全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(２): ２０５￣２１０(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０２￣０６ꎻ 修回日期: ２０１４￣１１￣１４
基金项目: 国家自然科学基金 ( ３１３７１８８１)ꎻ国家重点基础研究发展计划 ( ２０１３ＣＢ１２７７００)ꎻ国家科技支撑计划 ( ２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０４ꎻ
２０１２ＢＡＨ２９Ｂ０２)
通讯作者: 马占鸿ꎬ教授ꎬ主要从事植物病害流行和宏观植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｍａｚｈ＠ｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ
骆 勇ꎬ教授ꎬ主要从事植物病害定量流行学、分子流行学、植物抗病性、病原与寄主互作以及病害综合防治等方面研究ꎻ
Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｇｌｕｏ＠ｕｃａｎｒ.ｅｄｕ
第一作者: 李勇ꎬ男ꎬ重庆人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病害分子流行学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｌｉｙｏｎｇｃａｕ＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０２.０１２
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研究简报
小麦条锈病菌和白粉病菌多重
ＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法的建立
李勇１ꎬ 谷医林１ꎬ 吴波明１ꎬ 金社林３ꎬ 曹世勤３ꎬ 王晓明３ꎬ
孙振宇３ꎬ 骆 勇１ꎬ２∗ꎬ 马占鸿１∗
( １中国农业大学植物病理学系 农业部植物病理学重点实验室ꎬ北京 １００１９３ꎻ ２美国加州大学 Ｋｅａｒｎｅｙ农业研究中心ꎬＰａｒｌｉｅｒ ＣＡ ９３６４８ꎻ
３甘肃省农业科学院植物保护研究所ꎬ兰州 ７３００７０)
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｄｕｐｌｅｘ ＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｐｕｃｃｉｎｉａ
ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ ａｎｄ Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ 　 ＬＩ Ｙｏｎｇ１ꎬ ＧＵ Ｙｉ￣ｌｉｎ１ꎬ ＷＵ
Ｂｏ￣ｍｉｎｇ１ꎬ ＪＩＮ Ｓｈｅ￣ｌｉｎ２ꎬ ＣＡＯ Ｓｈｉ￣ｑｉｎ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ￣ｍｉｎｇ２ꎬ ＳＵＮ Ｚｈｅｎ￣ｙｕ２ꎬ ＬＵＯ Ｙｏｎｇ１ꎬ２ꎬ ＭＡ Ｚｈａｎ￣
ｈｏｎｇ１ 　 ( １Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＣｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ
Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ２ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａꎬ Ｋｅａｒｎｅｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｐａｒｌｉｅｒ ＣＡ ９３６４８ꎬ ＵＳＡꎻ３ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｇａｎｓｕ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ ａｎｄ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ａｒｅ ｔｗｏ ｍａｊｏｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ａｓ ｔｙｐｉｃａｌ ａｉｒｂｏｒｎｅ
ｄｉｓｅａｓｅｓꎬ ｔｈｅ ａｉｒｂｏｒｎｅ ｉｎｏｃｕｌａ ｂｅａｒ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｙｃｌｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ. Ｔｈｅ ｌｏｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｄｉｓｐｅｒｓａｌ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｐｒｅａｄ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｓ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ａｉｒｂｏｒｎｅ ｉｎｏｃｕｌａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｂｅｃｏｍｅ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｍｅａｎｓ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｏｒｅｃａｓｔ
ａｎｄ ｒｉｓｋ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｐｉｄｅｍｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ａ ｓｅｔ ｏｆ ｄｕｐｌｅｘ ＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ＤＮＡ ｏｆ Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ ａｎｄ Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ
ｓｏ ａｓ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａ ｆｒｏｍ ａｉｒ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｐｏｒｅ ｔｒａｐ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ａｃｃｕｒａｔｅꎬ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｑｕａｎｔｉｆｙ ａｓ ｌｏｗ ａｓ １０ ｓｐｏｒｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ
ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｉｎｏｃｕｌａ ｄｙｎａｍｉｃｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｗｈｅａｔ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔꎻ ｗｈｅａｔ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗꎻ ｄｕｐｌｅｘ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲꎻ ｓｐｏｒｅ ｔｒａｐ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０２￣０２０５￣０６
　 　 小麦条锈病(Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉꎬ
Ｐｓｔ)和小麦白粉病(Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉꎬ
Ｂｇｔ)是我国小麦生产上的重要病害ꎮ 条锈病主要
发生在西北、华北、长江中下游和西南各省、自治
区ꎻ白粉病则在西南各省和河南、山东、湖北、江苏、
安徽等省发生较重ꎬ且西北、东北麦区也日趋严
重[１]ꎮ 条锈病菌依靠夏孢子造成小麦初侵染和再
侵染并随气流远距离传播导致大区流行ꎬ白粉病菌
则依赖于分生孢子或子囊孢子进行初侵染和再侵
染ꎮ 二者作为典型的气传病害ꎬ空中的接种体在病
　
植物病理学报 ４５卷
害循环中至关重要ꎬ并与病害的发生发展密切相
关[２]ꎮ 因此ꎬ对空中病原孢子数量动态的研究有
利于认识病害的流行规律和提高预测预报水平ꎮ
　 　 相比传统的病原定量测定方法(显微形态鉴
别和计数)ꎬ分子检测方法具有客观、准确、快速、
高通量等优点ꎮ Ｌｕｏ 等[３]利用定容式孢子捕捉器
进行连续采样ꎬ将收集在胶带上的样本进行洗脱后
提取 ＤＮＡꎬ研发出了核果褐腐病菌 Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ
ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ的 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测技术ꎮ
Ｋｌｏｓｔｅｒｍａｎ 等[４] 开发了一套基于 ＩＴＳ 序列的
ＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法用来定量测定孢子捕
捉器采集样本中的菠菜霜霉病菌 Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｆｆｕ￣
ｓａꎮ Ｂａｒｎｅｓ 等[５]建立一套基于 ＩＴＳ 序列的巢式
ＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法ꎬ可以将降水中的大豆
锈菌 Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ检测到个位数孢子ꎬ用
于监测美国主要大豆产区生长季降水样本中孢子
沉降的模式和规律ꎮ
　 　 本研究开发了一套多重 ＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
方法用于定量检测小麦条锈病菌和白粉病菌ꎮ 结合
Ｂｕｒｋａｒｄ ｍｕｌｔｉ￣ｖｉａｌ ｃｙｃｌｏｎｅ ｓａｍｐｌｅｒ 采集孢子捕捉样
本ꎬ提取 ＤＮＡ后ꎬ应用建立的标准曲线ꎬ可对样本中
的条锈病菌和白粉病菌数量进行定量检测ꎬ并用于
田间实地测定空气中两种病菌的浓度ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 ＰＣＲ体系
１.１.１　 引物与荧光探针　 根据 ＮＣＢＩ 上 Ｐｓｔ 和 Ｂｇｔ
ＩＴＳ序列设计引物和探针(见表 １)ꎮ
１.１.２　 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 反应条件 　 反应体系为 ２０
μＬ:四条引物各 ０.３０ μＬ (１０ μＭ )、两条探针各
０.２５ μＬ (１０ μＭ )、Ｔａｑ 酶 ０.６０ μＬ (５ Ｕ / μＬ )、
ｄＮＴＰ ２.００ μＬ (２ ５００ μＭ )、１０× ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２.００
μＬ、ＭｇＣｌ２３. ２０ μＬ (２５ μＭ )、ｄｄＨ２ Ｏ ８. ８０ μＬ、
ＤＮＡ 模板 ２. ００ μＬꎮ 反应参数: ９５ ℃ 预变性
３ ｍｉｎꎬ１个循环ꎻ９４ ℃变性 ２０ ｓꎬ５５ ℃退火 ３０ ｓꎬ
７２℃延伸 ３０ ｓꎬ４０个循环ꎮ
１.１.３　 特异性测定　 以小麦常见病原菌(表 ２)基
因组 ＤＮＡ为模板(浓度为 １ ｎｇ / μＬ)ꎬ验证反应的
特异性ꎮ
１.１.４　 灵敏度测定　 将浓度为 １ ｎｇ / μＬ 的 Ｐｓｔ 和
Ｂｇｔ ＤＮＡ１０倍梯度稀释至最低 １０－５ｎｇ / μＬꎬ进行灵
敏度测定ꎮ
１.１.５　 多重定量的准确性 　 采用正交试验设计ꎬ
２因素(两种病菌 ＤＮＡ)ꎬ４ 水平(４ 个浓度梯度
１ ｎｇ / μＬ、２ ´１０－２ ｎｇ / μＬ、４ ´１０－４ ｎｇ / μＬ 和 ０)ꎬ两
种病菌 ＤＮＡ 各取 １ μＬꎬ作为模板进行定量检测ꎮ
分析在不同浓度水平下ꎬ两种病菌 ＤＮＡ 对相互定
量结果的影响ꎮ
１.２　 孢子数量的定量测定
１.２.１　 标准样本与模拟样本 　 分别配制浓度为
６２５、１２５、２５、５、１ 个孢子 / μＬ 的 Ｐｓｔ 夏孢子和 Ｂｇｔ
分生孢子悬浮液ꎮ 为模拟含有空气尘埃等杂质的
孢子捕捉样本ꎬ用收集管收集自然环境中不含有
Ｐｓｔ、Ｂｇｔ的空气尘埃等杂质ꎬ待下一步提取模拟样
本 ＤＮＡ时使用ꎮ
１.２. ２ 　 ＤＮＡ 提取和 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 检测 　 使用
ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ® ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔꎬ参照其使用说明提
取 ＤＮＡꎮ 其中标准样本直接取 １０ μＬ 孢子悬浮液
进行ＤＮＡ提取ꎬ模拟样本是将 １０ μＬ孢子悬浮液随
机加入一个含杂质的收集管中ꎬ然后用裂解液全部
洗脱进裂解管后进行 ＤＮＡ提取ꎮ 提取的标准样本
和模拟样本 ＤＮＡ进行 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ定量分析ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｄｕｐｌｅｘ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｐａｔｈｏｇｅｎ
Ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ
ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ
ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｐｒｏｂｅｓ / ５′￣３′
Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ
ｌｅｎｇｔｈ / ｂｐ
Ｐｓｔ
ＩＴＳ
ＧＵ３８２６７３.１
Ｐｓｔ￣Ｆ:ＡＡＣＣＣＴＣＴＣＡＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧ
Ｐｓｔ￣Ｒ: ＣＣＡＡＣＴＴＡＴＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＣＴＴＡ
Ｐｓｔ￣Ｐ:ＦＡＭ￣ＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＴ￣ＢＨＱ１
１０２
Ｂｇｔ
ＩＴＳ
ＡＢ０２２３７７.１
Ｂｇｔ￣Ｆ: ＣＣＧＴＡＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＡＡＧ
Ｂｇｔ￣Ｒ: ＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＧＡ
Ｂｇｔ￣Ｐ: ＨＥＸ￣ＴＡＴＴＧＧＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＣＴＣ￣ＢＨＱ１
１５７
６０２
　
　 ２期 李勇ꎬ等:小麦条锈病菌和白粉病菌多重 ＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法的建立
１.２.３　 标准曲线的建立　 以 Ｃｔ 值为横坐标ꎬ孢子
数对数为纵坐标ꎬ对标准样本、模拟样本和二者合
并后的所有样本分别作直线回归ꎬ得到标准曲线及
其方程ꎮ
１.３　 田间测试
１.３.１　 地点选择　 孢子捕捉器安放于甘肃省农业
科学院植物保护研究所甘谷试验站内一层建筑楼
顶(经度 Ｅ １０５. ２９１４４°ꎬ纬度 Ｎ ３４. ７６２８１° ꎬ海拔
１ ２８９ ｍ)ꎮ 小麦条锈病和白粉病在当地常年发生ꎮ
１.３.２　 样本的获得和处理　 孢子捕捉器每个样本
采集时间为 ０:００至次日 ０:００ꎬ吸入空气的速率为
１６.５ Ｌ / ｍｉｎꎬ每周采集 ２ ~ ３ 个样本ꎮ 监测时间为
２０１３年 ４－１１ 月ꎬ样本到达实验室后进行 ＤＮＡ 提
取和 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＰＣＲ体系
２.１.１　 反应特异性　 Ｐｓｔ 和 Ｂｇｔ 基因组 ＤＮＡ出现显
著扩增ꎬ其他病原菌基因组 ＤＮＡ未有扩增 (表 ２)ꎮ
２.１.２　 反应灵敏度　 图 １￣Ａ和图 １￣Ｂ 显示两种病菌
ＤＮＡ可检测出的最低浓度为 １０－４ ｎｇ / μＬꎬ浓度为 １０－５
ｎｇ / μＬ的 Ｐｓｔ 和 Ｂｇｔ ＤＮＡ及阴性对照未见扩增ꎮ
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐａｔｈｏｇｅｎ ( ｒａｃｅ ｏｒ ｓｏｕｒｃｅ) Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｏｒ ｎｏｔ
Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ(ＣＹ３１) ＋
Ｐ. ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ(ＣＹ３２) ＋
Ｐ. ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ(ＣＹ３３) ＋
Ｐ. ｔｒｉｔｉｃｉｎａ －
Ｐ. ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ －
Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ －
Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ
( ｒａｃｅ ｕｎｋｎｏｗｎꎬ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｚｈｏｕ Ｙｉｌｉｎ ｆｒｏｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ)
＋
Ｂ. ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ(ｓａｍｐｌｅｄ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ) ＋
Ｂ. ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ(ｓａｍｐｌｅｄ ａｔ Ｇａｎｇｕ Ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ) ＋
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ －
Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ －
Ｂ. ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ －
　 Ｎｏｔｅ:“＋” ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄꎬ “－” ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｏｔ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ.
Ｆｉｇ. １　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ Ｐｓｔ (Ａ) ａｎｄ Ｂｇｔ (Ｂ)
Ｎｏｔｅ:Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｆｒｏｍ ｌｅｆｔ ｔｏ ｒｉｇｈｔ ｉｎ ｂｏｔｈ ｓｕｂｆｉｇｕｒｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ａ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ａｓ １ꎬ１０－１ꎬ１０－２ꎬ１０－３ꎬ１０－４ｎｇ / μＬ ｆｏｒ Ｐｓｔ ( ｆｉｇ.１￣Ａ) ａｎｄ Ｂｇｔ ( ｆｉｇ.１￣Ｂ) .
７０２
　
植物病理学报 ４５卷
２.１.３　 多重定量的准确性 　 对于各个浓度的 Ｐｓｔ
ＤＮＡ(１ ｎｇ / μＬ、２ ´１０－２ ｎｇ / μＬ、４ ´１０－４ ｎｇ / μＬ 和
０)ꎬ均有各个浓度 Ｂｇｔ ＤＮＡ 与其混合的 ４ 个处理ꎬ
反之亦然ꎮ 用 ＳＡＳ软件 ＧＬＭ过程对每一浓度 ４个
处理的 Ｃｔ值数据进行方差分析ꎬＰ值均大于０.０５ꎬ显
示各组处理结果均无显著差异ꎬ确定该多重定量方
法ꎬ在 １ ｎｇ / μＬ以下的 ＤＮＡ 浓度范围内ꎬ两种病原
菌 ＤＮＡ的定量没有相互干扰(表 ３)ꎮ
２.２　 标准曲线
　 　 使用 ＳＡＳ程序的 ＧＬＭ过程ꎬ通过分析标准样
本、模拟样本直线回归方程截距和斜率的差异ꎬ来
判断二者是否存在显著差异ꎮ 结果显示在 α＝０.０５
水平ꎬ标准样本和模拟样本的定量结果均无显著差
异 (表 ４)ꎮ 所以合并标准样本和模拟样本数据做
直线回归ꎬ得到本研究定量测定 Ｐｓｔ 的标准曲线方
程 ｙ＝－０.３０９ ｘ＋１１.７４ꎬＲ２ ＝０.９８４ꎬＰ<０.０１(图 ２￣Ａ)
和 Ｂｇｔ的标准曲线方程 ｙ ＝ －０.２８０ ｘ＋１０.６６ꎬＲ２ ＝
０.９９４ꎬＰ<０.０１(图 ２￣Ｂ)ꎮ
２.３　 田间测定
　 　 孢子捕捉样本检测结果(图 ３)表明:在 ６月初
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｅｍｐｌｅ ＤＮＡ ｉｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｐｓｔ ＤＮＡ ｎｇ / ｕＬ Ｂｇｔ ＤＮＡ ｎｇ / ｕＬ Ｃｔ ｖａｌｕｅ￣ＦＡＭ Ｃｔ ｖａｌｕｅ￣ＨＥＸ
１
１ ２３.０７ ２２.８２
２ ´１０－２ ２２.６２ ２９.１４
４ ´１０－４ ２２.５１ ３５.９７
０ ２２.７１ －
２ ´１０－２
１ ３０.１３ ２２.８７
２ ´１０－２ ２９.８２ ２９.２９
４ ´１０－４ ２９.７７ ３５.３３
０ ２９.７５ －
４ ´１０－４
１ ３５.４１ ２２.６７
２ ´１０－２ ３６.１０ ２９.０８
４ ´１０－４ ３５.４８ ３５.０２
０ ３６.４６ －
０
１ － ２２.７６
２ ´１０－２ － ２９.１０
４ ´１０－４ － ３５.６５
０ － －
　 Ｎｏｔｅ:Ｃｔ ｖａｌｕｅ ｉｓ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ.
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｇｒｏｕｐｓ
Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｍｐｌｅ Ｓｉｍｕｌａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ Ｐ ｖａｌｕｅ ( ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ) Ｐ ｖａｌｕｅ (ｓｌｏｐｅ)
Ｐｓｔ
ｙ＝－０.２９７ ｘ＋１１.４１
Ｒ２ ＝ ０.９８８
ｙ＝－０.３２３ ｘ＋１２.１５
Ｒ２ ＝ ０.９８５
０.３２８ ３ ０.０７８ ６
Ｂｇｔ
ｙ＝－０.２８７ ｘ＋１０.８５
Ｒ２ ＝ ０.９９７
ｙ＝－０.２７３ ｘ＋１０.４９
Ｒ２ ＝ ０.９９３
０.３７８ １ ０.０８６ ７
８０２
　
　 ２期 李勇ꎬ等:小麦条锈病菌和白粉病菌多重 ＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法的建立
　
Ｆｉｇ. ２　 Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ Ｐｓｔ (Ａ) ａｎｄ Ｂｇｔ (Ｂ)
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ａｉｒｂｏｒｎｅ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｏｆ Ｐｓｔ (Ａ) ａｎｄ Ｂｇｔ (Ｂ) ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ
９０２
　
植物病理学报 ４５卷
前ꎬ空中 Ｐｓｔ浓度很低ꎬ之后急剧上升ꎬ并出现较大
的波动至 ７月初ꎬ之后下降维持在低值ꎬ在 １０ 月初
迎来第二次高峰ꎬ１０ 月中旬再次进入低值ꎻＢｇｔ 在
４月中旬有一次小高峰ꎬ之后一个月进入低值ꎬ５ 月
中旬开始进入持续一个半月的高峰期ꎬ期间明显波
动ꎬ７ 月初下降并维持在低值ꎬ１０ 月初再次达到高
峰ꎬ１０月中旬再进入低值ꎮ
３　 结果与讨论
　 　 本研究建立了一种能同时检测 Ｐｓｔ 和 Ｂｇｔ 的
多重 ＴａｑＭａｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 方法ꎬ样本提取 ＤＮＡ
后ꎬ进行 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 反应ꎬ结合建立的标准曲
线ꎬ可计算出样本所含孢子数量ꎬ对两种病菌的检
测灵敏度达 １０ 个夏孢子或分子孢子ꎬ方法具有良
好的特异性ꎬ定量结果准确ꎮ 结合孢子捕捉器采集
样本ꎬ可对空中的两种病菌浓度进行监测ꎮ 通过在
试验站的实测应用ꎬ得到了 ２０１３ 年 ４￣１１ 月空中两
种病菌孢子的浓度动态ꎮ
　 　 两种病菌空中孢子浓度变化呈现较为一致的
规律ꎬ有明显的高峰期和低值期ꎮ ５￣６ 月空中孢子
波动明显ꎬ可能与当地 ５￣６ 月份频繁的降雨有关ꎮ
孢子捕捉器周边小麦从 ６月下旬开始陆续收割ꎬ而
空中孢子数量从 ７月份开始降到较低值ꎬ极可能与
田间寄主数量急剧减少有关ꎮ 两种病菌空中孢子
浓度在 １０月上旬出现高峰ꎬ推测此时段监测到的
大量病菌可能来源于当地高海拔地区自生麦苗上
的越夏菌源的传播扩散ꎮ 由于 １０月上旬该地小麦
处于出苗期ꎬ这些下传菌源对当地小麦条锈病、白
粉的发生有何影响尚待研究ꎮ
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责任编辑:曾晓葳
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