全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(４): ４３３￣４３７(２０１４)
收稿日期: ２０１２￣１０￣３１ꎻ 修回日期: ２０１３￣１０￣２０
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３０３００２０７)
通讯作者: 孔维文ꎬ副教授ꎬ主要从事植物抗病性机制和抗病基因工程研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｗｋｏｎｇ＠ｙｚｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
刘爱新ꎬ副教授ꎬ主要从事分子植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｉｕａｘ＠ｓｄａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ ꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０４.０１３
研究简报
含双病原物诱导启动子无选择标记转基因烟草的获得
孔维文１∗ꎬ 王丹丹２ꎬ 刘爱新２∗
( １扬州大学园艺与植物保护学院ꎬ扬州 ２２５００９ꎻ２山东农业大学植物保护学院ꎬ泰安 ２７１０１８)
Ａｃｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｒｋｅｒ￣ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｗｏ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕ￣
ｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ＫＯＮＧ Ｗｅｉ￣ｗｅｎ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｄａｎ￣ｄａｎ２ꎬ ＬＩＵ Ａｉ￣ｘｉｎ２ ( １Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｙａｎｇｚｈｏｕ ２２５００９ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ２Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ
Ｔａｉ’ａｎ ２７１０１８ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ａｒｅ ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｅｄｉｂｌｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｅｃｕｒｉｔｙ. Ｍａｒｋｅｒ￣ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ ｃａｎ ｂｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｗｉｎ Ｔ￣ＤＮＡｓ.
Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｗｉｎ Ｔ￣ＤＮＡｓ ａｎｄ ｔｗｏ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｗａｓ
ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｐｏｒｔｅｄ. Ｔｈｅｓｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ
ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｗｅ ｒｅｐｏｒｔ ｔｈａｔ Ｔ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｇｅｎｅｔ￣
ｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｅｒ￣ｆｒｅｅ ｌｉｎｅｓ. Ｔｈｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ
ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｔ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｆｉｒｓｔｌｙꎬ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅ￣
ｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ Ｔ１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｆｒｏｍ １４ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ ｌｉｎｅｓ. Ｉｔ ｗａｓ
ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＮＰＴＩＩ ｇｅｎｅｓ ｍｅｔ ｗｅｌｌ ｗｉｔｈ Ｍｅｎｄｅｌ’ｓ ｌａｗ ｉｎ １３ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｉｎｅｓ. Ｓｏ ｉｔ
ｗａｓ ｄｅｄｕｃｅｄ ｔｈａｔ ＮＰＴＩＩ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ. Ｔｈｅｎ ｔｈｅ
ＮＰＴＩＩ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｕｉｄＡ ｇｅｎｅｓ ｏｆ １３０ Ｔ１ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ １３ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｉｎｅｓ. Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｕｉｄＡ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｏｎｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ２０.７７％ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓꎬ ＮＰＴＩＩ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｓｏｌｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｉｎ ２２.３１％ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓꎬ ｂｕｔ ｂｏｔｈ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎ ５３.８５％ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ. Ｔｈｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ
ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌａｗ ｏｆ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ (９ ∶ ３ ∶ ３ ∶ １) . Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｎｏ ｌｉｎｋａｇｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｅｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔ１
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ. Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄꎬ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｂａｃｋｃｒｏｓｓꎬ ｉｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａ ｍｏｒｅ ｅａｓｙ ａｎｄ
ｒａｐｉｄ ｗａｙ ｔｏ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ ｍａｒｋｅｒ￣ｆｒｅｅꎻ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０４￣０４３３￣０５
外源基因的引入造成转基因植物的食用安全
性和环境安全性问题ꎮ 此外ꎬ选择标记基因还可能
使植株再生困难ꎬ及后继转基因工作不能再用相同
的选择标记基因[１]ꎮ 若转基因植株在释放时其外
源抗性选择标记基因得到剔除ꎬ则上述问题可得到
解决ꎮ 目前ꎬ获得无选择标记转基因植株的方法有
多种ꎬ各有其优缺点ꎮ 比较而言ꎬ双 Ｔ￣ＤＮＡ 区
法[２]适用范围较广ꎬ操作简便ꎬ基因转化效率高ꎮ
植物病理学报 ４４卷
我们曾用双 Ｔ￣ＤＮＡ 区法ꎬ将选择标记新霉素
磷酸转移酶基因(Ｎｅｏｍｙｃｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＩＩꎬ
ＮＰＴＩＩ)与报告基因 β￣葡糖苷酸酶基因(β￣ｇｌｕｃｕ￣
ｒｏｎｉｄａｓｅꎬ ｕｉｄＡ)隔开ꎬ构建了植物表达载体ꎮ 其
中ꎬｕｉｄＡ 基因置于串联的双病原物特异性诱导启
动子下ꎮ 对转基因烟草的检测发现ꎬ不仅双启动子
有诱导活性ꎬ而且还能协同促进 ｕｉｄＡ 基因的高效
表达[３ꎬ４]ꎮ 本文中ꎬ我们报道进一步的工作ꎬ即分
析了利用双 Ｔ￣ＤＮＡ区隔开的选择标记基因 ＮＰＴＩＩ
与报告基因 ｕｉｄＡ 在转基因烟草后代中的分离情
况ꎬ以评估使用该方法获得无选择标记基因的转基
因植株的效果ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
植物材料为野生型三生烟 (Ｎ. ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ. Ｓａｍ￣
ｓｕｎ (ＮＮ))、ＮＣ８９及部分转基因三生烟株系ꎮ 选择
有 ＧＵＳ诱导活性的转基因株系共 １４个ꎬ其中 Ａ０６、
Ａ０７、Ａ１３为含单一启动子 ＨＰ１的转基因株系ꎬＣ０３、
Ｃ０９、Ｃ１１为含单一启动子 ＥＰ１ 的转基因株系ꎬＢ０１、
Ｂ０３、Ｂ０９、Ｂ１０ 为含双启动子 ＨＰ１＋ＥＰ２ 的转基因株
系ꎬＤ０７、Ｄ０９、Ｄ２１、Ｄ１８为含双启动子 ＥＰ１＋ＨＰ２的转
基因株系[３]ꎮ 各株系的 Ｔ１代幼苗用于检测选择标记
基因 ＮＰＴＩＩ与报告基因 ｕｉｄＡ的分离情况ꎮ 筛选培养
基为含不同浓度卡那霉素的ＭＳ培养基ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 转基因 Ｔ１代植株卡那霉素抗性测定 选取
１４个转基因株系自交后代的种子ꎬ用 ７０％乙醇表
面消毒 １ ｍｉｎꎬ无菌水冲洗 ２ ~ ３ 次ꎬ再用 ３０％次氯
酸钠表面消毒 １０~１５ ｍｉｎꎬ无菌水冲洗 ２ ~ ３ 次ꎬ将
种子播种于含不同浓度卡那霉素的 ＭＳ 选择培养
基中ꎮ 以相同处理的野生型三生烟和 ＮＣ８９ 的种
子为对照ꎮ 平板置于 ２５ ℃光照培养箱中培养ꎬ光
照时间为每天 １６ ｈꎮ 每一处理设置 ３次重复ꎬ每一
重复至少 １００粒种子ꎮ 待种子萌发后ꎬ观察统计绿
色苗与白化苗数量并计算二者比值ꎮ
１.２.２ 转基因烟草 ＰＣＲ检测 按前述方法提取烟
草 ＤＮＡ和建立 ＰＣＲ体系 [ ３ ]用于扩增 ＮＰＴＩＩ 片段
的 上 游 引 物 ｎｐｔ１: ５′￣ＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧ￣
ＧＣＧＡＴＧ￣３′ꎬ下游引物 ｎｐｔ２:５′￣ＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴ￣
ＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣ￣３′ꎮ 反应程序为:９５ ℃ / ５ ｍｉｎꎻ
９４ ℃ / ３０ ｓｅｃꎬ５５ ℃ / ３０ ｓｅｃꎬ７２ ℃ / ３０ ｓｅｃ ꎬ３０ 次循
环ꎻ７２ ℃ / ７ ｍｉｎꎮ ＮＰＴＩＩ片段预期扩增产物大小为
７６９ ｂｐꎮ ｕｉｄＡ基因的检测参见文献[３]ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 卡那霉素浓度的确定
将构建的植物表达载体转入烟草中ꎬ获得了转
基因烟草植株[ ３ ]ꎮ 为确定筛选适合表型的最佳卡
那霉素浓度ꎬ检测了不同烟草品种(系)对卡那霉
素的敏感性ꎮ 转基因株系的 Ｔ１代幼苗在不同卡那
霉素浓度的培养基中表现出明显差异ꎬ在 １２５~ １５０
ｍｇ / Ｌ 浓度下培养 １０ ｄꎬ大部分幼苗叶片保持绿
色、根系较发达ꎬ能正常生长ꎬ１５ ｄ 后逐渐分化出
绿色苗与白化苗ꎻ但在 １７５ ｍｇ / Ｌ 浓度下ꎬ２５ ℃培
养 １０ ｄ即出现绿色苗和白化苗ꎬ大部分幼苗可正
常生长ꎬ少部分褪绿黄化、根系短小ꎮ 当浓度达
２００ ｍｇ / Ｌ以上时ꎬ多数植株生长弱小ꎬ不能生根和
长出真叶ꎬ且褪绿明显(图 １)ꎮ 野生型三生烟在不
同卡那霉素浓度下幼苗长势也有较大差异ꎬ在浓度
为 １２５~１５０ ｍｇ / Ｌ 时ꎬ幼苗可正常生长ꎬ但生长较
慢ꎬ当浓度达 ２００ ｍｇ / Ｌ 以上时ꎬ幼苗黄化褪绿严
重、几乎无法生根ꎻ对照品种 ＮＣ８９ 表现类似的生
长情况(图 １)ꎮ 根据各品种(系)在不同浓度下的
表现ꎬ确定卡那霉素浓度为 １７５ ｍｇ / Ｌꎬ２５℃培养
１０ ｄ为分化筛选的最适条件ꎮ
２.２ 转基因 Ｔ１代幼苗抗生素抗性的表型分化及
其分子检测
取不同转基因株系的 Ｔ１代种子ꎬ经表面消毒ꎬ
播种于含 １７５ ｍｇ / Ｌ 卡那霉素的 ＭＳ 培养基中ꎬ光
照培养 １０ ｄꎬ对不同转基因株系中绿色幼苗和白化
苗(图 ２)进行了统计(表 １)ꎮ 分析发现ꎬ除双启动
子 ＥＰ１＋ＨＰ２ 的转基因株系 Ｄ１８ 中绿色幼苗与白
化苗比例为 １３.８外ꎬ其他 １３ 个株系中绿色苗与白
化苗的比例接近 ３ ∶ １ꎮ 经 χ２测试ꎬ除 Ｄ１８株系外ꎬ
其他 １３个株系的种子群体的基因分离比符合３ ∶ １
的法则(χ２ ＝０.３５５６<χ２( １２ ꎬ ０.０５ )＝ ２１.０３)ꎮ
从上述 １３个株系中各选 １０株共 １３０株 Ｔ１代幼
苗ꎬ提取基因组 ＤＮＡꎬ检测 ＮＰＴＩＩ 基因ꎬ结果表明ꎬ
ＮＰＴＩＩ 基因检测为阳性的植株有 ９９ 株ꎬ占７６.１５％ꎬ
ＰＣＲ检测结果为阴性占 ２５. ８５％ꎬ两者比值接近
３ ∶ １ꎬ与表型测定结果一致ꎮ ＰＣＲ电泳结果略ꎮ
４３４
４期 孔维文ꎬ等:含双病原物诱导启动子无选择标记转基因烟草的获得
Ｆｉｇ. １ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｇｒｏｗｉｎｇ ｏｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ
ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ
Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈｅｓ ａｒｅ ｓｈｏｗｎ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ.
Ｆｉｇ. ２ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ１ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｇｒｏｗｉｎｇ ｏｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ
Ｌｏｎｇ ａｒｒｏｗ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｇｒｅｅｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇꎻ Ｓｈｏｒｔ ａｒｒｏｗｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ａｌｂｉｎｏ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ.
２.３ 转基因烟草中ＮＰＴＩＩ基因与 ｕｉｄＡ基因的分离
本研究在构建植物表达载体时ꎬ将 ＮＰＴＩＩ选择
标记基因与 ｕｉｄＡ 报告基因分别置于两个不同的
Ｔ￣ＤＮＡ区ꎬ使两个基因能整合到植物染色体上不
同的位点ꎬ然后通过转基因植株自交ꎬ实现抗性标
记基因与报告基因在后代中分离ꎮ
５３４
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＰＴＩＩ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｔ１ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ
ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ Ｇｒｅｅｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇ(ＫａｎＲ) Ａｌｂｉｎｏ ｓｅｅｄｌｉｎｇ(ＫａｎＲ－) Ｒａｔｉｏ∗
Ａ０６ ２４５ ８４ ２.９２:１
Ａ０７ ２５９ ９５ ２.７３:１
Ａ１３ ３００ １０７ ２.８０:１
Ｂ０１ １８２ ７７ ２.３６:１
Ｂ０３ ２２１ ７７ ２.８７:１
Ｂ０９ １０９ ３３ ３.３０:１
Ｂ１０ １６２ ４５ ３.６０:１
Ｃ０３ ２８９ ９９ ２.９２:１
Ｃ０９ ２１９ ７６ ２.８８:１
Ｃ１１ １７３ ５９ ２.９３:１
Ｄ０７ ２１７ ７７ ２.８２:１
Ｄ０９ ９２ ３０ ３.０７:１
Ｄ１８ ２７６ ２０ １３.８０:１
Ｄ２１ ２２９ ７４ ３.０９:１
Ａ: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ＨＰ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ Ｂ: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ＨＰ１ ａｎｄ ＥＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓꎻ Ｃ: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ｃａｒｒｙ￣
ｉｎｇ ＥＰ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ Ｄ: Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ＥＰ１ ａｎｄ ＨＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ.
∗: Ｉｔ ｒｅｆｅｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｔｏ ａｌｂｉｎｏ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ.
为了解 ＮＰＴＩＩ 与 ｕｉｄＡ 是否在自交后代中分
离ꎬ对前面检测到 ＮＰＴＩＩ的 １３０ 株 Ｔ１代幼苗ꎬ进一
步检测含 ｕｉｄＡ 基因的情况ꎮ ｕｉｄＡ 基因扩增结果
略ꎮ 在检测的这 １３０ 株植株中ꎬ同时含 ＮＰＴＩＩ 和
ｕｉｄＡ基因的有 ７０株ꎬ占 ５３.８４６％ꎻ仅含 ＮＰＴＩＩ基因
的植株有 ２９ 株ꎬ占 ２２.３０８％ꎻ仅含 ｕｉｄＡ 基因的植
株 ２７ 株ꎬ占 ２０. ７６９％ꎻ既不含 ＮＰＴＩＩ 基因又不含
ｕｉｄＡ基因的植株 ４株ꎬ占 ３.０７７％(表 ２)ꎮ
Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＰＴＩＩ ａｎｄ ｕｉｄ Ａ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｔ１ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ
Ｇｅｎｏｔｙｐｅ
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｓｅｅｄｌｉｎｇ
Ｒａｔｉｏ / ％
Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ
ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ∗
ＮＰＴＩＩ＋ｕｉｄＡ ７０ ５３.８５ ５６.２５％ (９:１６)
ＮＰＴＩＩ ２９ ２２.３１ １８.７５％ (３:１６)
ｕｉｄＡ ２７ ２０.７７ １８.７５％ (３:１６)
Ｎｏｎｅ ４ ３.０７７ ６.２５％ (１:１６)
∗: Ｉｔ ａｓｓｕｍｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｂｅｙｓ ｔｈｅ ｌａｗ ｏｆ ｉｎｄｅ￣
ｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔꎬ Ｍｅｎｄｅｌｓ ｓｅｃｏｎｄ ｌａｗ.
ＮＰＴＩＩ与 ｕｉｄＡ基因的分离比经 χ２测试符合独
立分配定律[ ９ ∶ ３ ∶ ３ ∶ １(χ２ ＝ ３.３８８<χ２( ３ ꎬ ０.０５ ) ＝
７.８１)]ꎬ即抗性选择标记基因与报告基因在 Ｔ１代
发生了独立分离ꎮ 该方法比传统利用回交剔除抗
性选择标记基因的方法更便捷ꎮ
３ 结论与讨论
我们用双 Ｔ￣ＤＮＡ 区法构建含 ＮＰＴＩＩ 和 ｕｉｄＡ
基因的植物表达载体ꎬ其中 ｕｉｄＡ 基因的启动子是
含双病原物诱导启动子的人工融合启动子ꎮ 在 １４
个转基因烟草株系中ꎬ有 １３ 个株系在自交 Ｔ１代中
ＮＰＴＩＩ基因的分离符合孟德尔分离比例 ３ ∶ １ꎬ说明
转入的外源 ＮＰＴＩＩ 基因以单拷贝形式插入同源染
色体中的一条染色体上ꎮ 在含单拷贝外源基因的
转基因植株中ꎬＴ１代 ＮＰＴＩＩ 基因和 ｕｉｄＡ 基因的分
离比例符合独立分配定律 ９ ∶ ３ ∶ ３ ∶ １ꎬ说明两个
基因无连锁关系ꎬ在 Ｔ１代发生了独立分离ꎮ 综合
研究结果ꎬ用这种方法可获得含双病原物诱导启动
子的无选择标记的转基因植株ꎬ这为抗病基因工程
中解决转基因植株的安全性问题提供了有效途径ꎮ
６３４
４期 孔维文ꎬ等:含双病原物诱导启动子无选择标记转基因烟草的获得
用双 Ｔ￣ＤＮＡ 区法构建载体获得的转基因植
株ꎬ需通过后代自交剔除选择标记基因ꎮ 若有性杂
交困难ꎬ则不能用这一方法ꎮ 目前已有文献报道不
使用任何选择标记基因或报告基因的转基因技
术[５]ꎬ可为解决转基因安全性问题提供另一思路ꎮ
参考文献
[１] Ｅｎｄｏ Ｓꎬ Ｓｕｇｉｔａ Ｋꎬ Ｓａｋａｉ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｉｎｇｌｅ￣ｓｔｅｐ ｔｒａｎｓ￣
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍａｒｋｅｒ￣ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ
ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｐｔ￣ｔｙｐｅ ＭＡＴ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ [ Ｊ] . Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ
Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２００２ꎬ ３０(１):１１５－１２２.
[２] Ｋｏｍａｒｉ Ｔꎬ Ｈｉｅｉ Ｙꎬ Ｓａｉｔｏ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ
ｔｗｏ ｓｅｐａｒａｔｅ Ｔ￣ＤＮＡｓ ｆｏｒ ｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ
ｐｌａｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ａｎｄ
ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｆｒｅｅ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋ￣
ｅｒｓ [Ｊ] . Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ １９９６ꎬ １０(１):１６５－１７４.
[３] Ｗａｎｇ Ｄ Ｄꎬ Ｗａｎｇ Ｒꎬ Ｔａｎｇ Ｌ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｏｆ
ｐｌａｎｔ ｓａｆｅｔｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｗｏ ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏ￣
ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报)ꎬ ２００９ꎬ ３９(２):
１５３－１５９.
[４] Ｋｏｎｇ Ｗ Ｗꎬ Ｗａｎｇ Ｄ Ｄꎬ Ｌｉｕ Ａ Ｘ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ
ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｔｗｏ ｔａｎｄｅｍ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃ￣
ｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉ￣
ｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报)ꎬ ２０１３ꎬ ４３(４):３７６－３８２.
[５] Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｍꎬ Ｐｒａｓａｄ Ｋꎬ Ｂｈａｔｎａｇａｒ￣Ｍａｔｈｕｒ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ.
Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｋｅｒ￣ｆｒｅｅ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ( Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ Ｌ.)
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐꎬ ２０１０ꎬ ２９(５):４９５－５０２.
责任编辑:张宗英
欢迎订阅«植物病理学报»
«植物病理学报»是中国植物病理学会主办的全国性学术刊物ꎬ“中国科技核心期刊”ꎮ 主要刊登
植物病理学各分支未经发表的专题评述、研究论文和研究简报等ꎬ以反映中国植物病理学的研究水平
和发展方向ꎬ推动学术交流ꎬ促进研究成果的推广和应用ꎮ
本刊现已被英国农业与生物技术文摘(ＣＡＢ)、联合国粮农组织 ＡＧＲＩＳ 等收录ꎮ 据«中国科技期
刊引证报告»(２０１３年版)统计结果ꎬ«植物病理学报»影响因子 ０.７７０ꎮ 荣获首届«中国学术期刊检索
与评价数据规范»(ＣＡＪ￣ＣＤ)执行优秀期刊奖、２０１２ 中国国际影响力优秀学术期刊奖和 ２０１２ 百种中
国杰出学术期刊奖ꎮ
本刊为双月刊ꎬ每期定价 ３０元ꎬ全年 ６期共 １８０元ꎮ
邮发代号: ８２￣２１４ꎮ 欢迎投稿ꎬ欢迎订阅ꎮ
编辑部地址: 北京市海淀区圆明园西路 ２号 中国农业大学植保楼 ４０６室
邮编: １００１９３
电话: (０１０) ６２７３ ２３６４
Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｗｂｌｘｂ＠ ｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
７３４