全 文 ：书西北植物学报!
"#$
!
$$
"
#!
#$
!$%&!$()
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""*)"!+
"
!"#$
#
!*!$%&*"%
收稿日期$
!"#$*",*!$
%修改稿收到日期$
!"#$*#"*!!
基金项目$国家自然科学基金"
$#!("%)#
#
作者简介$韩学敏"
#&,(
#!女!在读硕士研究生!主要从事蛋白质结构与生化性质研究&
-*./01
$
23.4#&,(",!)
!
#%$456.
"
通信作者$杨海灵!博士!副教授!主要从事植物蛋白质结构与功能研究&
-*./01
$
7
2/0108
9!7
/266456.458
毛白杨
1#&2034!
基因克隆及相关特性鉴定
韩学敏!杨志灵!杨海灵"
"北京林业大学 生物科学与技术学院!北京
#""",$
#
摘
!
要$该研究从毛白杨中克隆到
#
个
:20
类谷胱苷肽
!*
转移酶"
;<=
#基因"
"#$%!&)
#!编码
!#$
个氨基酸&表
达模式分析发现!
"#$%!&)
在正常生长
>
!
?
!
和莠去津处理后的茎叶以及茎的韧皮部均表达!属于组成型表达
基因&在大肠杆菌中表达并纯化了
:@6;<=A)
重组蛋白!酶学性质分析表明
:@6;<=A)
对
BCDE
DEC*B1
DEB
和
BF.*??>
等
)
种底物均有活性&动力学分析发现!
:@6;<=A)
对
;<>
具有较高的亲和力!而对
BCDE
的亲和力
相对较低&在不同
G
>
及温度条件下对
:@6;<=A)
蛋白进行活性检测!发现
:@6;<=A)
在
G
>(4+
"
#"4+
范围内或
$"H
"
%"H
温度范围内有较高的活性&研究推测!
:@6;<=A)
可能在毛白杨的抗逆生理中发挥重要作用&
关键词$谷胱苷肽
!*
转移酶%毛白杨%表达模式%酶学性质分析
中图分类号$
I(,+
%
I(,%
文献标志码$
J
"#$%&%
(%)"*(+(,-.+&/(-&$%$01#&2034!0+$11&
5
6*67#&8)/#&7$
>JDKFL.08
!
MJD;N20108
9
!
MJD;>/0108
9
"
"
B61L
9
L6OP0OL<50L85LQ/8RE06@L528616
97
!
EL0
S
08
9
A6TLQ@T
7
U80VLTQ0@
7
!
EL0
S
08
9
#""",$
!
B208/
#
234-+(,-
$
W8@20QQ@FR
7
!
/:2051/QQ%!&8/.LR"#$%!&)X/Q5168LROT6."$
(
)*)+#$,-.#$+/0"#$%!&)
L856RLQ/
G
T6@L086O!#$/.086/50RTLQ0RFLQ4Y=*:BYTLVL/1LR@2/@"#$%!&)X/Q/568Q@0@F@0VL1
7
L3*
G
TLQQLR
9
L8L@2/@0QL3
G
TLQQLR08Q@L.
!
1L/O/8R
G
216L.6OQ@L.6O"0#$,-.#$+/F8RLT86T./1
9
T6X@2568R0*
@068
!
/8R>
!
?
!
/8R/@T/Z08LQ@TLQQLR568R0@068Q4=2LTL56.[08/8@:@6;<=A)X/QL3
G
TLQQLR08102$*3/8R
G
FT0O0LR[
7
D0
!QL
G
2/T6QL/OO080@
7
52T6./@6
9
T/
G
2
7
4:@6;<=A)Q26XLRL8Z
7
./@05/5@0V0@0LQ@6X/TRQQF[*
Q@T/@LQBCDE
!
DEC*B1
!
DEB/8RBF.*??>4]08L@05/8/1
7
Q0QO6F8R@2/@@2L/OO080@
7
6O:@6;<=A)@6;<>
X/Q20
9
2LT@2/8@2/@@6BCDE4:@6;<=A)2/R6
G
@0./1
G
>T/8
9
08
9
OT6.(4+
"
#"4+/8R6
G
@0./1@L.
G
LT/*
@FTLT/8
9
08
9
OT6.$"H
"
%"H4?FTTLQF1@Q08R05/@LR@2/@:@6;<=A)./
7G
1/
7
0.
G
6T@/8@T61LQ08Q@TLQQ
@61LT/85L08"0#$,-.#$+/4
5.
6
7$+)4
$
9
1F@/@2068L!*@T/8QOLT/QL
%
"$
(
)*)+#$,-.#$+/
%
L3
G
TLQQ068
G
/@@LT8
%
L8Z
7
./@0552/T/5@LT0Z/@068
!!
植物在生长发育过程中经常遭遇各种逆境胁
迫!如干旱高温低温高盐和各种有毒物质等!这
些逆境条件能够抑制植物的正常生长发育(#)&植物
在长期的进化过程中已经发展出多种系统来抵抗逆
境胁迫的危害!包括各种酶类和非酶类物质!如抗氧
化酶类谷胱苷肽
!*
转移酶晚期胚胎发生富集蛋
白"
P-J
#甜菜碱和海藻糖等(!*%)&谷胱苷肽
!*
转
移酶"
9
1F@/@2068L!*@T/8QOLT/QL
!
;<=
!
-B4!4+4#4
#,
#是一类具有解毒抗逆催化细胞内的多种复合
物与还原型谷胱苷肽"
;<>
#结合和信号转导等多
种生理功能的蛋白质超家族!广泛分布于植物动
物真菌和细菌中&植物谷胱苷肽
!*
转移酶的主要
功能是参与植物的解毒代谢!它催化生物体内源或
外源的亲电子化合物与还原型谷胱苷肽"
;<>
#结
合!使其能够被转运进液泡!达到解毒的功能($)&植
物
;<=
基因家族主要包含
,
种类型$
=/F
:20
=2L@/
NL@/
C>JY
P/.[R/
=B>IC
和
-A#E
#
&
:20
类是植物特有的
;<=
类型!在植物抵抗逆境胁
迫以及生长发育过程中发挥重要作用()&例如!在
烟草"
432$#3/./#/5/2),
#中过量表达玉米"
6-/
,/
7
+
#的一个
:20
类
%!&
后!转基因烟草对除草剂
甲草胺的抗性增强(,)%在拟南芥"
89/53:$
(
+3+#;/*3<
/./
#中过量表达一个
:20
类
%!&
可以明显增强转
基因植株对紫外线辐射损伤的耐受性(&)&
毛白杨"
"$
(
)*)+#$,-.#$+/B/TT4
#为杨柳科!
杨属大乔木!广泛分布于中国北方地区!其树干端
直!高大挺拔!适应性强!是优良的园林绿化及造林
树种!且其生长迅速!木材轻而细密!是优良的用材
树种(#")&对毛白杨中抗性相关基因的研究将有助
于揭示毛白杨的抗逆机理!并将有助于利用抗性基
因对毛白杨进行遗传改良&先前已从毛白杨中克隆
到
!
个
:20
类
%!&
基因!并对其表达分布和编码蛋
白质的生化性质进行了鉴定(##)!然而在毛白杨中是
否还存在其他
:20
类
%!&
基因!其编码蛋白的生化
性质如何并不清楚&在本研究中!从毛白杨中克隆
到另外
#
个
:20
类
%!&
基因!并对其进行了系统发
生关系表达模式蛋白结构和生化性质等方面的分
析!为深入揭示毛白杨的抗逆机理奠定了基础&
#
!
材料和方法
848
!
实验材料
实验材料毛白杨取自中国科学院北京植物园&
89:
!
毛白杨
1#&2034!
基因的克隆
取新鲜的毛白杨叶片组织约
"4#
9
!按照
E06=L]L
公司植物总
YDJ
提取试剂盒说明书提取
毛白杨叶片的总
YDJ
!并用
=/]/Y/
公司反转录试
剂盒将总
YDJ
反转录合成
5CDJ
&根据毛果杨
"#%!&)
基因序列设计引物
:@6;<=A)*-K#
"
J;*
;J=BBJ=;;BJ;JJJ=BJ==JJJ;=
#和
:@6*
;<=A)*-K!
"
=JJ;B====JB==;==BJ=;;B*
JJB;J
#&以毛白杨叶
5CDJ
为模板!利用引物
:@6;<=A)*-K#
*
-K!
进行
:BY
扩增&
:BY
产物
经
#^
琼脂糖凝胶电泳检测!用鼎国公司的
CDJ
纯
化回收试剂盒纯化回收目的条带!将纯化产物连接
入全式金公司的
G
-J
组质粒转化大肠杆菌
_` #"&
感受态细胞!挑选多个
阳性克隆进行测序&
84;
!
系统发生关系分析
将
"#$%!&)
基因编码的氨基酸序列与其他
植物
;<=
的氨基酸序列通过
`U
2@*
@
G
$**
XXX4L[04/54Fa
*
=661Q
*
.Q/
*
.FQ51L
*#进行比
对!并手动校对&利用
-`;JV4+4!4#
软件构建
D_
进化树!
E66@Q@T/
G
值为
#"""
&
89!
!
毛白杨
1#&2034!
基因的组织表达分析
分别用
+4"^ >
!
?
!
和
#4+^
莠去津喷洒毛白
杨植株&处理
#!2
后!用
E06=L]L
公司植物总
YDJ
提取试剂盒分别提取毛白杨茎叶和茎韧皮部
的总
YDJ
!并用
=/]/Y/
公司反转录试剂盒反转录
合成
5CDJ
&根据测序得到的
"#$%!&)
基因的序
列!设计引物
:@6;<=A)*<:#
"
B=B=BJJBJ;B*
=JB;BJJB;
#和
:@6;<=A)*<:!
"
;B=BBBJ;=*
=BJ;B===;J
#!进行组织表达分布检测&
Y=*
:BY
反应程序为$
&)H
预变性
$.08
%
&)H$"Q
!
++
H)"Q
!
(!H#.08
!
$+
个循环%最后
(!H
延伸
$
.08
!内标为毛白杨
82#3.
基因!引物为
:@J5@08*#
"
;J;JBB==BJJBJB=BB=;B=J=;
#和
:@J5*
@08*!
"
BJ;;=BJJ;JB;JJ;JJ=;;B
#&
89<
!
=-$>?@A!
蛋白结构模拟
以拟南芥
:20
类
;<=
"
:CE
$
#;Db
#晶体结构
为模板!以分子模拟软件
W8Q0
9
2@
$
中的
J10
9
8!C
程序进行序列比对&运用蛋白结构模拟模块
6`R*
L1LT
进行三维结构模拟!并用
G
T6O01L*$C
程序对模
拟的结构进行校验!挑选校验值最高的模拟结构&
89B
!
=-$>?@A!
蛋白的表达和纯化
用限制性内切酶
=/,>
%
和
>3.R
&
酶切
:@6;<=A)
*
G
-J
"#$%!&)
基因片段连接到
G
-=$"/
表达载体中!
使表达的
:@6;<=A)
蛋白前端带有
%c>0Q
的标
签!将构建好的重组质粒转入大肠杆菌
EP!#
"
C-$
#
感受态细胞&将
:@6;<=A)
重组表达菌接种于含
有卡那霉素的
PE
培养基中培养过夜!然后按
#d#""
比例将菌液稀释后扩大培养至
8
%""
为
"4+
!
加入
W:=;
至终浓度为
"4#..61
+
P
#
!
$(H
培养
过夜&将诱导蛋白表达后的菌液于
)H
%+""c
9
离心
#".08
!收集菌体!用缓冲液
J
"
!"..61
+
P
#
咪唑
"4+.61
+
P
#
D/B1
!"..61
+
P
#
D/
$
:?
)
!
G
>(4+
#重悬菌体!将重悬后的菌体置于冰上进行
超声破碎裂解&
)H
#""""c
9
离心
#".08
!分别
取少量菌体超声破碎离心后的上清液和沉淀!经
J
平衡
D0
亲和层析柱"购自于
J.LTQ2/.:2/T./*
50/E06@L52
公司#!将超声破碎离心后得到的上清液
上样至平衡后的
D0
亲和柱!结合
$".08
后以缓冲
液
J
洗脱杂蛋白!最后用缓冲液
E
"
4+.61
+
P
#
"($!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
咪唑
"4+.61
+
P
#
D/B1
!"..61
+
P
#
D/
$
:?
)
!
G
>(4+
#洗脱目的蛋白!收集目的蛋白洗脱峰进行
蛋白的生化性质检测&
89C
!
=-$>?@A!
蛋白生化特性检测
选用
BCDE
CBDE
DEB
DEC*B1
>-C
C>J
O1F6T6R0OL8
和
BF.*??>
等
,
种底物对
:@6;<=A)
进
行酶学性质分析&
:@6;<=A)
对
BCDE
CBDE
和
DEB
的催化活性参照
>/[0
9
等(#!)的方法!对
DEC*B1
的催化活性参照
Y0550
等(#$)的方法!对
>-C
C>J
O1F6T6R0OL8
和
BF.*??>
的催化活性参照
-RX/TRQ
等(#))的方法&所有的测活反应都在
!+H
进行!活性
测定用
-V61F@068$""
紫外可见分光光度计"
=2LT*
.6
#&以
BCDE
为底物!参照
MFL8
等(#+)的方法测定
:@6;<=A)
在不同
G
>
下的催化活性&在
#+H
"
("
H
范围内!以
+H
为间隔测定
:@6;<=A)
在不同温度
下的催化活性&蛋白浓度通过测量蛋白溶液在
8
!,"
的吸光度值确定&
动力学常数通过测量
:@6;<=A)
在不同浓度
;<>
和
BCDE
条件下的催化活性进行分析&在
:@6;<=A)
对
;<>
的动力学分析时!固定
BCDE
的浓度为
#4"..61
+
P
#
!通过测量
;<>
浓度范
围为
"4#
"
#4"..61
+
P
#时
:@6;<=A)
在不同
;<>
浓度条件下的催化活性获得&在
:@6;<=A)
对
BCDE
的动力学分析时!固定
;<>
的浓度为
#4"
..61
+
P
#
!通过测量
BCDE
浓度范围为
"4%
"
!4"
..61
+
P
#时
:@6;<=A)
在不同
BCDE
浓度条件
下的催化活性获得&酶动力学参数利用
>
7G
LT$!
程序"
2@@
G
$**
26.L
G
/
9
L48@1X6T1R456.
*
S
6284L/Q@*
LT[
7
*
2
7G
LT$!42@.1
#!通过非线性回归分析获得&
!
!
结果与分析
:98
!
毛白杨
1#&2034!
基因克隆
以毛白杨叶
5CDJ
为模板!利用引物
:@6;<=A)*
-K#
*
!
克隆得到
"#$%!&)
的
5CDJ
序列&
"#$%!&)
的
5CDJ
序列包含
%)![
G
的开放阅读框"包括终止
密码子#!编码
!#$
个氨基酸"图
#
#!预测分子量为
!$4(aC
!与毛白杨
:@;<=A)
的氨基酸序列相似性
为
&)4)^
&保守结构域分析发现!
"#$%!&)
基因
所编码的蛋白含有
:20
类
;<=
结构域!表明本研究
克隆到的基因是
:20
类
%!&
基因&
:9:
!
植物
=*&
类
203
基因的系统发生关系分析
选取代表不同进化历史的苔藓植物小立碗藓
"
";
7
+2$,3#9-**/
(
/#-.+
#蕨类植物江南卷柏"
!-*/<
?
3.-**/,$-**-.:$9
@@
33
#裸子植物油松 "
"3.)+
#/5)*3
@
$9,3+
#单子叶植物水稻和玉米!以及双子叶
植物拟南芥和毛果杨"
"$
(
)*)+#932;$2/9
(
/
#的
:20
类
%!&
基因为研究对象!并将其他类型的植物
%!&
基因!包括
=2L@/
C>JY
NL@/
=/F
和
P/.[*
R/
等类型加入到系统发生关系分析中&系统发生
关系分析发现!所有的植物
:20
类
%!&
基因聚为一
支!支持率为
&,^
!支持本研究克隆到的基因为
:20
类
%!&
基因&
"#$%!&)
与毛果杨的
"#%!&)
聚在一起!且支持率为
#""^
!表明
"#$%!&)
为
"#%!&)
的直系同源基因"图
!
#&
:9;
!
毛白杨
1#&2034!
基因的表达模式分析
利用反转录
:BY
方法研究
"#$%!&)
基因在
正常生长条件!以及
>
!
?
!
和莠去津胁迫处理条件
下在不同部位"茎叶和茎韧皮部#的表达分布&结
果发现!
"#$%!&)
基因在检测的所有生长条件下
的所有部位均表达"图
$
#!表明
"#$%!&)
基因是
组成型表达基因!可能在毛白杨的生长发育过程中!
在各种生长条件下的各个部位均发挥重要作用&
:9!
!
毛白杨
=-$>?@A!
蛋白的三维结构模拟
用
W8Q0
9
2@WW
软件对
:@6;<=A)
蛋白进行三维
结构模拟"图
)
!
J
#!用
:T6O01L*$C
对模拟结构进行
校验!发现除
B
末端的
%
个氨基酸残基得分为负值
外!其余位点的得分均为正值!表明模拟结构具有较
高的可信度"图
)
!
E
#&
:@6;<=A)
蛋白含有
!
个结
构域$由
螺旋和
(
折叠组成的
D
端结构域"
D*R6*
./08
#以及由多个
螺旋组成的
B
端结构域"
B*R6*
./08
#&
D
端结构域含有与
;<>
结合的位点!在不
图
#
!
毛白杨
"#$%!&)
基因的核苷酸
序列和推测的氨基酸序列
A0
9
4#
!
DF51L6@0RLQL
e
FL85L/8RRLRF5LR
/.086/50RQL
e
FL85L6O"#$%!&)
#($!
#!
期
!!!!!!!!!!!!
韩学敏!等$毛白杨
"#$%!&)
基因克隆及相关特性鉴定
图
!
!
毛白杨
"#$%!&)
基因的系统发育分析
标尺代表遗传距离%节点处的数字代表从
#"""
次重复计算得到的
[66@Q@T/
G
百分比值
A0
9
4!
!
:2
7
16
9
L8L@05@TLL6O"0#$,-.#$+/"#$%!&)
=2LQ5/1L[/TTL
G
TLQL8@Q
9
L8L@05R0Q@/85L
%
DF.[LTQ68[T/852LQ08R05/@L@2L[66@Q@T/
G
G
LT5L8@/
9
LV/1FLQ5/15F1/@LROT6.#"""TL
G
105/@LQ
图
$
!
毛白杨
"#$%!&)
基因的表达分布
#
"
&
分别是正常生长条件下"
#
"
$
#
>
!
?
!
处理"
)
"
%
#和
莠去津处理"
(
"
&
#后!
"#$%!&)
基因分别在茎"
#
)
(
#
叶"
!
+
,
#和茎韧皮部"
$
%
&
#中的表达情况
A0
9
4$
!
-3
G
TLQQ068
G
/@@LT86O"0#$,-.#$+/"#$%!&)
08V/T06FQ@0QQFLQF8RLTR0OOLTL8@568R0@068Q
#
"
&TL
G
TLQL8@@2LL3
G
TLQQ068
G
/@@LT86O"#$%!&)
08Q@L.
"
#
!
)
!
(
#!
1L/O
"
!
!
+
!
,
#
/8R
G
216L.
"
$
!
%
!
&
#
6OQ@L.F8RLT
86T./1
9
T6X@2568R0@068
"
#
"
$
#!
>
!
?
!
"
)
"
%
#
/8R
/@T/Z08L
"
(
"
&
#
Q@TLQQLR568R0@068Q
!
TLQ
G
L5@0VL1
7
同类型的
;<=
中通常比较保守!
B
端结构域含有与
第二底物结合的位点!在不同
;<=
中变化相对
较大&
:9<
!
毛白杨
=-$>?@A!
蛋白的酶学性质分析
将重组质粒
G
-=$"/
*
:@6;<=A)
转化大肠杆菌
感受态细胞!经
W:=;
诱导蛋白表达!发现
:@6;<=A)
为可溶性表达!通过亲和层析纯化后获得纯化的重组
蛋白"图
+
#&
测定了
:@6;<=A)
对
BCDE
DEC*B1
DEB
O1F6T6R0OL8
BF.*??>
>-C
C>J
和
CBDE
等多
图
)
!
毛白杨
:@6;<=A)
蛋白三维结构的模拟
J4:@6;<=A)
的三维结构%
E4
用
:T6O01L*$C
对模拟蛋白的评估结果
A0
9
4)
!
<@TF5@FTL.6RL108
9
6O:@6;<=A)
G
T6@L08
J4<@TF5@FTL6O:@6;<=A)
G
T6@L08
%
E4-V/1F/@0686O
@2LQ@TF5@FTL6O:@6;<=A)[
7
:T6O01L*$C
!($!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
图
+
!
毛白杨
:@6;<=A)
蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
`4
蛋白分子量标准%
#4EP!#
%
!4
G
-=$"/
*
:@6;<=A)
诱导表达%
$4
G
-=$"/
*
:@6;<=A)
诱导表达!超声破碎并离心后的上清%
)4
G
-=$"/
*
:@6;<=A)
诱导表达!超声破碎并离心后的沉淀%
+4
纯化的
:@6;<=A)
重组蛋白
A0
9
4+
!
?VLTL3
G
TLQQ068/8R
G
FT0O05/@0686O
"0#$,-.#$+/:@6;<=A)
G
T6@L0808102$*3
`4` 61L5F1/T./QQ./TaLT
%
#4102$*3EP!#
%
!4W8RF5LR102$*35L1Q
2/T[6T08
9G
-=$"/
*
:@6;<=A)
G
1/Q.0R
%
$4
LT8/@/8@/O@LT
F1@T/Q6805/@068/8R5L8@T0OF
9
/@0686O08RF5LR102$*35L1Q
2/T[6T08
9G
-=$"/
*
:@6;<=A)
G
1/Q.0R
%
)4BL1
G
L1L@/O@LT
F1@T/Q6805/@068/8R5L8@T0OF
9
/@0686O08RF5LR102$*35L1Q
2/T[6T08
9G
-=$"/
*
:@6;<=A)
G
1/Q.0R
%
+4:FT0O0LR
TL56.[08/8@:@6;<=A)
G
T6@L08
种底物的活性&
:@6;<=A)
对
CBDE
O1F6T6R0OL8
>-C
和
C>J
等
)
种 底 物 均 没 有 催 化 活 性&
:@6;<=A)
对
BCDE
DEC*B1
DEB
和
BF.*??>
的催化活性分别为"
"4+")f"4""(
#"
"4+&%f
"4""+
#"
#4%%,f"4#"+
#和"
4"&$f"4"",
#
)
.61
+
.08
#
+
.
9
#
&
以
BCDE
和
;<>
为底物!对
:@6;<=A)
进行动
力学分析&动力学分析发现!
:@6;<=A)
对
;<>
有
比较高的亲和力!对
;<>
的
A
.
值为"
"4"&,f
"4""%
#
..61
+
P
#
!对
;<>
的催化效率为
!4(&%
..61
+
P
#
+
<
#
&相 对 于 对
;<>
的 亲 和 力!
:@6;<=A)
对
BCDE
的亲和力较低!对
BCDE
的
A
.
值为"
#,4,"(f#4&,(
#
..61
+
P
#
!对
BCDE
的催化
效率为
"4!(+..61
+
P
#
+
<
#
&
以
BCDE
和
;<>
为底物检测了
:@6;<=A)
在不
同
G
>
下的催化活性!发现
:@6;<=A)
在碱性
G
>
范
围内有比较高的催化活性&当检测的
G
>
为
+
"
#"
时!
:@6;<=A)
的催化活性随
G
>
的升高而增加!
:@6;<=A)
在
G
>
为
#"
时催化活性最高&在
G
>
为
(4+
"
#"4+
时!
:@6;<=A)
的活性值均高于最高活性
的
%%^
&当
G
>
低于
+
时!
:@6;<=A)
不能够进行催
化"图
%
!
J
#!说明
:@6;<=A)
能在碱性的细胞环境中
图
%
!
:@6;<=A)
在不同
G
>
"
J
#和
温度条件下"
E
#的活性分析
A0
9
4%
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@05/5@0V0@
7
/8/1
7
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G
T6@L08
F8RLTR0OOLTL8@
G
>
"
J
#
/8R@L.
G
LT/@FTL568R0@068Q
"
E
#
发挥作用!而在酸性的细胞环境中则不能发挥作用&
检测
:@6;<=A)
在不同温度下的催化活性!发
现
:@6;<=A)
在高温下有比较高的催化活性&在
#+H
"
+"H
的范围内!随着温度的升高!
:@6;<=A)
的催化活性不断增加!当温度为
+"H
时!
:@6;<=A)
催化活性最高&在温度范围为
$"H
"
%"H
之间
时!
:@6;<=A)
的活性值均高于最高活性的
)&^
"图
%
!
E
#!这预示着
:@6;<=A)
对于植物在高温条
件下抵抗逆境胁迫具有作用&
$
!
讨
!
论
植物
;<=
基因家族包含
,
种类型()!其中
=/F
和
:20
是最大的
!
种类型!如拟南芥中含有
!,
个
=/F
和
#$
个
:20
类
;<=
!毛果杨中含有
+,
个
=/F
和
&
个
:20
类
;<=
(
#%
)
&本研究对保守结构域分析发现!
:@6;<=A)
蛋白具有
:20
类
;<=
结构域&另外!选取
苔藓植物蕨类植物裸子植物被子植物中的双子叶
和单子叶植物
:20
类
;<=
!以及其他类型
;<=
共同
进行系统发生关系分析发现!
:@6;<=A)
与所有其他
植物的
:20
类
;<=
聚成一枝&因此!保守结构域和
系统发生关系分析都支持本研究克隆得到的
"#$%!&)
基因是
:20
类
;<=
基因&包括先前从毛
白杨中克隆到
!
个
:20
类
;<=
基因(##)!已经从毛白
杨中克隆得到
$
个
:20
类
;<=
基因!而与毛白杨亲
缘关系很近的毛果杨中含有
&
个
:20
类
;<=
!因此!
在毛白杨中可能还存在其他
:20
类
;<=
同源基因&
$($!
#!
期
!!!!!!!!!!!!
韩学敏!等$毛白杨
"#$%!&)
基因克隆及相关特性鉴定
先前对其他物种中
%!&
的研究发现!毛果杨的
&
个
:20
类
%!&
中有
(
个是组成型表达基因(#()!油
松中
(
个
:20
类
%!&
都是组成型表达(#,)!毛白杨
的
"#$%!&#
和
"#$%!&!
也是组成型表达(##)&
本研究发现!
"#$%!&)
在各种生长条件下的茎叶
和茎的韧皮部中均表达!说明
"#$%!&)
也是组成
型表达基因&这表明在裸子植物和被子植物的不同
物种中!大多数
:20
类
;<=
可能都是组成型表达的
基因!可能在植物的生长发育过程中!在不同生长条
件下!不同部位均发挥重要作用&
系统发生关系分析发现!毛白杨
"#$%!&)
与
毛果杨
"#%!&)
是直系同源基因!序列高度相似&
催化活性比较发现!
:@6;<=A)
与
:@;<=A)
对
BC*
DE
DEC*B1
和
DEB
均有酶学活性!而对
CBDE
和
C>J
均没有酶学活性%但两者的催化活性不同!
:@;<=A)
对
BCDE
DEC*B1
和
DEB
等
$
种底物的
催化活性分别是
:@6;<=A)
的
(4!
#4,
和
#4,
倍!
对
$
种底物的催化活性! 个蛋白之间均存在显著
性差异&而且
:@6;<=A)
与
:@;<=A)
对
;<>
的
亲和力不同!
:@6;<=A)
对
;<>
的亲和力是
:@;*
<=A)
的
!"4%
倍! 个蛋白对
;<>
的亲和力存在显
著性差异(#()&这说明毛白杨的
"#$%!&)
和毛果
杨中的直系同源基因
"#%!&)
已经发生了功能的
分化&
参考文献!
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