ꎬ ２ꎬ 张国珍１∗( １农业
部植物病理学重点实验室ꎬ 中国农业大学植物病理学系ꎬ 北京 １００１９３ꎻ ２ 中国科学院微生物研究所ꎬ 北京 １００１０１)
摘要:小麦矮腥黑穗病菌(Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ Ｋüｈｎꎬ 简称 ＴＣＫ)是小麦上的一种重要检疫性真菌ꎮ 本研究利用内部简单重
复序列( Ｉｎｔｅｒ￣ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔꎬ ＩＳＳＲ)技术研究 ＴＣＫ及其近缘种的 ＤＮＡ多态性ꎬ开发了一种可靠而简单的方法用于
ＴＣＫ的分子鉴定ꎮ 用 ＩＳＳＲ引物 Ｐ４ 从 ＴＣＫ 中扩增出一条 １ １１３ ｂｐ 的特异性条带ꎬ据此设计了一对特异性引物 ＴＣＫＦ /
ＴＣＫＲꎬ在 １２ 个 ＴＣＫ菌株中均能扩增得到一条 ８８２ ｂｐ的特异性条带ꎬ而其他近缘种包括小麦网腥黑穗病菌(Ｔ. ｃａｒｉｅｓ)和
小麦光腥黑穗病菌(Ｔ. ｆｏｅｔｉｄａ)及相关黑粉菌的 １４ 个菌株均无扩增条带ꎮ 用该特异性引物检测 ＴＣＫ的下限为 ２５ μＬ反应
体系中可检测到 １ ｎｇ ＤＮＡ模板ꎮ 本研究开发的种特异性引物ꎬ可将 ＴＣＫ与其形态上相似的近缘种尤其是小麦网腥黑穗
病菌准确区分开ꎬ本研究基于 ＩＳＳＲ标记建立的小麦矮腥黑穗病菌的分子鉴定方法为腥黑粉菌的检疫提供了一种便捷的方
法ꎬ是对现有分子鉴定方法的一个补充ꎮ
关键词: 小麦矮腥黑穗病ꎻ ＩＳＳＲ标记ꎻ 快速鉴定
中图分类号: Ｓ４３５. １２ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０４￣０３３７￣０７
植物病理学报 ４３ 卷
Ｄｗａｒｆ ｂｕｎｔ ｏｆ ｗｈｅａｔꎬ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏ￣
ｖｅｒｓａꎬ ｗａｓ ｆｉｒｓｔｌｙ ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ｍｏｎｔａｎａ ｉｎ １９３５ ａｎｄ
ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｉｎ ｍａｎｙ ａｒｅａｓ ｗｏｒｌｄ￣
ｗｉｄｅ[１]ꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｃａｎａｄａ ｏｆ
Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａꎬ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ ａｎｄ Ｕｒｕｇｕａｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ
Ａｍｅｒｉｃａꎬ ａｎｄ ｓｅｖｅｒａｌ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ
Ａｓｉａ[２] . Ｄｗａｒｆ ｂｕｎｔ ｉｓ ｌｉｋｅｌｙ ｔｏ ｏｃｃｕｒ ｉｎ ａｎｙ ｗｈｅａｔ￣
ｇｒｏｗｉｎｇ ａｒｅａｓ ｔｈａｔ ｈａｖｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｓｎｏｗ ｃｏｖｅｒ ｒｅｇｕ￣
ｌａｒｌｙ. Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｈａｓ ａ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅ￣
ｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｂｅｔｗｅｅｎ
３℃ ｔｏ ８℃ [１] . Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ ａｒｅ ｏｆｔｅｎ ｄｗａｒｆｅｄ
ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｉｌｌｅｒ ｎｕｍｂｅｒｓ. Ａ ｋｅｒｎｅｌ ｉｎ ａ ｓｅ￣
ｒｉｏｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｓｏｒｕｓ (ｂｕｎｔ ｂａｌｌ)ꎬ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｒｏｗｎ ｔｏ ｂｌａｃｋꎬ ｆｅｔｉｄ ｍａｓｓｅｓ ｏｆ ｔｅｌｉｏ￣
ｓｐｏｒｅｓ[２] . Ｔｈｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｈａｓ ｏｃｃａｓｉｏｎａｌｌｙ ｃａｕｓｅｄ ｓｅ￣
ｖｅｒｅ ｌｏｓｓｅｓ ｔｏ ｗｉｎｔｅｒ ｗｈｅａｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉ￣
ｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ[２] . Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｄｗａｒｆ ｂｕｎｔ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｐｏｎ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓꎬ ｗｈｉｃｈ
ｃａｎ ｋｅｅｐ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｕｐ ｔｏ １０￣１５ ｙｅａｒｓ ｏｖｅｒ ａ ｗｉｄｅ
ｒａｎｇｅ ｏｆ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ[２] .
Ｄｗａｒｆ ｂｕｎｔ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ￣
ａｌｌｙ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ. Ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｈａｓ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｖａｌ￣
ｕｅ. Ｓｅｖｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃꎬ ｓｅｒｏｌｏｇｉ￣
ｃａｌꎬ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ
ｓｍｕｔ ｆｕｎｇｉ[１] . Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｇｅｒｍｉ￣
ｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｏｆ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ[３ꎬ ４]ꎬ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎ￣
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ[５ꎬ ６]ꎬ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕ￣
ｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ[７] ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ[８ꎬ ９] ｈａｖｅ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ: ｉｎ￣
ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔꎬ ｔｉｍｅ￣ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ ａｎｄ ｌａｃｋ ｏｆ ａｃｃｕｒａｃｙ.
Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｉｔ ｉｓ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏ￣
ｖｅｒｓａ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅ￣
ｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ Ｔ.
ｃａｒｉｅｓꎬ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｔｈｅｒｅ￣
ｆｏｒｅꎬ ｍｅｔｈｏｄｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｈａｖｅ
ｏｂｖｉｏｕｓ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｏｎｅｓ ｂｅ￣
ｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅꎬ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｔｉｍｅ￣ｓａｖ￣
ｉｎｇ ａｓｐｅｃｔｓ.
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ (ＰＣＲ) ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｅｓ￣
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｓ ｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｐｏ￣
ｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｏｓｅ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ￣ｌｉｓｔｅｄ ｆｕｎｇｉ.
Ｓｅｖｅｒａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＲＡＰＤ (ｒａｎｄｏｍ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ) [１０ꎬ １１]ꎬ ＳＳＲ ( ｓｉｍｐｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ) [１２]ꎬ ＩＳＳＲ ( ｉｎｔｅｒ￣ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔ) [１３ꎬ １４] ａｎｄ ＡＦＬＰ ( ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ) [１５] ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ
ＰＣＲ￣ｂａｓｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ. Ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓꎬ ＩＳＳＲ
ｃａｎ ｒｅｖｅａｌ ｈｉｇｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｎｏ ｉｎｔｒｉｃａｔｅ
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ. Ｔｈｅ ＩＳＳＲ ｍｅｔｈｏｄ ｕｎｃｏｖｅｒｓ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｂｙ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ￣ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ １６￣１８
ｂｐ ｌｏｎｇꎬ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ａ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｌａｎｋｅｄ ａｔ
ｔｈｅ ３′ ｏｒ ５′ ｅｎｄ ｂｙ ２￣４ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ[１４] . ＩＳＳＲ
ｓｈｏｗｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｂｅｔｔｅｒ ｒｅｐｅａｔａ￣ｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ
ｔｈａｎ ＲＡＰＤꎬ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅｒ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ
ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｅｘｐｅｎｓｅ ｔｈａｎ ＳＳＲ ａｎｄ ＡＦＬＰ.
Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ＩＳＳＲ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｆｉｎｄ ｐｏｌｙ￣
ｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ
ｓｐｅｃｉｅｓ. Ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ
ｒａｐｉｄ ＰＣＲ￣ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏ￣
ｖｅｒｓａ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｍｕｔ ｆｕｎｇｉ ｏｆ ｗｈｅａｔꎬ ｅｓｐｅ￣
ｃｉａｌｌｙ Ｔ. ｃａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｔ. ｆｏｅｔｉｄａ.
１ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ
１. １ Ｆｕｎｇａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｔｗｅｌｖｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａꎬ ｔｈｒｅｅ ｉｓｏ￣
ｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔ. ｃａｒｉｅｓꎬ ｓｅｖｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔ. ｆｏｅｔｉｄａꎬ ｏｎｅ
ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ Ｔ. ｂｒｏｍｉꎬ ｏｎｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ Ｔ. ｂａｒｃｌａｙａｎａ
ａｎｄ ｔｗｏ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙ. Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ
Ｐｒｏｆ. Ｃｈｅｎ Ｗａｎ￣ｑｕａｎ ( Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)ꎻ ｏｔｈｅｒ
ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｋｉｎｄｌｙ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｆ. Ｃｈｅｎ Ｘｉｕ￣
ｒｏｎｇ (Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ) ａｎｄ ＨＡＭＳ
( Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃｕｍ Ａｃａｄｅｍｉａｅ Ｓｉｎｉｃａｅꎬ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ) .
１. ２ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
Ｔｈｅ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ ｏｆ ｔｅｓｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒａｐｅｄ
ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｂｙ ｇｒｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｆｉｎｅ
ｐｏｗｄｅｒ ｕｎｄｅｒ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ. Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ
ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｆｕｎｇａｌ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ
ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ[１６] . ＤＮＡ
８３３
４ 期 LIANG Hong,et al.: Molecular Identification of T. controversa Kühn by Inter￣simple Sequence Repeat Marker
ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｕｎｄｅｒ ＵＶ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ０. ８％
(ｗ / ｖ) ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ
ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ￣１０００ ｓｐｅｃｔｒｏ￣
ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ (Ｔｈｅｒｍｏꎬ ＵＳＡ) . Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ＤＮＡ
ｆｒｏｍ ａｌｌ ｔｈｅｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｏｒｅｄ ａｔ － ２０℃ ａｎｄ
ｕｓｅｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ＰＣＲ.
１. ３ ＩＳＳＲ
Ｓｉｘ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ( Ｐ４: ５′￣ ＫＶＲＶＲＶ(ＣＴ) ６ ￣
３′ꎬ Ｐ５: ５′￣ ＫＨＦＨＦＨ (ＡＣ) ６ ￣３′ꎬ Ｐ８９０: ５′￣ ＶＨＶ
(ＧＴ) ７ ￣３′ꎬ Ｐ８８４: ５′￣ ＨＢＨ (ＡＧ) ７ ￣３′ꎬ Ｐ８５９: ５′￣
(ＴＧ) ８ ＲＣ￣３′ ａｎｄ Ｐ８３５: ５′￣ (ＡＧ) ８ ＹＣ￣３′) ｗｅｒｅ
ｕｓｅｄ ｉｎ ＩＳＳＲ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ａｌｌ ＰＣＲｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｉｎ
２５ μＬ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ３０ ｎｇ ＤＮＡ
ｔｅｍｐｌａｔｅｓꎬ １ × ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ (ｐｌｕｓ Ｍｇ２ ＋ )ꎬ ５０ μｍｏｌ /
Ｌ ｅａｃｈ ｄＮＴＰｓꎬ ０. ３ μｍｏｌ / Ｌ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ １ Ｕ ｏｆ
Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (ＴａＫａＲａ) . Ｔｈｅ ＰＣＲｓ ｗｅｒｅ
ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ａ ＰＴＣ￣１００ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ (ＭＪ Ｒｅ￣
ｓｅａｒｃｈꎬ Ｉｎｃ. ) ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ: ５ ｍｉｎ ａｔ
９４℃ꎻ ３４ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ ５０ ｓ ａｔ ９４℃ꎬ １ ｍｉｎ ａｔ ４９℃ꎬ ２
ｍｉｎ ａｔ ７２℃ꎻ ａｎｄ ｔｈｅｎ ａ １０ ｍｉｎ ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｔ
７２℃. Ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅａｃｔｉｏｎꎬ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｎｏ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ
ｗａｓ ｐｒｅｓｅｎｔꎬ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｃｏｎ￣
ｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ. Ａｍｐｌｉ￣
ｆｉｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ (１０ μＬ) ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｈｏｒｉ￣
ｚｏｎｔａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ １. ５％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ａｔ
ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎ １ × ＴＡＥ (４０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓꎬ ２０
ｍｍｏｌ / Ｌ ａｃｅｔａｔｅ ａｃｉｄꎬ １ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡꎬ ｐＨ ８. ０)
ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ. Ｇｅｌｓ ｗｅｒｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｄｉｌｕｔｅ ｅｔｈｉｄｉｕｍ
ｂｒｏｍｉｄｅ (０. ５ μｇ / ｍＬ)ꎬ ａｎｄ ＤＮＡ ｗａｓ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ
ｕｎｄｅｒ ＵＶ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＡＬＰＨＡ
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓ￣
ｔｅｍ. ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ ＤＬ２ ０００ (ＴａＫａＲａ) ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ
ａ ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ.
１. ４ Ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｇｅｌ ｐｕｒｉｆｉｅｄ
ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ ( ＳＢＳ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ
Ｃｏ. Ｌｔｄꎬ Ｃｈｉｎａ) ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ ｓ
ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ. Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ
ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐＭＤ１８￣Ｔ (ＴａＫａＲａ) ｖｅｃｔｏｒ. Ｌｉｇａｔｅｄ ｐｒｏ￣
ｄｕｃｔ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α
ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ. Ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ
ｂｙ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｆｏｒｗａｒｄ ａｎｄ Ｍ１３ ｒｅｖｅｒｓｅ
ｐｒｉｍｅｒｓ. Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ
ＢＬＡＳＴＮ / ＢＬＡＳＴＸ ｓｅａｒｃｈ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｃｈｅｃｋ
ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
Ｏｌｉｇｏ ６. ０ ｓｏｆｔｗａｒｅ. Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ
ｂｙ ｃｏｍｐａｎｙ ( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ) .
１. ５ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅ￣
ｓｉｇｎｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ
ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ. Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｔ.
ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｕｎｉｑｕｅ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅ. Ｔｈｅ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｗａｓ ｎａｍｅｄ ＴＣＫＦ (５′￣
ＴＣＡ ＡＧＡ ＣＧＡ ＡＡＧ ＴＡＧ ＣＣＧ ＡＡＧ ￣３′) ａｎｄ ｔｈｅ
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｗａｓ ｎａｍｅｄ ＴＣＫＲ (５′￣ ＣＣＧ ＴＣＣ
ＴＣＧ ＴＣＴ ＴＴＧ ＴＧＡ ＴＣＣ ￣３′) . ＰＣＲｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒ￣
ｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ａ ２５ μＬ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ３０
ｎｇ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅｓꎬ １ × ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ (ｐｌｕｓ Ｍｇ２ ＋ )ꎬ
５０ μｍｏｌ / Ｌ ｅａｃｈ ｄＮＴＰｓꎬ ０. ２ μｍｏｌ / Ｌ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ
ａｎｄ １ Ｕ ｏｆ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (ＴａＫａＲａ) . Ｔｈｅ
ＰＣＲ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ａｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕ￣
ｒｉｚｉｎｇ ｓｔｅｐ ａｔ ９４℃ ｆｏｒ ５ ｍｉｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ３５ ｃｙｃｌｅｓ
ｏｆ ｄｅｎａｔｕｒｉｚｉｎｇ ａｔ ９４℃ ｆｏｒ １ ｍｉｎꎬ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ａｔ ６５℃
ｆｏｒ ５０ ｓｅｃꎬ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ａｔ ７２℃ ｆｏｒ １ ｍｉｎꎬ ａｎｄ ａ ｆｉｎａｌ
ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ ｏｆ ７２℃ ｆｏｒ ５ ｍｉｎ. ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｗｅｒｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ １. ５％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌꎬ
ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅꎬ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｕｎｄｅｒ
ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｌｉｇｈｔ. Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｅｖａ￣
ｌｕａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ １２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ
Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ａｎｄ １４ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｆｕｎｇｉ.
１. ６ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎ￣
ｔｒｏｖｅｒｓａ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｗｉｔｈ Ｔ.
ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ＴＣＫＦ / ＴＣＫＲꎬ ｔｈｅ ｇｅ￣
ｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｄｉｌｕｔｅｄ ｓｅｒｉａｌｌｙ ｕｎｔｉｌ ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ＤＮＡ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ４００ ｐｇ / μＬ. Ａ １μＬ ａｌｉｑｕｏｔ ｏｆ
ｅａｃｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＰＣＲ. Ｔｈｅ ＰＣＲ ｃｏｎｄｉ￣
ｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒｉｚｉｎｇ ｓｔｅｐ ａｔ ９４℃ ｆｏｒ ５
ｍｉｎ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ３５ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ ｄｅｎａｔｕｒｉｚｉｎｇ ａｔ ９４℃
ｆｏｒ １ ｍｉｎꎬ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ａｔ ６５℃ ｆｏｒ ５０ ｓｅｃꎬ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ
ａｔ ７２℃ ｆｏｒ １ ｍｉｎꎬ ａｎｄ ａ ｆｉｎａｌ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ ａｔ
９３３
植物病理学报 ４３ 卷
７２℃ ｆｏｒ ５ ｍｉｎ. Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ￣
ｒｅｓｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ １. ５％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌꎬ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔｈｉ￣
ｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅꎬ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｕｎｄｅｒ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ
ｌｉｇｈｔ. Ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ
ｕｓｉｎｇ ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ￣１０００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ (Ｔｈｅｒ￣
ｍｏꎬ ＵＳＡ) .
２ Ｒｅｓｕｌｔｓ
２. １ ＩＳＳＲ ａｓｓａｙ
Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ｓｉｘ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙ. Ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅꎬ ｐｒｉｍｅｒ Ｐ４ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ａｎｄ ｉｔｓ
ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ Ｔ. ｃａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｔ. ｆｏｅ￣
ｔｉｄａ. Ａ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｂｏｕｔ １ １００ ｂｐ ｗａｓ ｏｎｌｙ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｂｕｔ ｎｏｔ
ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ (Ｆｉｇ. １)ꎬ ｓｕｇｇｅｓ￣
ｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ Ｔ.
ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ. Ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｆｉｖｅ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓꎬ
ｓｉｍｉｌａｒ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ
ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ. Ｉｎ ａｄｄｉ￣
ｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ Ｕ. ｍａｙｄｉｓ ｗａｓ
ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ
ｓｐｅｃｉｅｓ.
Ｆｉｇ. １ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｐａｔｔｅｒｎ
ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ Ｐ４
Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １￣４: Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａꎻ Ｌａｎｅｓ ５￣
６: Ｔ. ｃａｒｉｅｓꎻ Ｌａｎｅｓ ７￣８: Ｔ. ｆｏｅｔｉｄａꎻ Ｌａｎｅｓ ９￣１０: Ｕ. ｍａｙ￣
ｄｉｓꎻ Ｌａｎｅ １１: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ １２: Ｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌ. Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ.
２. ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ １ １１３ ｂｐ ＤＮＡ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ
Ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｂｏｕｔ １ １００ ｂｐ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ
ｕｓｉｎｇ ＩＳＳＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ａｎ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒ Ｐ４ ｆｒｏｍ
ｆｏｕｒ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒａｇ￣
ｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｅａｃｈ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅｄ. Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｆ １ １１３ ｂｐ ａｎｄ ｕｓｅｄ
ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ. Ｎｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ
ａｍｏｎｇ ｔｈｅ １ １１３ ｂｐ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ
ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ.
Ｔｈｅ １ １１３ ｂｐ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｄ ｎｏｔ ｒｅｖｅａｌ ａｎｙ ｓｉｇ￣
ｎｉｆｉｃａｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｉｎ ｅｉｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｏｒ ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ＢＬＡＳＴＮ ｏｒ ＢＬＡＳＴＰ.
Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｉｎ
ＧｅｎＢａｎｋ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＪＦ９６５６３５.
２. ３ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ
ａｎｄ ＰＣＲ ａｓｓａｙ
Ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａꎬ
ＴＣＫＦ / ＴＣＫＲꎬ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｕｎｉｑｕｅ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＩＳＳＲ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｏｌｉｇｏ ６. ０
ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ. Ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ８８２ ｂｐ ｗａｓ ａｍ￣
ｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ
ＴＣＫＦ / ＴＣＫＲ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ
ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓꎬ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ
ｆｒｏｍ １２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ａｎｄ １４ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ
ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｍｕｔ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ｔｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ
ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ＴＣＫＦ / ＴＣＫＲ. Ｔｈｅ ８８２￣ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ
ｆｏｕｎｄ ｉｎ ａｌｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｂｕｔ ａｂｓｅｎｔ
ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｍｕｔ ｆｕｎｇｉ (Ｆｉｇ. ２) .
２. ４ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉ￣
ｍｅｒｓ
Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ￣
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａꎬ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｕｒｉ￣
ｆｉｅｄ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘ￣
ａｍｉｎｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ
ｔｈａｔ １ ｎｇ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｂａｎｄ ｉｎ ａ
２５ μＬ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ( Ｆｉｇ. ３ ) . Ｐｒｉｍｅｒｓ
ＴＣＫＦ / ＴＣＫＲ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ
ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ.
０４３
４ 期 LIANG Hong,et al.: Molecular Identification of T. controversa Kühn by Inter￣simple Sequence Repeat Marker
Ｆｉｇ. ２ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｍｕｔ ｆｕｎｇｉ
ｂｙ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ＴＣＫＦ / ＴＣＫＲ
(Ａ) Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １￣６: Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａꎻ Ｌａｎｅｓ ７￣８: Ｔ. ｃａｒｉｅｓꎻ Ｌａｎｅｓ ９￣１４: Ｔ. ｆｏｅｔｉｄａꎻ Ｌａｎｅ １５:
Ｔ. ｂｒｏｍｉꎻ Ｌａｎｅ １６: Ｔ. ｂａｒｃｌａｙａｎａꎻ Ｌａｎｅ １７: Ｕ. ｍａｙｄｉｓꎻ Ｌａｎｅ １８: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ. (Ｂ) Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ
Ｌａｎｅｓ １￣６: Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａꎻ Ｌａｎｅ ７: Ｔ. ｃａｒｉｅｓꎻ Ｌａｎｅｓ ８￣９: Ｔ. ｆｏｅｔｉｄａꎻ Ｌａｎｅ １０: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
Ｆｉｇ. ３ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ
ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉ￣
ｍｅｒｓ ＴＣＫＦ / ＴＣＫＲ
Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １￣６: ５ ｎｇꎬ ２. ５ ｎｇꎬ ２ ｎｇꎬ
１ ｎｇꎬ ８００ ｐｇꎬ ４００ ｐｇ ＤＮＡꎻ Ｌａｎｅ ７: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
３ Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ
ＰＣＲ￣ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ ａｒｅ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｓｅｎｓｉ￣
ｔｉｖｅꎬ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃꎬ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｑｕｉｃｋ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｔｏ
ｐｅｒｆｏｒｍ. Ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｕｄｙꎬ ａ ＰＣＲ￣ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｗａｓ ｅｓ￣
ｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｓ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｗｅｒｅ ｔｉｍｅ￣ｃｏｎｓｕ￣
ｍｉｎｇ ａｎｄ ｓｏｍｅｔｉｍｅｓ ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｖｅ. ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｓｐｅ￣
ｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ＴＣＫＦ / ＴＣＫＲ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ
ｗｏｒｋ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｆｒｏｍ
ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｍｕｔ ｆｕｎｇａｌ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ Ｔ.
ｃａｒｉｅｓ. Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ
ｗａｓ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒ￣
ｓａ ｑｕｉｃｋｌｙ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ.
Ｗｅ ｈａｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ
ｓｐａｃｅｒ ( ＩＴＳ) [１７] ａｎｄ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｐａｃｅｒ ( ＩＧＳ) ｏｆ ｒｉ￣
ｂｏｓｏｍｅ ＤＮＡ[１８] ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ
ｓｐｅｃｉｅｓ. Ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＩＴＳ ａｎｄ ＩＧＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ
Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｒｅ ｌｉｍｉｔｅｄ. Ｔｈｕｓꎬ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ
ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ
ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＩＴＳ ａｎｄ ＩＧＳ. Ｔｈｅ
ＩＳＳＲ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｅｆｆｅｃ￣
ｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
１４３
植物病理学报 ４３ 卷
Ｔｉｌｌｅｔｉａ. Ｔｈｅ ｌｏｎｇｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｈｉｇｈｅｒ ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｍａｄｅ ＩＳＳＲ ａ ｍｏｒｅ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｐｅａｔ￣
ａｂｌｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｔｈａｎ ＲＡＰＤ.
Ｓｅｖｅｒａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＫ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｒｔｅｄ. Ｇａｏ ｅｔ ａｌ. [１９]
ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ＴＣＫ ｂｙ ｒｅａｌ￣
ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ Ｎｉａｎ ａｎｄ ｈｉｓ ｇｒｏｕｐ
ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｒｅｐｅａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｂｙ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ.
ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ＴＣＫ ａｎｄ ＴＣＴ ( Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓꎬ
Ｔｕｌ. ) ｉｓｏｌａｔｅｓ[２０] . Ｉｎｓｔｅａｄꎬ ｔｈｅｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａ １ ３２２ ｂｐ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＴＣＫ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＲＭ￣ＰＣＲ
(ＲＡＰＤ ｐｒｉｍｅｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｅｍｉ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ)ꎬ ｅｓ￣
ｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ[２０] ａｎｄ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ[２１] ｔｏ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ ＴＣＫꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ. [２２] ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ
ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ＴＣＫ ｆｒｏｍ ｓｉｍｉｌａｒ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＡＦＬＰ (Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ) . Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ｗａｓ １０ ｎｇ ＤＮＡ ｉｎ ａ ２５ μＬ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ.
Ｉｎ ａ ｓｔｕｄｙ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｂｙ Ｃａｉ ｅｔ ａｌ. [２３]ꎬ ｉｔ ｗａｓ ｓｔａｔｅｄ
ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ Ｎｉａｎ ｅｔ ａｌ[２０]
ｃｏｕｌｄ ｏｎｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ＴＣＫ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ
ＴＣＴ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ １ ３２２ ｂｐ ｍａｒｋｅｒ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｎｉａｎ ｅｔ
ａｌ. [２０] Ｃａｉ ｅｔ ａｌ. ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＨＲＣＡ (ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ
ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｙｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ) ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＴＣＫ ｗｉｔｈ ｄｅ￣
ｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ １０ ｐｇ / μＬ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ[２３] . Ｒｅ￣
ａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｏｆｆｅｒｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｄｖａｎｔａｇｅ ｏｖｅｒ ｒｅｇｕｌａｒ
ＰＣＲ ｄｕｅ ｔｏ ｉｔｓ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ
ｉｔ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｒｅａｇｅｎｔｓ.
Ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｗｏｒｋꎬ ｗｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｓｐｅ￣
ｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｂｙ
ＩＳＳＲ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ
ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＰＣＲ￣ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ. Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｂｙ ＩＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ
ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ １ ｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ａ ２５ μＬ
ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｂｙ
ＡＦＬＰ ｍａｒｋｅｒ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｂｙ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ. [２２] ｂｕｔ ｈｉｇｈｅｒ
ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｂｙ ＨＲＣＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｂｙ Ｃａｉ
ｅｔ ａｌ. [２３] . Ｔｈｅ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｄｅｔｅｃ￣
ｔｉｎｇ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａ
ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄｓ. Ａｃｔｕａｌｌｙꎬ ｔｈｅ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｉｎ ２００６
ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ａ ｐａｔｅｎｔ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ. Ｔｈｅ ｐａｔｅｎｔ ( ＺＬ２００６１０１１４２２９. ３ )
ｗａｓ ｇｒａｎｔｅｄ ｉｎ Ｊｕｎｅꎬ ２０１１.
Ａｃｋｎｏｗｌｅｄｇｍｅｎｔｓ
Ｗｅ ｔｈａｎｋ Ｐｒｏｆ. Ｃｈｅｎ Ｗａｎ￣ｑｕａｎ ( Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ) ｆｏｒ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａꎬ
Ｐｒｏｆ. Ｃｈｅｎ Ｘｉｕ￣ｒｏｎｇ (Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ￣
ｔｙ) ｆｏｒ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｔ. ｃａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｔ.
ｆｏｅｔｉｄａ ａｎｄ ＨＡＭＳ (Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃｕｍ Ａｃａ￣
ｄｅｍｉａｅ Ｓｉｎｉｃａｅꎬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ) ｆｏｒ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｓｍｕｔ
ｆｕｎｇｉ.
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
[１] Ｍａｔｈｒｅ Ｄ. ＤＷＡＲＦ ＢＵＮＴ: ｐｏｌｉｔｉｃｓꎬ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ
ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ [ Ｊ] . Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ
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[２] Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｊ Ａ. Ｂｕｎｔ ｏｆ ｗｈｅａｔ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ
１９８２ꎬ ６６: ９７９ －９８６.
[３] Ｓｃｈａｕｚ Ｋ. Ｔｈｅ ｐｒｏｍｙｃｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｓｐｏｒｉｄｉａ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｕｐｏｎ ｌｉｇｈｔ
ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ [ Ｊ ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅ
Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔꎬ １９７７ꎬ ８９: １３５ －１４５.
[４] Ｓｃｈａｕｚ Ｋ. Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ
ｄｗａｒｆ ｂｕｎｔ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ Ｋüｈｎ￣ｂｙ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｆａｃ￣
ｔｏｒｓ. Ｉ. Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｔｅｌｉｏ￣
ｓｐｏｒｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｄａｒｋ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ [Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏ￣
ｇｉｓｃｈｅ Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔꎬ １９８０ꎬ ９８: ３４２ －３４５.
[５] Ｈｅｓｓ Ｗ Ｍꎬ Ｔｒｉｏｎｅ Ｅ Ｊ. Ｕｓｅ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｏ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏ￣
ｖｅｒｓａ [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ １９８６ꎬ ７０: ４５８ －４６０.
[６] Ｔｒｉｏｎｅ Ｅ Ｊꎬ Ｋｒｙｇｉｅｒ Ｂ Ｂ. Ｎｅｗ ｔｅｓｔｓ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ
ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａꎬ ｔｈｅ ｄｗａｒｆ ｂｕｎｔ ｏｆ
ｆｕｎｇｕｓꎬ ｆｒｏｍ ｓｐｏｒｅｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ [ Ｊ] .
Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９７７ꎬ ６７: １１６６ － １１７２.
[７] Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ Ｖ Ｏꎬ Ｔｒｉｏｎｅ Ｅ Ｊ. Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ
ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｆｒｏｍ ｔｈｏｓｅ ｏｆ Ｔ. ｃａｒｉｅｓ ｂｙ ｆｌｕｏ￣
ｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ １９８６ꎬ ７０:
２４３
４ 期 LIANG Hong,et al.: Molecular Identification of T. controversa Kühn by Inter￣simple Sequence Repeat Marker
９２４ －９２６.
[８] Ｂａｎｏｗｅｔｚ Ｇ Ｍꎬ Ｔｒｉｏｎｅ Ｅ Ｊꎬ Ｋｒｙｇｉｅｒ Ｂ Ｂ. Ｉｍｍｕｎｏ￣
ｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｗｈｅａｔ ｂｕｎｔ
ｆｕｎｇｉꎬ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｒａ [Ｊ] . Ｍｙｃｏｌｏｇｉａꎬ １９８４ꎬ ７６: ５１ －６２.
[９] Ｋａｗｃｈｕｋ Ｌ Ｍꎬ Ｋｉｍ Ｗ Ｋꎬ Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｊ. Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ
ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｗｈｅａｔ ｂｕｎｔ ｆｕｎｇｉ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｌａｅ￣
ｖｉｓꎬ Ｔ. ｔｒｉｔｉｃｉ ａｎｄ Ｔ. ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ [Ｊ] . Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒ￣
ｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔｏｎｙꎬ １９８８ꎬ ６６: ２３６７ －２３７６.
[１０] Ｗｅｌｓｈ Ｊꎬ ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ Ｍ. Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ
ＰＣＲ ｗｉｔｈ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｐｒｉｍｅｒｓ [ Ｊ] . Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ￣
ｓｅａｒｃｈꎬ １９９０ꎬ １８: ７２１３ －７２１８.
[１１] Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊ Ｇꎬ Ｋｕｂｅｌｉｋ Ａ Ｒꎬ Ｌｉｖａｋ Ｋ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｒｅ ｕｓｅ￣
ｆｕｌ ａｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ [ Ｊ] . Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ
１９９０ꎬ １８: ６５３１ －６５３５.
[１２] Ｔｏｔｈ Ｇꎬ Ｇａｓｐａｒｉ Ｚꎬ Ｊｕｒｋａ Ｊ. Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ ｉｎ ｄｉｆ￣
ｆｅｒｅｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅｓ: ｓｕｒｖｅｙ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ [ Ｊ] .
Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ ２０００ꎬ １０: ９６７ － ９８１.
[１３] Ｍｅｙｅｒ Ｗꎬ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｔ Ｇꎬ Ｆｒｅｅｄｍａｎ Ｅ Ｚꎬ ｅｔ ａｌ. Ｈｙ￣
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ
ｕｓｅｄ ａｓ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ [Ｊ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９３ꎬ ３１: ２２７４ －
２２８０.
[１４] Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ Ｅꎬ Ｒａｆａｌｓｋｉ Ａꎬ Ｌａｂｕｄａ Ｄ. Ｇｅｎｏｍｅ ｆｉｎｇｅｒ￣
ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｂｙ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ( ＳＳＲ) ￣ａｎｃｈｏｒｅｄ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ [ Ｊ] . Ｇｅｎｏ￣
ｍｉｃｓꎬ １９９４ꎬ ２０: １７６ －１８３.
[１５] Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｅ Ｔꎬ Ｄｅ Ｗ Ｉꎬ Ｄｒｅｎｔｈ Ａꎬ Ａｌｆｏｎｓｏ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ.
ＡＦＬＰ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｏｍｙｃｅｔｅ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎ￣
ｆｅｓｔａｎｓ [ Ｊ] . Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９７ꎬ ２１: ２７８
－２９１.
[１６] Ｇａｎｇ Ｄ Ｒꎬ Ｗｅｂｅｒ Ｄ Ｊ. Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
ｆｏｒ ＲＡＰＤ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ ｔｈｉｃｋ￣ｗａｌｌｅｄ ｄｏｒｍａｎｔ ｔｅｌｉｏ￣
ｓｐｏｒｅｓ ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ [ Ｊ] . Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓꎬ １９９５ꎬ
１９(１): ９２ꎬ ９４ꎬ ９６ －９７.
[１７] Ｌｉａｎｇ Ｈꎬ Ｚｈａｎｇ Ｇ Ｚꎬ Ｃｈｅｎ Ｗ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅ￣
ｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ
Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报)ꎬ ２００５ꎬ ３５: １８１ －１８３.
[１８] Ｌｉａｎｇ Ｈꎬ Ｐｅｎｇ Ｙ Ｌꎬ Ｚｈａｎｇ Ｇ Ｚꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒＤＮＡ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｐａｃｅｒ
( ｒＤＮＡ￣ＩＧＳ) ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报)ꎬ
２００６ꎬ ３６: ４０７ －４１２.
[１９] Ｇａｏ Ｑꎬ Ｗｕ Ｐ Ｓꎬ Ｚｈｕ Ｓ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉ￣
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ Ｋüｈｎ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｆｌｕｏ￣
ｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ (微生
物学通报)ꎬ ２００５ꎬ ３２(６): ７４ －７７.
[２０] Ｎｉａｎ Ｓ Ｊꎬ Ｙｉｎ Ｙ Ｐꎬ Ｙｕａｎ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆ￣
ｆｅｒｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ Ｋüｈｎ
ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (微
生物学报) ꎬ ２００７ꎬ ４７ (４) : ７２５ － ７２８.
[２１] Ｎｉａｎ Ｓ Ｊꎬ Ｙｕａｎ Ｑꎬ Ｙｉｎ Ｙ Ｐ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｖｅｒｓａ Ｋüｈｎ ｂｙ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ( ｉｎ Ｃｈｉ￣
ｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ (中国农业科
学)ꎬ ２００９ꎬ ４２(１２): ４４０３ －４４１０.
[２２] Ｌｉｕ Ｊ Ｈꎬ Ｇａｏ Ｌꎬ Ｌｉｕ Ｔ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅ￣ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｄｉａｇ￣
ｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｗａｒｆ ｂｕｎｔ ｏｆ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ
ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ Ｋüｈｎ[ Ｊ] . Ｌｅｔｔｅｒ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣
ｇｙꎬ ２００９ꎬ ４９: ２３５ －２４０.
[２３] Ｃａｉ Ｊꎬ Ｙｉｎ Ｙ Ｐꎬ Ｇｅ Ｊ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｌｌｅｔｉａ
ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓａ ｗｉｔｈ ＨＲＣＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] .
Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ (中国农业科学)ꎬ ２００９ꎬ
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责任编辑:于金枝
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