全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(３): ２５８￣２６９(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０４￣２８ꎻ 修回日期: ２０１４￣１２￣１２
基金项目: 国家自然科学基金(３１２０１４６６)ꎻ中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(ＳＪＢ１３０４)
通讯作者: 杨家荣ꎬ教授ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｙａｎｇｊｉａｒｏｎｇ２０１２＠１６３.ｃｏｍ
朱荷琴ꎬ副研究员ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｈｅｑｉｎａｎｙａｎｇ＠ｓｏｈｕ.ｃｏｍ
共同第一作者: 刘义杰ꎬ女ꎬ河北省石家庄人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｉｊｉｅｌｉｕ８２１＠１６３.ｃｏｍ
李志芳ꎬ女ꎬ河南省濮阳人ꎬ副研究员ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｌｉｚｈｉｆａｎｇ２００９＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０３.００５
棉花黄萎病菌低致病力突变体的表型
分析及致病相关基因克隆
刘义杰１ꎬ２＃ꎬ 李志芳２＃ꎬ 冯自力２ꎬ 赵丽红２ꎬ 周芳芳２ꎬ 师勇强２ꎬ 杨家荣１∗ꎬ 朱荷琴２∗
( １旱区作物逆境生物学国家重点实验室 /西北农林科技大学植物保护学院ꎬ杨凌 ７１２１００ꎻ
２ 棉花生物学国家重点实验室 /中国农业科学院棉花研究所ꎬ安阳 ４５５０００ꎻ)
摘要:本研究通过对菌核型强致病力菌株 Ｖｄ０８０产生的 ８００个 Ｔ￣ＤＮＡ插入突变体进行致病力测定ꎬ筛选得到 ３１株致病力极
显著降低的突变体ꎬ并对其进行了生物学性状分析ꎮ 分子验证结果表明ꎬ这些低致病力突变体均为阳性ꎬ且有 ２５株的 Ｔ￣ＤＮＡ
为单拷贝插入ꎮ 与野生型菌株 Ｖｄ０８０相比ꎬ这 ２５株低致病力突变体菌落形态变异丰富ꎬ除了 ８株与野生型菌株形态一致的菌
核型突变体外ꎬ还有 ３株黄色菌丝型ꎬ２株白色菌丝型和 １２株中间型突变体ꎮ 此外ꎬ多数突变体的生长速率、产孢量和粗毒素
产量都发生了显著变化ꎬ且各生理指标之间并无明显相关性ꎮ 借助 ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ技术和 ＶｄＬｓ.１７的基因组数据库ꎬ进一步获得
了这 ２５株单拷贝插入低致病力突变体 Ｔ￣ＤＮＡ的侧翼序列ꎬ并从 Ｖｄ０８０中成功克隆得到了影响黄萎病菌致病力的相关基因ꎮ
关键词:大丽轮枝菌ꎻ 低致病力突变体ꎻ 生物学性状ꎻ 侧翼序列分析ꎻ 基因克隆
Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｏｗ ｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｎ ｃｏｔｔｏｎ ａｎｄ
ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ＬＩＵ Ｙｉ￣ｊｉｅ１ꎬ２ꎬ ＬＩ Ｚｈｉ￣ｆａｎｇ２ꎬ ＦＥＮＧ Ｚｉ￣ｌｉ２ꎬ ＺＨＡＯ Ｌｉ￣
ｈｏｎｇ２ꎬ ＺＨＯＵ Ｆａｎｇ￣ｆａｎｇ２ꎬ ＳＨＩ Ｙｏｎｇ￣ｑｉａｎｇ２ꎬ ＹＡＮＧ Ｊｉａ￣ｒｏｎｇ１ꎬ ＺＨＵ Ｈｅ￣ｑｉｎ２ ( １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｙａｎｇｌｉｎｇ ７１２１００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｏｔｔｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ / Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｏｔｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ａｎｙａｎｇ ４５５０００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: ８００ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ｓｔｒａｉｎ Ｖｄ０８０ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｍｉｃｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉａ ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔｓ. Ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍꎬ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ ３１ ｍｕｔａｎｔｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｒｅｄｕｃｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ａｌｌ ｔｈｅ ｌｏｗ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ２５ ｍｕｔａｎｔｓ ｈａｄ ｓｉｎｇｌｅ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｅｄ. Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｗｉｌｄ
ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎＶｄ０８０ꎬ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ. Ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍꎬ ８ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ
ｔｙｐｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉａꎬ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ３ ｙｅｌｌｏｗ ｍｙｃｅｌｉａꎬ ２ ｗｈｉｔｅ ｍｙｃｅｌｉａ ａｎｄ １２ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｓｔｒａｉｎｓ.
Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅꎬ ｓｐｏｒｅ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｃｒｕｄｅ ｔｏｘｉｎ ｏｆ ｍｏｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｈａｎｇｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙꎬ ｂｕｔ ｔｈｅ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｗａｓ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ. Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｉｄ ｏｆ ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ
ＶｄＬｓ.１７ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅꎬ ｔｈｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ２５ ｓｉｎｇｌｅ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｌｏｗ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ
ｏｂｔａｉｎｅｄꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅꎻ ｌｏｗ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｍｕｔａｎｔｓꎻ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓꎻ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓꎻ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ
中图分类号: Ｓ４３２.４４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０３￣０２５８￣１２
３期 刘义杰ꎬ等:棉花黄萎病菌低致病力突变体的表型分析及致病相关基因克隆
棉花黄萎病(Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ Ｗｉｌｔ)是影响我国各大
产棉区棉花(Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ.)优质高产的首要
病害ꎬ主要病原菌是大丽轮枝菌(Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ
Ｋｌｅｂ.)[１]ꎮ 棉花黄萎病防治难度大和爆发成灾的主
要原因是致病机理不清ꎬ抗病育种滞后ꎬ品种抗性丧
失快ꎬ缺乏环境友好且防治效果好的杀菌剂[２]ꎮ
为了较好的控制一种植物病害ꎬ明确病原菌的
侵染过程和致病机理是必要的基础性工作ꎮ 目前ꎬ
棉花黄萎病侵染棉花的过程比较清楚ꎮ 土壤中的
微菌核或分生孢子受棉花根系分泌物的刺激ꎬ开始
萌发ꎬ产生的菌丝在寄主根表面定殖、穿过表皮、在
皮层中发生及在棉花体内扩展ꎬ最终导致症状的形
成[３ꎬ４]ꎮ 目前ꎬ借助 ＥＳＴ 文库、Ｔ￣ＤＮＡ 插入突变体
库和同源克隆的方法ꎬ少数大丽轮枝菌致病基因的
功能已经得到了验证ꎮ 如:Ｗａｎｇ 等[５]利用瞬时表
达系统对大丽轮枝菌菌丝的 ＥＳＴ 文库进行筛选ꎬ
得到了一个具有信号肽的致病分泌蛋白 ＶｄＮＥＰꎬ
通过诱导病程相关蛋白的表达而导致棉花萎蔫ꎻ通
过筛选棉花黄萎病菌突变体库得到的参与微菌核
和黑色素形成的致病基因(ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ￣ｒｉｃｈ ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎ)ＧＡＲＰ１[６]ꎻＭａｒｕｔｈａｃｈａｌａｍ 等[７]对 １８１ 个莴苣
黄萎病菌突变体进行致病测定ꎬ筛选得到四个低致
病力突变体ꎬ相应的致病基因分别是 ｅｎｄｏｇｌｕ￣
ｃａｎａｓｅ１ ( ＶｄＥｇ１ )、 ｈｙｄｒｏｘｙｌ￣ｍｅｔｈｙｌ ｇｌｕｔａｒｙｌ￣ＣｏＡ
ｓｙｎｔｈａｓｅ (ＶｄＨＭＧＳ)、ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ １
(ＶｄＭＦＳ１)和 ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ ￣ｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ｍａｎｎｏ￣
ｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ３(ＶｄＧＰＩＭ３)ꎮ 与大丽轮枝菌致病相
关ꎬ并且在细胞壁降解酶作用时参与表达的
ＶｄＳＮＦ１[８]ꎻ和ＭＡＰ激酶介导的信号转导途径密切
相关的致病相关基因 ＶＭＫ１ [９]ꎻ以及促进微菌核的
形成ꎬ编码胰蛋白酶的基因 ＶＴＰ１[１０]ꎮ 但是以上致
病基因多是分离自番茄、马铃薯、莴苣黄萎病菌ꎬ棉
花黄萎病菌相关研究并不多ꎬ只有少数几个ꎬ也就是
说ꎬ棉花黄萎病菌的分子致病机理研究比较滞后ꎮ
本研究以强致病力菌核型菌株 Ｖｄ０８０ 的 Ｔ￣
ＤＮＡ 突变体库为基础ꎬ随机选取突变体库中的
８００个转化子进行致病力测定ꎬ历经初筛和复筛两
轮筛选ꎬ对得到的低致病力突变体进行生物学性状
分析并克隆致病相关基因ꎬ为大丽轮枝菌分子致病
机理的研究提供候选基因ꎮ
１ 材料和方法
１.１ 材料
１.１.１ 棉花黄萎病菌菌株来源 棉花黄萎病菌强
致病力菌核型菌株 Ｖｄ０８０ꎬ本课题组于 ２００７ 年分
离自河北辛集重病田[１１]ꎬ经单孢纯化ꎬ保存于
－７８℃超低温冰箱ꎮ
以 Ｖｄ０８０为初始菌株构建了容量为 ３０００的棉
花黄萎病菌 Ｔ￣ＤＮＡ 插入突变体库[１２]ꎬ每个突变体
都经过单孢纯化ꎬ置于 ２０％甘油中超低温保存ꎮ
１.１.２ 培养基和克隆试剂盒 用于分离、活化培
养棉花黄萎病菌和生物学测定的培养基 ＰＤＡ(去
皮马铃薯 ２００ ｇ、葡萄糖 ２０ ｇ、琼脂 １２ ｇꎬ 加蒸馏水
定容至 １ Ｌ)ꎬ单孢纯化培养基 ＷＡ(琼脂 １２ ｇꎬ 蒸
馏水 １ Ｌ)ꎮ 用于液体培养收集菌丝和粗毒素 Ｃｚａ￣
ｐｅｋ培养基(ＮａＮＯ３ ２.００ ｇꎻ Ｋ２ＨＰＯ４ １.００ ｇꎻ ＫＣＩ
０.５０ ｇꎻ ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２ Ｏ ０. ５０ ｇꎻ ＦｅＳＯ４ ０. ０１ ｇꎻ
ｓｕｃｒｏｓｅ ３０.００ ｇꎻ 加蒸馏水定容至 １Ｌ)ꎮ 以上培养
基在使用之前均要加入 １００ μｇｍＬ￣１的硫酸链霉
素ꎬ以防止细菌污染ꎮ
Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ(Ｔａｋａｒａꎬ大连)试剂盒用于克
隆转化子 Ｔ￣ＤＮＡ 侧翼序列ꎬ全式金 ｐＥＡＳＹ￣Ｔ１ 克
隆试剂盒(全式金ꎬ北京)用于克隆 ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ 产
物和致病相关基因ꎮ Ｒｏｃｈｅ 公司的 ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａ￣
ｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ 是 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交试验中ꎬ
用来检测 Ｔ￣ＤＮＡ插入拷贝数的试剂盒ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 菌株的活化和培养 在 ＰＤＡ培养基上活化
野生型棉花黄萎病菌 Ｖｄ０８０ 和其不同的突变体ꎬ
２５℃恒温培养 ７ ｄꎮ 沿菌落边缘取 ５ ｍｍ直径的新
鲜菌丝块接种于查式培养基中ꎬ１５０ ｒｐｍꎬ２５℃ꎬ黑
暗震荡培养 ７ ｄꎬ４层纱布过滤ꎬ得菌丝和孢子悬浮
液ꎮ 在显微镜下借助血球计数板统计孢子数ꎬ用灭
菌水将孢子悬浮液调整终浓度为 １×１０７个ｍＬ￣１ꎬ
以备接种和生物学性状测定使用ꎮ 所得菌丝用于
棉花黄萎病菌菌株基因组 ＤＮＡ 提取ꎮ 所有用于
测定生物学性状的 ＰＤＡ 培养基均为同一批制备ꎬ
并保证培养条件完全一致ꎮ
１.２.２ 致病力测定 采用 Ｚｈｕ 等[１３]的蛭石沙土无
底纸钵定量接菌液法ꎬ选用感病陆地棉品种冀棉
１１作为寄主ꎬ在第一片真叶平展时接种ꎬ每钵接种
１５ ｍＬ孢子浓度为 １×１０７个ｍＬ￣１的孢子悬浮液ꎮ
将野生型棉花黄萎病菌菌株 Ｖｄ０８０作为对照ꎬ衡量
其 Ｔ￣ＤＮＡ插入突变体库中转化子的致病力ꎬ为了减
小不同批次试验之间的误差ꎬ本研究选用相对病情
指数评价转化子的致病力的变异能力ꎮ 即将 Ｖｄ０８０
的实际病情指数校正到 ５０.０ꎬ获得校正系数 Ｋꎬ为了
保证数据的准确性ꎬＫ值的范围应该在 ０.７５~ １.２５ꎬ
９５２
植物病理学报 ４５卷
从而校正突变体的病情指数[１４]ꎮ 计算公式如下:
Ｋ＝ ５０÷野生型 Ｖｄ０８０的实际病指
相对病情指数＝Ｋ×突变体的实际病情指数
１.２.３ 低致病力突变体的筛选 突变体致病力测
定进行了两轮筛选ꎬ初筛不设置重复ꎬ每个转化子
接种了 ２８~３０株感病品种冀棉 １１ 的棉苗ꎬ共筛选
了 ８００ 株 Ｖｄ０８０ 的 Ｔ￣ＤＮＡ 插入突变体ꎮ 选择致
病力明显降低的转化子进行复筛ꎬ每个菌株设置 ３
个重复ꎬ每个重复 ２８~３０株棉苗ꎮ
１.２.４ 低致病力突变体生物学性状测定
１)菌落形态观察和生长速率测定
以野生型菌株 Ｖｄ０８０ 为对照ꎬ在 ＰＤＡ 培养基
的中央滴 ５ μＬ浓度为 １×１０７个ｍＬ￣１的突变体孢
子悬浮液ꎬ每个菌株 ５ 个重复ꎬ２５℃恒温静置培养
１０ ｄꎬ记录菌落的生长形态ꎮ
并分别于 ５、７、９ 和 １１ ｄ 采用十字交叉法测定
菌落生长直径ꎬ计算生长速率ꎮ
２)产孢量和粗毒素含量测定
以野生型菌株 Ｖｄ０８０为对照ꎬ在 ４０ ｍＬ查式培
养基中滴 ５ μＬ突变体孢子悬浮液ꎬ２５℃ꎬ１５０ ｒｐｍ振
荡培养 ６ ｄ后ꎬ借助血球计数板测定其产孢量ꎮ
之后继续振荡培养 １９ ｄ 后ꎬ取菌液 １３ ０００
ｒｐｍꎬ离心 ３０ ｍｉｎꎮ 取上清ꎬ依据考马斯亮蓝 Ｇ￣２５０
法ꎬ以牛血清蛋白为标准蛋白作标准曲线ꎬ用酶标
仪(Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴꎬ美国 ＢｉｏＴｅｋ 公司)测定黄萎病菌
毒素的蛋白浓度作为粗毒素含量ꎮ
１.２.５ 低致病力转化子的分子验证
１)潮霉素抗性标记的 ＰＣＲ验证
采用 ＣＴＡＢ法[１５]提取棉花黄萎病菌低致病力
转化子基因组 ＤＮＡꎬ根据 Ｔ￣ＤＮＡ区段中的潮霉素
抗性基因(ｈｐｈ)８９５ｂｐ的序列设计高特异验证引物
Ｈｙｇ￣Ｆ / Ｈｙｇ￣Ｒ (Ｈｙｇ￣Ｆ: ５′￣ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣ￣
ＣＴＧＣＡＧＧＴＣ￣３′ꎻ Ｈｙｇ￣Ｒ: ５′￣ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣ￣
ＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＴＴＡＣ￣３′)(上海生工代为
合成)ꎬ通过 ＰＣＲ扩增以鉴定低致病力转化子是否
为阳性ꎮ ＰＣＲ 反应程序为: ９５℃预变性 ２ ｍｉｎꎬ
９４℃ꎬ １ ｍｉｎꎻ ６０℃ꎬ １ ｍｉｎꎻ ７２℃ꎬ １ ｍｉｎ共 ３０个循
环ꎬ之后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
２)Ｔ￣ＤＮＡ插入拷贝数检测
依据 Ｔ￣ＤＮＡ 上大小约为 ５００ ｂｐ 的潮霉素片
段序列设计 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交探针引物 ＨＹｇＰ￣Ｆ /
ＨｙｇＰ￣Ｒ ( ５′￣ＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＣ￣
ＣＡ￣３′ / ５′￣ＴＴＴＧＴＧＴＡＣＧＣＣＣＧＡＣＡＧＴＣＣＣＧＧＣ￣
３′)ꎮ Ｖｄ０８０基因组或低致病力突变体的基因组
ＤＮＡ ５ ｎｇꎬＮＥＢ ｂｕｆｆｅｒ １０ μＬꎬＢａｍＨⅠ３ μＬꎬ补水
至 １００ μＬꎮ ３７℃消化 ５ ｈꎬ之后ꎬ６５℃水浴 １０ ｍｉｎꎬ
终止酶切反应ꎮ 探针制备、ＤＮＡ 变性、转移、杂交
及显色方法按照试剂盒说明书进行ꎮ
１.２.６ 低致病力突变体的 Ｔ￣ＤＮＡ 插入侧翼序列
的获得和分析 根据双元载体 ｐＣＴＨｙｇ(建 ＡＴＭＴ
库所用)的 Ｔ￣ＤＮＡ 左臂(ＬＢ)和右臂(ＲＢ)内侧
ＤＮＡ序列ꎬ利用 ＮＣＢＩ中的 Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｌａｓｔ 在线工具
分别设计 ３′和 ５′步移引物 Ｒ￣ＳＰ１、Ｒ￣ＳＰ２、Ｒ￣ＳＰ３和
Ｌ￣ＳＰ１、Ｌ￣ＳＰ２和 Ｌ￣ＳＰ３ꎬＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ 试剂盒提
供的简并引物 ＡＰ１、ＡＰ２、ＡＰ３ 和 ＡＰ４ꎬ步移引物与
随机引物成对作为模板扩增 Ｔ￣ＤＮＡ 左右臂侧翼
序列ꎮ 所用引物序列参见表 １ꎬ所用反应程序及反
应体系均按照 Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ 试剂盒的方法进
行ꎮ 反应结束后ꎬ取上述第一轮、第二轮、第三轮的
反应产物于 １％的琼脂糖凝胶电泳上检测ꎮ 分别
回收 ３′端和 ５′端第三轮 ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ特异产物ꎬ克隆
测序ꎮ 测序结果先与 Ｔ￣ＤＮＡ 进行两两比对ꎬ如果
有重复序列ꎬ就和美国 ＢＲＯＡＤ 研究所在线共享的
大丽轮枝菌 ＶｄＬｓ. １７ 的基因组数据库 ( ｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ. ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ. ｏｒｇ / ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ / ｇｅｎｏｍｅ / ｖｅｒｔｉ￣
ｃｉｌｌｉｕｍ＿ｄａｈｌｉａｅ / ＭｕｌｔｉＤｏｗｎｌｏａｄｓ. ｈｔｍｌ)进行比对分
析ꎬ并提取致病相关基因的基本信息ꎮ
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′)
Ｒ￣ＳＰ１ ＡＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＴＴＣＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧ
Ｒ￣ＳＰ２ ＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣ
Ｒ￣ＳＰ３ ＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＧＧＣ
Ｌ￣ＳＰ１ ＡＴＴＣＣＧＴＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣ
Ｌ￣ＳＰ２ ＣＣＧＴＡＡＣＡＣＣＣＡＡＴＡＣＧＣＣＧＧＣＣＧＡ
Ｌ￣ＳＰ３ ＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣ
１.２.７ 致病相关基因的克隆 根据 ＶｄＬｓ.１７ 中相
应的参考序列ꎬ分别设计致病相关基因的高特异引
物(表 ２)ꎬ从强致病力、菌核型菌株 Ｖｄ０８０ 基因组
中扩增致病相关基因ꎮ 扩增体系为:２ ×Ｍｉｘ １０
μＬꎬ上下游引物各 １ μＬꎬ模板 １ μＬꎬ补水至 ２０
μＬꎻ反应条件为: ９４℃ 预变性 ２ ｍｉｎꎻ ９４℃ 变性
１ ｍｉｎ ꎬ６０℃退火 １ ｍｉｎ ꎬ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ共 ３０ 个
循环ꎻ最后 ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
１.２. ８ 数据分析 采用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ
２００７ 及 ＳＰＳＳ１６.０ 软件分析实验数据ꎮ 分析各低
致病力转化子的生长速率、产孢量、粗毒素产量与
野生型 Ｖｄ０８０相应指标的差异显著性ꎮ
０６２
３期 刘义杰ꎬ等:棉花黄萎病菌低致病力突变体的表型分析及致病相关基因克隆
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ
Ｍｕｔａｎｔ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ (５′￣３′) ∗ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ / ％
Ｔ３８ / Ｔ１０７５ ＶＤＡＧ＿００９４４.１
Ｆ: ＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＡＧＣＡ
Ｒ: ＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＴＡＴＴ
９９.０
Ｔ１０９ ＶＤＡＧ＿０２２８２.１
Ｆ: ＡＴＧＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＡＣＡＣＴＧＴ
Ｒ:ＴＴＡＣＧＴＡＣＣＴＣＣＡＧＴＡＴＡＧＡ
９９.４
Ｔ１３７ ＶＤＡＧ＿０６５７９.１
Ｆ: ＡＴＧＧＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧ
Ｒ:ＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧＴＡＣＧ
９９.８
Ｔ２８６ / Ｔ１０４４ ＶＤＡＧ＿０７０５２.１
Ｆ: ＡＴＧＧＣＧＡＴＧＣＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡ
Ｒ: ＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡ
９９.８
Ｔ９５２ ＶＤＡＧ＿００９０４.１
Ｆ: ＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＧＣ
Ｒ:ＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＣＧ
１００.０
Ｔ９８８ / Ｔ１２３１ ＶＤＡＧ＿０６０９２.１
Ｆ: ＡＴＧＡＡＧＡＧＣＧＣＴＣＴＴＣＧＣＴＧ
Ｒ:ＡＧＣＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧ
９９.７
Ｔ９８９ ＶＤＡＧ＿０８３３４.１
Ｆ:ＡＴＧＡＣＧＧＴＣＡＣＧＡＧＣＡＡＧＣＡ
Ｒ: ＴＣＡＴＧＣＧＴＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＣ
９９.６
Ｔ１０２３ ＶＤＡＧ＿００４６７.１
Ｆ: ＡＴＧＣＣＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＣＣＡ
Ｒ:ＴＣＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＴＴＣＴＴＴＣＡ
９９.７
Ｔ１０２４ ＶＤＡＧ＿００６８３.１
Ｆ: ＡＴＧＴＡＣＣＣＧＣＧＡＣＴＴＡＣＡＧＧ
Ｒ: ＡＡＡＴＴＧＧＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴ
１００.０
Ｔ１０２５ ＶＤＡＧ＿０５８５６.１
Ｆ: ＡＴＧＧＣＴＡＡＣＧＡＣＣＧＣＡＧＣＧＴ
Ｒ: ＴＴＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡ
１００.０
Ｔ１０２７ ＶＤＡＧ＿００７５２.１
Ｆ: ＡＴＧＡＡＧＡＣＴＧＣＧＡＴＴＣＴＣＡＧ
Ｒ:ＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧＴＡＣＣ
９９.９
Ｔ１０５３ ＶＤＡＧ＿００６０７.１
Ｆ: ＡＴＧＧＧＡＣＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＴＡ
Ｒ: ＴＣＡＣＧＣＧＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣＣＣ
９９.９
Ｔ１０５４ ＶＤＡＧ＿０５９３９.１
Ｆ: ＡＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡＴＴＣＴＴＣＣＧＡ
Ｒ: ＴＣＡＧＡＧＡＧＣＣＧＡＡＣＣＡＴＣＡＴ
９９.６
Ｔ１０５８ ＶＤＡＧ＿０２５４５.１
Ｆ: ＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧ
Ｒ: ＣＴＡＴＡＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧ
９９.９
Ｔ１０７８ ＶＤＡＧ＿０４６７８.１
Ｆ: ＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＣＧＡＡＣＴＣＧＡ
Ｒ: ＴＴＡＣＡＣＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴ
９９.２
Ｔ１０９３ ＶＤＡＧ＿０９７８３.１
Ｆ: ＡＴＧＡＴＴＧＡＧＡＣＣＡＣＡＣＧＣＡＣ
Ｒ: ＣＴＡＣＡＣＡＴＣＣＡＴＣＣＣＧＴＡＣＡ
９９.０
Ｔ１１４２ ＶＤＡＧ＿０８８６６.１
Ｆ: ＡＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＧ
Ｒ: ＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＴＣＧ
９９.７
Ｔ１１４５ ＶＤＡＧ＿０７７３１.１
Ｆ: ＡＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡ
Ｒ:ＴＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＣＧＣＣＡＴ
９９.９
Ｔ１１５８ ＶＤＡＧ＿０３１４８.１
Ｆ: ＡＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＣ
Ｒ: ＴＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＣＡＴ
９９.９
Ｔ１２１１ ＶＤＡＧ＿０３５４１.１
Ｆ: ＡＴＧＴＣＴＣＧＣＡＡＴＡＴＴＣＧＴＣＡ
Ｒ: ＴＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＡＴＴＧＡＴＴＣＡ
１００.０
Ｔ１２４１ ＶＤＡＧ＿０９９４２.１
Ｆ: ＡＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡ
Ｒ: ＴＴＡＡＡＣＧＡＴＴＴＴＧＧＡＣＧＣＣＣ
１００.０
Ｔ１２６０ ＶＤＡＧ＿０３９４７.１
Ｆ: ＡＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＡＴＴＣ
Ｒ:ＴＴＡＧＴＧＣＴＴＣＧＣＡＧＴＧＡＣＧＡ
９９.８
Ｎｏｔｅ:∗ Ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｓ ６０℃.
１６２
植物病理学报 ４５卷
２ 结果
２.１ 低致病力突变体的筛选
从强致病力棉花黄萎病菌菌株 Ｖｄ０８０ 突变体
库中随机挑选了 ８００个突变体进行致病力测定ꎬ获
得了 ５４株致病力明显低于野生型的突变体ꎬ相对
病情指数均在 ２０.０以下(数据未显示)ꎮ 分别设置
重复对此 ５４ 株突变体进行复筛ꎬ结果表明ꎬ有 ３１
株突变体的病情指数极显著低于野生型 ( Ｐ <
０.０１)ꎬ平均病情指数均小于 １５.０(表 ３)ꎮ
Ｔａｂｌｅ ３ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｎｔｓａ
Ｃｏｄｅ
Ｄｉｓｅａｓｅ
ｉｎｄｅｘ
Ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ
/ ｍｍｄ－１
Ｓｐｏｒｅ ｙｉｅｌｄ
/ １０６ｍＬ－１
Ｃｒｕｄｅ ｔｏｘｉｎ
/ ｍｇＬ－１
Ｃｏｌｏｎｙ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｂ
Ｖｄ０８０ ５０.０ ４.５０±０.１０ ４２.３３±４.６３ ５８.７３±１.６５ Ｓ
Ｔ３８ ７.８∗∗ ４.３８±０.０８ ３８.４７±１.９５ １５.３６±４.６１∗∗ Ｍ
Ｔ１０９ ５.４∗∗ ４.５６±０.２０ ２０.０８±０.６８∗∗ １０６.２６±０.４８∗∗ Ｍ
Ｔ１３７ １０.１∗∗ ４.４３±０.１９ ２２.１１±１.１３∗∗ ４２.６５±１.７３∗∗ Ｍ
Ｔ２８６ ３.６∗∗ ２.９０±０.１９∗∗ ０.５３±０.０５∗∗ ４１.１３±０.８３∗∗ ＹＭ
Ｔ９５２ １０.６∗∗ ２.７０±０.４６∗∗ ２４.６１±１.５５∗∗ ４３.６７±５.６０∗∗ Ｓ
Ｔ９８８ ２.５∗∗ ４.１０±０.１５∗∗ ４４.０３±２.３７ ９９.３９±２.８３∗∗ Ｍ
Ｔ９８９ ８.７∗∗ ４.１３±０.１４∗ ９０.２８±２.１０∗∗ ６２.７９±９.０８ Ｍ
Ｔ１０２３ ８.６∗∗ ４.２９±０.０８ ３５.７５±０.８７∗∗ ３６.０２±３.７７∗∗ ＹＭ
Ｔ１０２４ ４.９∗∗ ３.６３±０.３０∗∗ １３.８９±０.７５∗∗ ８１.７５±４.１８∗∗ Ｓ
Ｔ１０２５ ７.８∗∗ ４.８０±０.１４ １９.８１±１.７５∗∗ ７０.８５±３.９４∗∗ Ｍ
Ｔ１０２７ ８.７∗∗ ４.５７±０.１９ １３.９１±０.３８∗∗ ２２.４９±０.８７∗∗ Ｍ
Ｔ１０４４ ９.２∗∗ ３.４０±０.８１∗∗ １３.５２±０.２３∗∗ ８８.６９±８.９７∗∗ ＷＭ
Ｔ１０５３ ９.２∗∗ ４.５４±０.０８ ５０.９２±２.７９∗∗ ９４.５７±２.７５∗∗ Ｓ
Ｔ１０５４ ５.６∗∗ ４.４７±０.０７ ３０.６１±１.０３∗∗ ９４.６０±２.５７∗∗ Ｍ
Ｔ１０５８ １３.７∗∗ ４.９６±０.１６∗∗ ２３.４２±０.２２∗∗ ２８.５７±３.１０∗∗ ＹＭ
Ｔ１０７５ ５.６∗∗ ４.２０±０.０７ ３８.３３±３.６３ ５８.８３±２.６０ Ｍ
Ｔ１０７８ ５.２∗∗ ４.３０±０.１４ １７.０８±０.３０∗∗ ４７.０３±３.５３∗∗ Ｍ
Ｔ１０９３ ３.８∗∗ ４.２８±０.２０ １.８１±０.３２∗∗ １６.５１±１.２２∗∗ ＷＭ
Ｔ１１４２ １２.５∗∗ ４.２０±０.１４ ４９.１７±１.１０∗∗ ９８.９７±３.１８∗∗ Ｍ
Ｔ１１４５ １３.１∗∗ ４.２３±０.１９ ３３.８９±０.８６∗∗ ９２.７９±３.０８∗∗ Ｍ
Ｔ１１５８ １４.０∗∗ ３.７５±０.１０∗∗ ３７.１４±１.１４∗ ６０.９４±６.２８ Ｓ
Ｔ１２１１ １１.５∗∗ ３.００±０.３８∗∗ ２７.６９±０.７０∗∗ ５７.０３±１１.２４ Ｓ
Ｔ１２３１ １１.２∗∗ ２.６１±０.１４∗∗ １３.６１±１.１７∗∗ ５５.８８±４.０７ Ｓ
Ｔ１２４１ ９.８∗∗ ２.８３±０.１４∗∗ ９０.８３±１.５６∗∗ １２.２８±５.６０∗∗ Ｓ
Ｔ１２６０ １３.８∗∗ ３.７７±０.４３∗∗ ３７.８６±１.８６ ３９.３５±４.４０∗∗ Ｓ
Ｔ５８ ６.７∗∗ ４.５７±０.１５ １９.４７±１.２３ ９５.７８±０.６４ Ｍ
Ｔ１９７ １２.５∗∗ ４.３７±０.１４ ３７.５０±１.３７ ９６.６８±１.０７ Ｍ
Ｔ１０１４ ９.３∗∗ ２.７６±０.４９ ２６.８７±３.７８ ４１.３２±５.３１ Ｓ
Ｔ１０３９ ９.１∗∗ ４.５７±０.１９ ３０.６１±０.７５ ２２.０７±３.３７ Ｍ
Ｔ１１１３ １１.４∗∗ ４.１３±０.１４ ４６.３９±１.９２ ９３.４２±６.９７ Ｍ
Ｔ１２５１ １０.８∗∗ ２.０２±０.０８ ６９.１±０.７５ ２２.６±４.９２ Ｓ
Ｎｏｔｅ:ａＣｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｖｄ０８０ꎬｄａｔａ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｐ<０.０１ (∗∗) ａｎｄ Ｐ <０.０５ (∗) .
ｂ Ｓ＝Ｍｉｃｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉａꎬ ＹＭ＝Ｙｅｌｌｏｗ ｍｙｃｅｌｉａꎬ Ｍ＝Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅꎬ ＷＭ＝Ｗｈｉｔｅ ｍｙｃｅｌｉａ.
２６２
３期 刘义杰ꎬ等:棉花黄萎病菌低致病力突变体的表型分析及致病相关基因克隆
２.２ 低致病力突变体的分子检测
２.２.１ 阳性转化子的确定 用潮霉素特异引物
Ｈｙｇ￣Ｆ / Ｈｙｇ￣Ｒ 扩增这 ３１ 株筛选得到的低致病力
突变体的基因组 ＤＮＡꎬ均可以获得 ８９５ ｂｐ 的特异
性条带ꎮ 表明这 ３１株突变体均为 Ｔ￣ＤＮＡ 插入阳
性转化子ꎬ致病力和生理性状变异确实由 Ｔ￣ＤＮＡ
的插入所致(图 １)ꎮ
２.２.２ Ｔ￣ＤＮＡ 插入拷贝数检测 以 Ｔ￣ＤＮＡ 上的
潮霉素区段做探针的 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ结果表明ꎬ探针
在不同低致病力转化子基因组上杂交信号数量不
同ꎬ除了 Ｔ￣ＤＮＡ 在 ５ 个突变体 Ｔ５８、Ｔ１９７、Ｔ１０３９、
Ｔ１１１３、Ｔ１２５１中有两个插入位点ꎬ在 Ｔ１０１４有 ３个
拷贝外ꎬ其余 ２５个突变体均只有 １个杂交信号(图
２)ꎮ 因此ꎬ这 ２５株棉花黄萎病菌低致病力转化子
为 Ｔ￣ＤＮＡ单拷贝插入ꎬ生物学性状和致病力降低
都是由于单个 Ｔ￣ＤＮＡ 插入导致的ꎬ可以通过获得
各自的侧翼序列来调取致病相关基因ꎮ
２.３ 低致病力突变体的生物学特性
２.３. １ 菌落形态观察 和菌核型野生型菌株
Ｖｄ０８０相比ꎬ２５ 株单拷贝插入低致病力突变体在
ＰＤＡ上的培养形态丰富多样ꎬ除了与野生型生长
形态一致的菌核型以外ꎬ还有黄色菌丝型、白色菌
丝型和中间型(图 ３)ꎮ 其中菌核型(图 ３￣Ｂ)的有 ８
株ꎬ占所分析的 ３２.０％ꎻ黄色菌丝型(图 ３￣Ｃ)的有 ３
株ꎬ菌丝为淡黄色ꎬ有致密(１ 株)和疏松(２ 株)之
分ꎬ不产黑色素和微菌核ꎬ占所分析的 １２.０％ꎬ白色
菌丝型(图 ３￣Ｄ)的 ２ 株ꎬ菌丝白色ꎬ不产黑色素和
微菌核ꎬ占 ８.０％ꎻ中间型(图 ３￣Ｅ)的 １２ 株ꎬ表现为
菌核和黑色素的产量和深浅不同ꎬ占 ４８.０％ꎮ
Ｆｉｇ. １ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ
Ｍ: ＤＬ２０００ ＤＮＡ ｍａｋｅｒꎻ １￣２５: Ｍｕｔａｎｔｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍｌｙꎻ ２６: Ｖｄ０８０.
Ｆｉｇ. ２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ
Ｍ: １ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒꎻ １: Ｔ３８ꎻ ２:Ｔ１０９ꎻ ３:Ｔ２８６ꎻ ４:Ｔ９８９ꎻ ５:Ｔ１０２４ꎻ
６:Ｔ１０２７ꎻ ７:Ｔ１０５３ꎻ ８:Ｔ１０７８ꎻ ９:Ｔ１０９３ꎻ １０:Ｔ１２４１ꎻ １１:Ｔ１２６０.
３６２
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ３ Ｃｏｌｏｎｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｌｏｗ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｎ ＰＤＡ
Ａ: Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎꎻ Ｂ: Ｍｉｃｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉａꎻ Ｃ: Ｙｅｌｌｏｗ ｍｙｃｅｌｉａꎻ Ｄ: Ｗｈｉｔｅ ｍｙｃｅｌｉａꎻ Ｅ: Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ.
２.３.２ 生长速率测定 通过连续监测自第 ５ ｄ至第
１１ ｄ的生长速率ꎬ多数单拷贝插入低致病力突变体
的生长速率较野生型都发生了不同程度的改变(表
３)ꎮ 野生型菌株 Ｖｄ０８０ 的生长速率为 ( ４. ５０ ±
０.１０) ｍｍｄ￣１ꎻ在所测定的 ２５ 株突变体当中ꎬ
Ｔ１２３１的生长速率最低ꎬ仅为(２.６１±０.１４) ｍｍｄ￣１ꎻ
最高的为 Ｔ１０５８ꎬ可达到(４.９６±０.１６) ｍｍｄ￣１ꎮ 与
Ｖｄ０８０相比ꎬ生长速率显著降低的突变体有 １１ 株
(Ｐ<０.０５)ꎬ极显著降低的有 １０ 株(Ｐ<０.０１)ꎮ 另有
Ｔ１０５８生长速率极显著升高ꎬ较初始菌株增加了
１０.０％ꎮ 其他 ５２.０％突变体的生长速率与野生型相
比没有显著差异ꎮ
２.３.３ 产孢量测定 野生型强毒力菌株 Ｖｄ０８０ 在
震荡 培 养 ６ ｄ 时 的 产 孢 量 为 ４２.３３×１０６ 个
孢子ｍＬ￣１(表 ３)ꎬ与其相比ꎬ有 ８４.０％的单拷贝
插入低致病力突变体(共 ２１ 株)产孢量都发生了
显著变化ꎮ 其中ꎬ４株突变体的孢子产量极显著的
增加ꎻ１７ 株显著降低ꎬ１６ 株极显著减少ꎬ如 Ｔ２８６
的为 ０.５３×１０６个孢子ｍＬ￣１ꎬ与野生型相比降低了
９８.７５％ꎻ其他 ４株突变体的产孢量接近于野生型ꎮ
２.３.４ 低致病力突变体的粗毒素测定 对 ２５株单
拷贝插入低致病力突变体与野生型的粗毒素测定结
果表明ꎬ野生型 Ｖｄ０８０ 分泌的粗毒素质量浓度为
５８.７３ ｍｇＬ￣１ꎬ５株突变体的粗毒素含量无显著变
化ꎬ占总数的 ２０.０％ꎻ９株的极显著升高ꎬ占所分析的
３６.０％ꎻ１１株的极显著下降ꎬ占总数的 ４４.０％(表 ３)ꎮ
２.４ 低致病力突变体的 Ｔ￣ＤＮＡ插入侧翼序列分析
借助 ＴＡＩＬ￣ＰＣＲ 技术ꎬ并和 ＶｄＬｓ.１７ 的基因组
数据库进行比对ꎬ进一步获得了 ２５株单拷贝插入低
致病力突变体 Ｔ￣ＤＮＡ插入侧翼序列基因的相关信
息(表 ４)ꎮ 通过对所获得的 ２５ 个侧翼序列之间相
互比对ꎬ发现有 ３ 对具有同源性ꎬ分别为 Ｔ３８ 和
Ｔ１０７５ꎬＴ２８６ 和 Ｔ１０４４ꎬＴ９８８ 和 Ｔ１２３１ꎮ 其中除去
Ｔ２８６和 Ｔ１０４４插入在同一基因不同位点外ꎬ其他两
对所插入的基因及位点均一致ꎮ 同时 Ｔ￣ＤＮＡ在大
丽轮枝菌的 ８条染色体中均有所分布ꎬ还有定位在
尚未组装到染色体上的 ｃｏｎｔｉｇ(图 ４)ꎬ所以 Ｔ￣ＤＮＡ
是随机插入的ꎬ偏好性不强ꎮ 另外ꎬＴ￣ＤＮＡ 插入位
点也不尽相同(图 ５)ꎬ有 ５ 个是在距下游基因不足
５００ ｂｐ的位置ꎬ可能影响下游基因的表达ꎻ１７ 个插
入在外显子区ꎻ１个在内含子区ꎬ２个在终止子区ꎮ
２.５ 致病相关基因克隆与分析
利用所设计的特异引物(表 ２)从棉花黄萎病菌
野生型菌株 Ｖｄ０８０中克隆得到了相应的基因序列ꎮ
测序比对结果显示ꎬ棉花黄萎病菌中的致病相关基
因与参考基因组莴苣黄萎病菌菌株 ＶｄＬｓ.１７中相应
基因的相似度很高ꎬ都在 ９９.０％以上ꎮ 而且基因
ＶＤＡＧ＿００９０４.１ꎬＶＤＡＧ＿００６８３.１ꎬＶＤＡＧ＿０５８５６.１ꎬ
ＶＤＡＧ＿０３５４１.１和 ＶＤＡＧ＿０９９４２.１与对应基因完全
相同ꎮ 其他基因也只是在个别碱基上有突变和缺
失ꎬ或者微卫星重复单元的重复次数不等(表 ２)ꎮ
和 ＶｄＬｓ.１７的参考基因组进行功能比对ꎬ得知
在 ２２个棉花黄萎病菌致病相关基因中ꎬ根据它们
编码蛋白的功能不同ꎬ主要分为五类ꎮ 第一类是编
码植物细胞壁降解酶活性的外切葡聚糖酶(Ｅｘｏ￣
ｇｌｕｃａｎａｓｅ)ꎻ第二类为与生长和细胞周期功能相关
的基因ꎬ包括 Ｇ２ / ｍｉｔｏｔｉｃ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｃｌｉｎ￣３、Ｄｅｖｅｌｏｐ￣
ｍｅｎｔａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｆｌｂＡ、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＹＨＭ２ 和 Ｓｅｒｉｎｅ / ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ￣ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉ￣
ｎａｓｅ ＣＬＡ４ꎻ第三类是编码细胞功能代谢相关的基
因ꎬＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ 和
ＦＧ￣ＧＡＰ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ第四类
基因主要编码重要调控因子ꎬ如 Ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｍｅｄｉａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＹＣ８ 和 Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ
４６２
３期 刘义杰ꎬ等:棉花黄萎病菌低致病力突变体的表型分析及致病相关基因克隆
ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ第五类基因为编码功能未知的蛋 白ꎬ并包括编码拥有保守基序的假定蛋白(表 ４)ꎮ
Ｔａｂｌｅ ４ Ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｕｔａｎｔｓ
Ｍｕｔａｎｔ
Ｌｅｎｇｔｈ
/ ｎｔ
Ｃｈｏｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ
Ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ Ｎｏ. / ａａ
Ｔ３８ / Ｔ１０７５ １ ２００ Ⅰ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿００９４４.１ Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ３９９
Ｔ１０９ ４７７ Ⅶ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ＶＤＡＧ＿０２２８２.１ Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １００
Ｔ１３７ １ ９３０ Ⅷ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅｇｉｏｎ ＶＤＡＧ＿０６５７９.１ Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ５４６
Ｔ２８６ ３ ２０１ Ⅴ １ｓｔ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０７０５２.１
Ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｍｅｄｉａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＹＣ８
８９２
Ｔ９５２ ２ ２３９ Ⅰ １ｓｔ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿００９０４.１ Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ４６４
Ｔ９８８ / Ｔ１２３１ ２ ３３８ Ⅷ ２ｎｄ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０６０９２.１ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ７１０
Ｔ９８９ ２ ２４１
Ｕｎｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ
Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ
３ｒｄ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０８３３４.１ Ｇ２ / ｍｉｔｏｔｉｃ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｃｌｉｎ￣３ ７０４
Ｔ１０２３ １ １５２ Ⅱ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅｇｉｏｎ ＶＤＡＧ＿００４６７.１ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ３８３
Ｔ１０２４ ３ ８６３ Ⅱ ４ｔｈ ｉｎｔｒｏｎ ＶＤＡＧ＿００６８３.１ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｆｌｂＡ ７５４
Ｔ１０２５ ２ ６９５ Ⅳ １ｓｔ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０５８５６.１
Ｓｅｒｉｎｅ / ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ￣ｐｒｏｔｅｉｎ
ｋｉｎａｓｅ ＣＬＡ４
８４８
Ｔ１０２７ １ ６０２ Ⅱ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿００７５２.１ Ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ５３３
Ｔ１０４４ ３ ２０１ Ⅴ ７ｔｈ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０７０５２.１
Ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｍｅｄｉａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＹＣ８
８９２
Ｔ１０５３ ２ ０５３ Ⅱ ２ｎｄ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿００６０７.１
Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ
ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ
６４８
Ｔ１０５４ ２ ０１１ Ⅳ ３ｒｄ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０５９３９.１ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ６３３
Ｔ１０５８ ８２０ Ⅲ ２ｎｄ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０２５４５.１ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ２３６
Ｔ１０７８ １ ７１６ Ⅲ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ＶＤＡＧ＿０４６７８.１
Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ
ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ
５２５
Ｔ１０９３ ４ ９６４ Ⅲ ２ｎｄ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０９７８３.１ Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １２５５
Ｔ１１４２ ４ ４５３ Ⅴ １ｓｔ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０８８６６.１
ＦＧ￣ＧＡＰ ｒｅｐｅａｔ
ｄｏｍａｉｎ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
１１５８
Ｔ１１４５ １ ７４６ Ⅴ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０７７３１.１
Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣ｐｒｏｔｅｉｎ
ｌｉｇａｓｅ ＮＲＤＰ１
５８１
Ｔ１１５８ １３４７ Ⅵ ２ｎｄ ｅｘｏｎ ＶＤＡＧ＿０３１４８.１ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ４１８
Ｔ１２１１ １ ８０５ Ⅵ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ＶＤＡＧ＿０３５４１.１ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ５８１
Ｔ１２４１ ７６２ Ⅰ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ＶＤＡＧ＿０９９４２.１ Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １０６
Ｔ１２６０ １ ３１２ Ⅲ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ＶＤＡＧ＿０３９４７.１
Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ ＹＨＭ２
３１７
５６２
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ４ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ
Ｎｏｔｅ:ＵＳꎬ Ｕｎｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ.
Ｆｉｇ. ５ Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅｓ
３ 讨论
棉花黄萎病是一种土传病害ꎬ休眠体为微菌
核ꎬ其抗逆性强ꎬ在没有寄主存在的情况下仍然可
以存活 １０ 年之久ꎬ是完成再侵染的重要载体[１６]ꎮ
Ｔｉａｎ[１７]曾报道ꎬ山西棉花黄萎病菌的致病力与微
菌核及黑色素的产生存在正相关ꎮ Ｘｕ 等[１８]的致
病性研究结果也表明ꎬ产微菌核的突变体比无微菌
核的致病性要高ꎮ 本研究从棉花黄萎病菌菌核型
强致病力菌株 Ｖｄ０８０的 Ｔ￣ＤＮＡ 突变体库中ꎬ筛选
得到的 ２５个低致病力突变体ꎬ有 ２０.０％产生了明
显的形态变异ꎬ成为菌丝型ꎬ不产微菌核和黑色素ꎮ
但仍然有 ３２.０％的突变体培养性状和野生型一致ꎬ
为菌核型ꎬ但是致病力却显著降低ꎮ 我们的研究结
果显示ꎬ除了控制微菌核和黑色素产生的基因以
外ꎬ还有其他的致病相关基因在黄萎病菌导致棉花
感病过程中同样起着十分重要的作用ꎮ 生物学性
状研究表明ꎬ除了培养性状ꎬ多数低致病力突变体
的生长速率、产孢量和粗毒素产量的变化显著ꎮ 因
此ꎬ棉花黄萎病菌侵染棉花的分子机制十分复杂ꎬ
调控网络精细ꎬ不可以简单的将致病因子和某些生
理性状直接联系在一起ꎮ
大丽轮枝菌 ＶＤＬｓ.１７ 的全基因组测序和注释
信息的公开[１９]ꎬ为基因克隆和功能研究提供了良
好平台ꎮ 利用低致病力突变体中 Ｔ￣ＤＮＡ 插入位
点侧翼序列和 ＶＤＬｓ.１７ 的基因组进行比对ꎬ锚定
插入位点并获取相关基因详细信息ꎬ免去了多次步
移获取基因全长和上下游序列的过程ꎬ可以快速
构建互补和敲除载体ꎬ对致病相关基因进行功能
分析ꎮ
通过对本研究中的 ２５株单拷贝插入低致病力
转化子分析ꎬ克隆得到了 ２２ 个致病相关基因ꎮ 其
６６２
３期 刘义杰ꎬ等:棉花黄萎病菌低致病力突变体的表型分析及致病相关基因克隆
中一些致病相关基因已经在其他真菌或细菌中有
所研究ꎮ Ｔ１０２４ 的侧翼序列所在的发育调节器
ｆｌｂＡ(ＶＤＡＧ＿００６８３.１)基因ꎬ在尖孢镰刀菌[２０]和构
巢曲霉[２１]的有丝分裂过程中起重要作用ꎮ ＹＨＭ２
线粒体 ＤＮＡ复制的蛋白质(ＶＤＡＧ＿０３９４７.１)是一
种膜结合的 ＤＮＡ 结合蛋白ꎮ 破坏 ＹＨＭ２ 基因后ꎬ
在有不可发酵的碳源如甘油和乙醇存在时ꎬ酿酒酵
母表现出生长缺陷ꎬ而且在有 ２ꎬ３ꎬ５￣氯化三苯基四
氮唑时ꎬ影响细胞的呼吸作用ꎮ Ｙｈｍ２ 可能在线粒
体内膜有关的线粒体 ＤＮＡ 的复制和种族隔离中
作为一个调控蛋白[２２]ꎮ 磷脂酰丝氨酸脱羧酶酶原
(ＶＤＡＧ＿０４６７８.１)是磷脂酰丝氨酸脱羧酶的前体
物质ꎬ而该酶在疟原虫中控制磷脂代谢[２３]ꎬ同时大
肠杆菌中该酶是将丙酮酸组作为辅助因子的[２４]ꎮ
Ｅ３泛素连接酶 ＮＲＤＰ１(ＶＤＡＧ＿０７７３１.１)在免疫系
统中起重要作用ꎬ它不仅是一个调控蛋白ꎬ同时也
能在不同方面调控 ＴＬＲ 反应应答[２５]ꎮ 磷酸甘油
酸酯变位酶家族蛋白(ＶＤＡＧ＿００６０７.１)在细菌和
真核生物中主要有两种类型ꎬ一种依赖于辅因子ꎬ
一种不依赖辅因子ꎮ 而在古细菌中ꎬ该家族的蛋白
不属于这两种类群的任何一种ꎬ它是一种新家族的
蛋白ꎬ但是在大肠杆菌中表达产生的蛋白是具有功
能的不依赖于辅因子的磷酸甘油酸酯变位酶家族
蛋白[２６]ꎮ 外切葡聚糖酶(ＶＤＡＧ＿００７５２.１)的功能
是将纤维素降解ꎬ从而能使真菌进入植物组织ꎬ造
成植物的病害ꎮ 目前ꎬ该酶已经在多种真菌及细菌
中做了研究[２７ꎬ２８]ꎮ
同时ꎬ有一对突变体(Ｔ２８６ / Ｔ１０４４)ꎬＴ￣ＤＮＡ
插入到了同一个功能基因的不同位置ꎬ他们的侧翼
序列所插入的基因均为葡萄糖阻遏蛋白 ＣＹＣ８ 基
因ꎬＴ２８６的插入位点在该基因的第一外显子区ꎬ
Ｔ１０４４的在第七外显子区ꎮ 这两个转化子的形态
相似ꎬ均不产微菌核ꎬ产孢量也显著低于野生型ꎬ但
Ｔ２８６的粗毒素含量显著低于野生型ꎬ而 Ｔ１０４４ 的
显著高于野生型ꎮ 这说明插入同一基因的不同位
置可能产生不同表型的突变体ꎮ ＣＹＣ８ (也叫做
Ｓｓｎ６)是由 Ｔｒｕｍｂｌｙ[２９]首次克隆得到的ꎬ在其 Ｎ 端
和 Ｃ端分别有 １６个和 ３１个谷氨酸串联结构域ꎬ是
一类葡萄糖阻遏蛋白ꎮ ＣＹＣ８和 Ｔｕｐ１ 蛋白共同组
成 ＣＹＣ８￣Ｔｕｐ１抑制子ꎬ是真菌中最为重要的一类
阻遏蛋白复合物[３０]ꎮ 在 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
中ꎬ３％的功能基因表达都受到 ＣＹＣ８￣Ｔｕｐ１ 的不同
程度的调控ꎮ ＣＹＣ８ 无论是在氨基酸序列还是在
功能上ꎬ都是十分保守的一类蛋白[３０]ꎮ 但是ꎬ以上
基因在轮枝菌属中均尚未见报道ꎬ因此ꎬ这些基因
为在棉花黄萎病菌中的功能分析提供了可靠的切
入点ꎮ
通过分析不同低致病力转化子中 Ｔ￣ＤＮＡ 插
入位点的分布ꎬ得知 Ｔ￣ＤＮＡ 在棉花黄萎病菌中的
插入存在随机性ꎬ在八条染色体上均有分布ꎬ说明
致病相关基因的分布亦无明显的染色体偏好性ꎮ
Ｔ￣ＤＮＡ随机插入到功能基因的不同区段ꎬ从而导
致致病相关基因的功能失活ꎮ 其中绝大多数的
Ｔ￣ＤＮＡ插入到了外显子和启动子区ꎬ仅有极少数
出现在内含子和终止子区ꎬ外显子区和启动子区的
外源插入ꎬ直接导致转录无法开始或提前终止ꎬ致
使基因功能沉默ꎮ
尽管目前已经有不少研究大丽轮枝菌致病相
关基因的报道ꎬ但是棉花黄萎病上的研究还处于初
级阶段ꎮ 因此ꎬ以强毒力菌株 Ｖｄ０８０ 突变体库作
为主要平台ꎬ筛选低致病力突变体并克隆致病相关
基因ꎬ可以为棉花黄萎病菌的分子致病机理研究提
供候选基因ꎬ为阐释病原菌和寄主的相互作用奠定
工作基础ꎮ
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[２７] Ｔｓａｉ Ｐ Ｗꎬ Ｙａｎｇ Ｃ Ｙꎬ Ｃｈａｎｇ Ｈ Ｔꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ￣
ｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ￣Ｗａｌｌ β￣１ꎬ ３￣Ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ｘｏｇ１ｐ
ｉｎ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｍｉ￣
ｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＬＬ￣３７[ Ｊ] . ＰＬｏＳ Ｏｎｅꎬ ２０１１ꎬ ６(６):
ｅ２１３９４.
[２８] Ｚｈａｏ Ｘ Ｈꎬ Ｗａｎｇ Ｗꎬ Ｗａｎｇ Ｆ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
ｓｔｕｄｙ ｏｆ β￣１ꎬ ４￣ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ (ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ β￣１ꎬ ４￣ｅｘ￣
ｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ) ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＬＨ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ( ＤＥ３) [ Ｊ ] . Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ
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[２９] Ｔｒｕｍｂｌｙ Ｒ Ｊ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＹＣ８
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[３０] Ｓｍｉｔｈ Ｒꎬ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ. Ｔｕｒｎｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｏｆｆ ｂｙ Ｓｓｎ６￣Ｔｕｐ１:
ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ
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责任编辑:曾晓葳
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