全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 693 - 700
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 12 - 27; 修回日期 : 2008 - 04 - 08
基金项目 : 上海市科技攻关重大项目 (03DZ19310) ; 国家 ‘863’项目 (2007AA100503) ; 上海市国内科技合作项目 (073158202)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lxzhao@ sjtu1edu1cn)
抗黄萎病基因 S tVe转化番茄的研究
陈玉辉 1, 2 , 赵凌侠 1, 33 , 柴友荣 4 , 崔丽洁 1, 3 , 董仲琦 2 , 钱虹妹 1, 3 , 唐克轩 1, 3
(1 上海交通大学复旦 —交大 —诺丁汉植物生物技术研发中心 , 上海 200240; 2 上海交通大学生命科学技术学院 , 上海
200240; 3 上海交通大学农业与生物学院 , 上海 200240; 4 西南大学农学与生物科技学院 , 重庆 400716)
摘 　要 : 为了验证克隆自水茄 (Solanum torvum Swartz) 的 S tV e基因功能 , 将 S tV e连入中间载体 p35S2
2300: : gus: : noster的 B am HⅠ和 SacⅠ位点 , 取代 gus基因构建植物双元表达载体 p35S22300: : S tV e: :
noster; 用农杆菌介导法转化樱桃番茄 22号 , 获得了 72株卡那霉素抗性植株 , PCR和 Southern blot检测确
认有 5株为阳性植株 ; RT2PCR结果显示 , S tV e在转基因番茄植株间的转录水平表达存在差异 ; PDA平板
抑菌试验显示 , 转 S tV e基因番茄叶片总可溶蛋白具有抑制番茄黄萎病菌生理小种 1 (V erticillium dahliae race
1) 生长的作用。
关键词 : 番茄 ; 抗病 ; S tV e基因 ; 大丽轮枝菌 ; 转化
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520693208
Tran sforma tion of Toma to w ith the V ertic illium dah liae Resistance Gene S tV e
from Solanum torvum
CHEN Yu2hui1, 2 , ZHAO L ing2xia1, 33 , CHA I You2rong4 , CU I L i2jie1, 3 , DONG Zhong2qi2 , Q I AN Hong2
mei1, 3 , and TANG Ke2xuan1, 3
(1 Fudan - SJTU - N ottingham Plan t B iotechnology R & D Center, Shanghai J iaotong U niversity, Shangha i 200240, China;
2 School of L ife Science and Technology, Shangha i J iaotong U niversity, Shangha i 200240, Ch ina; 3 School of A gricu lture and B iol2
ogy, Shangha i J iaotong U niversity, Shanghai 200240, China; 4 College of A gronom y & B iotechnology, Sou thw est U niversity,
Chongqing 400716, China)
Abstract: In order to verify the function of S tV e gene (314 kb) which was isolated from Solanum tor2
vum , we substituted the S tV e gene for gus in p lasm id p35S22300 : : gus : : noster, and constructed p lant bina2
ry exp ression vector p35S22300 : : S tV e : : noster. Subsequently, the resulting vector was introduced into to2
mato p lants via Ag robacterium tum efaciens2mediated method. In total, we obtained 72 tomato p lants resistant to
kanamycin and 5 independent transgenic tomato p lantswere confirmed by PCR and Southern blot analysis. The
five transgenic tomato p lants were further analyzed the exp ression of S tV e gene at transcrip tion level through
sem i2quantitative one2step RT2PCR. S tV e gene was found to exp ress with variable levels between different
transgenic lines. The crude p roteins were extracted from the transgenic tomato leaves and p roved to have an
effect of restraining the mycelia growth of Verticillium dahliae race 1 in vitro.
Key words: tomato; resistance to disease; S tV e gene; V erticillium dahliae; transformation
大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae Kleb) 导致的黄萎病是一种世界性土传真菌病害 ( Kawchuk et
al. , 2001; Rauyaree et al. , 2005) , 对棉花、马铃薯、番茄、茄子和向日葵等重要农作物的生长发育
和产量形成构成严重威胁 (Bowden et al. , 1990; Hamp ton et al. , 1990; L igoxigakis & Vakalounakis,
1992; Subbarao et al. , 1995; Sadras et al. , 2000; Karagiannidis et al. , 2002)。
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
番茄是大丽轮枝菌侵害的主要作物之一 (Chai et al. , 2003) , 近年在抗病基因克隆方面取得了一
定进展。Kawchuk等 (2001) 用图位克隆技术从番茄 (Solanum lycopersicum‘VFN8’) 基因组文库中
成功分离了 2个大丽轮枝菌 (1号小种 ) 抗性基因 V e1和 V e2; V e赋予了转基因马铃薯对强致病力黑
白轮枝菌 (V erticillium albo2a trum Reinke & Berth) 较强的抗性 , 说明 V e抗性功能已超越了其小种特
异性限制。作者所在实验室 Fei等 (2004) 利用 RACE技术从水茄 (S. torvum Swartz) 中克隆了全长
3 640 bp的 S tV e基因 ; 生物信息学分析显示 , S tV e与 V e1和 V e2在核酸水平具有较高同源性 , 编码的
是一个富含亮氨酸 (15189% ) LRR s型跨膜细胞表面受体类蛋白 ; 暗示了 S tV e可能具有抗黄萎病功
能 ( Kawchuk et al. , 2001; Fei et al. , 2004; van der Hoorn et al. , 2005)。
为了确认 S tV e功能 , 本研究构建了含 S tV e的植物双元表达载体 , 用农杆菌介导法转化樱桃番茄
22号 ; 在 CaMV35S启动子驱动下 , S tV e在转基因番茄中成功表达 ; 表达 S tV e番茄叶片可溶蛋白对番
茄黄萎菌 (1号小种 ) 生长具有显著抑制作用 , 初步推断 S tVe具有抗番茄黄萎病的功能 ; 该研究对
利用基因工程手段创造番茄或植物黄萎病抗性资源及培育抗病品种具有应用价值。
1　材料与方法
111　材料及试剂
樱桃番茄 22号、大肠杆菌 DH5α、根癌农杆菌 EHA105、植物表达中间载体 p35S22300: : gus: :
noster和质粒 pT2easy2S tV e均由上海交通大学植物生物技术研究中心保存 , 番茄黄萎病病原菌生理小
种 1 (V. dah liae race 1) 由东北农业大学园艺学院番茄课题组李景富教授惠赠。
限制性内切酶 (B am H I、Sac I、H ind Ⅲ和 B gl Ⅱ) 购自 B ioLab公司 , Trizol购自 GIBCO 公司 ,
Gene ImagesTM和 CDP2StarTM Kit购自 Amersham Pharmacia公司。DNA分子量标准 DL 2000、λ2H ind Ⅲ、
T2easy2vector和 Taq DNA聚合酶购自大连 TaKaRa公司 , 胶回收 Kit和质粒抽提 Kit购自上海华舜生物
工程有限公司 , T4 DNA连接酶和 CTAB购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
112　引物设计
依据 S tVe基因序列 (AY311527) 和真核生物核糖体 18S rRNA基因序列设计本研究 PCR和 RT2
PCR检测引物 , 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 , 序列如下。
S tV e685F1: 5′2ATTGTTGGAGGTCCTGAATGTTGGAAATAA23′; S tV e685R1: 5′2GTTTCCTTCAAAG2
GAATCTCCTGAGAATGT23′; 18SF: 5′2ATGATAACTCGACGGATCGC23′; 18SR: 5′2CTTGGATGTGG2
TAGCCGTTT23′。
113　植物双元表达载体 p35S22300: : S tV e: : noster构建
用 B am HⅠ和 SacⅠ顺序酶切中间载体 p35S22300: : gus: : noster, 补平 SacⅠ粘端后回收大片段 ; 用
H ind Ⅲ酶切质粒 pT2easy2S tVe补平后 , 再用 B glⅡ (B am HⅠ同尾酶 ) 酶切 , 回收 314 kb基因 S tVe片段 ;
将目标片段连接构建植物双元表达载体 p35S22300: : S tVe: : noster; 载体质粒经 PCR、酶切和测序确认
后 , 用冻融法 (王关林和方宏筠 , 2002) 转化根癌农杆菌 EHA105制备工程菌 , 用于番茄遗传转化。
114　番茄遗传转化
用农杆菌介导法转化番茄 (王关林和方宏筠 , 2002)。将在 MS0培养基 (MS 4141 g·L - 1 + 蔗糖
30 g·L - 1 + 植物凝胶 216 g·L - 1 ) 上培养 5～7 d的番茄无菌苗下胚轴 (或子叶 ) 剪成 013～015 cm
小段 ; 用含 p35S22300: : S tV e: : noster农杆菌 EHA105 (OD600 = 015～018) 浸染 5～8 m in, 然后吸去
外植体表面残余菌液 , 置于 MS1培养基 (MS0 + 012 mg·L - 1 IAA + 2 mg·L - 1 62BA ) 上共培养 36 h
(25 ℃黑暗条件 ) ; 转入 MS2培养基 (MS1 + 50 mg·L - 1 Kan + 250 mg·L - 1 Cef或 Cb) 分化筛选 ,
同时以 EHA105空菌 (不含表达载体 ) 转化番茄下胚轴 (或子叶 ) 作阴性对照 , 10～12 d继代 1次 ,
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　5期 陈玉辉等 : 抗黄萎病基因 S tV e转化番茄的研究 　
约 30 d左右分化出绿色芽点 ; 待再生芽长至 3～4 cm时切下并移入 MS3生根培养基 (1 /2 MS0 + 25
mg·L - 1 Kan + 250 mg·L - 1 Cef或 Cb) , 根系形成后移入装有珍珠岩营养钵中驯化 7～10 d, 然后移
栽到温室用于后续研究。
115　转基因番茄 PCR检测
用 CTAB 法提取番茄基因组 DNA 作模板 (Murray & Thomp son, 1980 ) , 用引物 S tV e685F1 /
S tV e685R进行 PCR 检测卡那霉素抗性番茄植株。25 μL 体系包括 : S tVe685F1 和 S tV e685R1 ( 10
μmol·L - 1 ) 各 1 μL, dNTPs ( 215 mmol·L - 1 ) 115 μL, 10 ×PCR 缓冲液 215 μL, MgCl2 ( 25
mmol·L - 1 ) 115μL, DNA模板 (100 ng·μL - 1 ) 2μL, Taq DNA聚合酶 (5 U·μL - 1 ) 013μL, 加
ddH2 O至 25μL, 上覆 15μL灭菌矿物油。PCR参数 : 94 ℃ 3 m in, 1个循环 ; 94 ℃ 45 s, 55 ℃ 30
s, 72 ℃ 90 s, 35个循环 ; 72 ℃ 8 m in, 1个循环 ; 4 ℃保存。PCR产物用 112%琼脂糖凝胶电泳 ,
并在 UVP凝胶成像系统紫光下检测和拍照。
116　转基因番茄 Southern blot分析
用 H ind Ⅲ酶解转基因番茄基因组 DNA (30μg, 37 ℃, 14 h) , 等量非转基因番茄基因组 DNA
作阴性对照。用 1% 琼脂糖凝胶电泳分离 , 经脱嘌呤、变性和中和处理后 , 用毛细管转移法 (转膜
液 10 ×SCC) 将酶解完全的番茄基因组 DNA 转移到 Hybond2N +尼龙膜上 , 用 B iotin2dUTP (Amer2
sham Pharmacia公司 ) 标记的 S tV e片段 (685 bp) 作探针进行杂交检测 , Southern blot按照试剂盒生
产商说明书进行。杂交后在 Fuji X -光片下室温曝光 2 h, 杂交信号采用 CDP2Star检测系统检测。
117　转基因番茄 RT2PCR半定量分析
分别用引物 18SF /18SR和 S tV e685F1 /S tV e685R1, 以转 S tV e番茄叶片总 RNA ( Trizol法提取 ) 为
模板 (非转基因番茄作对照 ) , 按 One2step RT2PCR试剂盒 ( Takara公司 ) 操作程序进行 RT2PCR分
析。25μL扩增体系包括 : 引物 ( 10μmol·L - 1 ) 各 1μL, dNTPs ( 215 mmol·L - 1 ) 215μL, 10 ×
One step RNA PCR缓冲液 215μL, MgCl2 ( 25 mmol·L - 1 ) 5μL, RNase模板 ( 40 U·μL - 1 ) 015
μL, AMV2RTNase XL (5 U·μL - 1 ) 015μL , AMV2Op tional Taq (5 U·μL - 1 ) 015μL, Total RNA (1
μg·μL - 1 ) 1μL, 加 RNase2free水至 25μL。反应参数 : 50 ℃ 30 m in, 94 ℃ 2 m in, 1个循环 ; 94 ℃
30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 30个循环 ; 72 ℃ 8 m in, 1个循环 ; 4 ℃保存。产物在 115%琼脂糖凝
胶下电泳 , 并在 UVP凝胶成像系统紫外光下拍照。同时利用该系统的 1D2gel analysis功能 , 依据条带
相对强度对外源基因表达量进行分析。
118　转基因番茄抑菌试验
用 PBS法 (王关林和方宏筠 , 2002) 提取转基因番茄叶片总可溶性蛋白 (以非转基因番茄作对
照 ) , 用 B radford法测定蛋白浓度 (B radford, 1976) , 用 0145μm滤膜除菌 ; 并以 1μg·mL - 1工作浓
度添加到 PDA培养基中充分混匀。参照潘丽娜等 (2005) 的方法 (略有修改 ) , 在加有 10 mL PDA
培养基平皿 ( d = 90 mm) 中心打一小孔 ( d = 8 mm ) , 取生长良好大丽轮枝菌 (V1dah liae race 1) 菌
饼 ( d = 6 mm) 置于孔中 , 3次重复 ; 在 25 ℃恒温箱中暗培养 2周后准确量取 PDA平板 “菌圈 ”直
径 , 依据菌环面积确定转 S tV e番茄目标蛋白抑菌效果。
2　结果与分析
211　载体构建
用 S tV e置换中间表达载体 p35S22300: : gus: : noster的 gus基因 , 构建植物双元表达载体 p35S2
2300: : S tV e: : noster (图 1)。T2DNA区段上的 2个 CaMV35S启动子分别驱动靶基因 S tVe和标记基因
nptⅡ在转基因番茄中表达 ; 表达 S tVe的转基因番茄 , 因 nptⅡ同时表达而被赋予了 kanamycin抗性 ;
通过添加 kanamycin培养基筛选 , 可以获得 S tV e和 nptⅡ同时表达的转基因番茄。
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图 1　植物双元表达载体 p35S22300 : : S tV e : : noster
F ig. 1　The plan t b inary expression vector p35S22300 : : S tV e : : noster
p35S: Cauliflower mosaic virus 35S p romoter; T35: Cauliflower mosaic virus 35S polyA; nos: nos term inator
sequence; S tVe: Solanum torvum Verticillium dahliae resistance gene sequence;
nptⅡ: neom ycin phosphotransferaseⅡ cDNA sequence;
LB: Left border; RB: R ight border.
212　番茄遗传转化和 PCR检测
用工程菌 EHA105转化外植体 (下胚轴或子叶 ) , 经 MS2培养基分化筛选共获得卡那霉素抗性番
茄 72株 (图 2, A、C和 D ) ; 用 EHA105空菌转化番茄外植体 , 在 MS2培养基上并未分化出再生植株
(图 2, B) , 而在无筛选压 MS2培养基 (无卡那霉素 ) 上获得了再生植株 , 并作为本研究阴性对照。
转化子叶分化出的多为无生长点的叶状体 , 可能与受体番茄遗传型有关。
图 2　番茄遗传转化不同时期
A: 转化后 30 d番茄外植体 (含 p35S22300: : S tV e: : noster质粒的 EHA105) ; B: 转化后 30 d
番茄外植体 ( EHA105空菌 ) ; C: 再生苗生根 ; D: 转基因番茄驯化。
F ig. 2　D ifferen t stages of tran sgen ic toma to plan ts
A: Exp lants at 30 days after being transformed by Agrobacterium tum efaciens strain EHA105 harboring the recombinant vector
p35S22300 : : S tVe : : noster; B: Exp lants at 30 days after being transformed by A. tum efaciens strain
EHA105 without vector; C: Rooting of regenerated tomato p lantlets;
D: Domestication of transgenic tomato.
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　5期 陈玉辉等 : 抗黄萎病基因 S tV e转化番茄的研究 　
　　取 2μL (100 ng·μL - 1 ) 基因组 DNA作模板 , 用引物 S tV e685F1 /S tV e685R1对 kanamycin抗性番
茄进行 PCR检测 , 分别以非转基因番茄和质粒 p35S22300 : : S tV e : : noster作阴性和阳性对照。琼脂
糖凝胶电泳检测结果显示 , 有 5株抗性番茄 (18、19、28、33和 54号 ) 基因组扩增出了与阳性对照
一致的条带 (685 bp) , 非转基因番茄未检测到该条带 , 可以初步推断外源基因 S tV e已导入番茄基因
组 ; 转基因番茄 PCR阳性率为 6194% (图 3)。
图 3　转基因番茄 PCR检测结果
M: DL 2000 DNA分子量标准 ; CK + : 阳性质粒 p35S22300 : : S tVe : : noster;
CK - : 非转基因番茄 ; 18、19、28、33和 54: 转基因番茄植株。
F ig. 3　The result of tran sgen ic toma to plan ts by PCR ana lysis
M: DL 2000 DNA marker; CK + : Plasm id p35S22300 : : S tV e : : noster; CK - : Tomato p lant
from transformation by A. tum efaciens strain EHA105 without vector;
18, 19, 28, 33 and 54: Transgenic tomato p lants.
213　转基因番茄 Southern blot分析
Southern blot检测发现 , 5株 PCR阳性植株均检测到了杂交信号 , 外源基因拷贝数为 1 ( 28号 )
～4 (54号 ) , 而在非转基因番茄中未检测到杂交信号 (图 4) , 说明 S tV e已成功地整合到番茄基因组
中。
图 4　转基因番茄 Southern blot分析
图左侧数字为λ2H ind Ⅲ DNA分子量标准 ; 54、33、28、19、18: 转基因
番茄植株 ; CK: 非转基因番茄植株。
F ig. 4　Southern blot ana lysis of the tran sgen ic toma to plan ts
The numbers on the left indicate the sites ofλ2H ind Ⅲ DNA size marker co2electrophoresed with the tomato
DNA samp les; 54, 33, 28, 19, 18: Independent transgenic tomato p lants;
CK: Untransformed tomato p lant.
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214　RT2PCR检测
引物 18SF /18SR在 6株番茄中 (包括 1株非转基因番茄对照 ) 均扩增出了亮度均一、大小为 400
bp番茄 18S rRNA目的条带 ; S tV e685F1 /S tV e685R1在 5株转 S tVe的 T0代番茄中均扩增出了 685 bp条
带 , 而在非转基因番茄植株中未扩增出该条带 (图 5) ; 说明 S tV e在转基因番茄叶片中成功表达 (转
录水平 )。
用 UVP凝胶成像系统 1D2gel analysis功能对 RT2PCR扩增产物条带亮度检测显示 , 5株转 S tV e番
茄所扩增条带强度不同 , 54号和 28号强于其它 3株 , 说明 S tV e在转基因番茄植株间转录水平表达存
在差异。
图 5　用半定量 RT2PCR分析 S tV e基因在转基因番茄叶片中的表达
CK: 非转基因番茄植株 ; 18、19、28、33和 54: 转基因番茄植株 ;
18S rRNA基因用于 RT2PCR扩增的对照。
F ig. 5　Expression ana lysis of S tV e gene by sem i2quan tita tive RT2PCR in leaves of tran sgen ic toma to
CK: Untransformed tomato p lant; 18, 19, 28, 33 and 54: Transgenic tomato p lants;
The 18S rRNA gene was used as the control to show the normalization of the amount
of temp late RNA used in RT2PCR amp lification.
215　转基因番茄目标蛋白抑菌试验
用 PDA培养基平板法检测转 S tV e番茄抑菌效果。结果 (图 6) 显示 , 黄萎病病原菌在对照 (阴
性 ) 平板上菌丝覆盖面积为 31159 cm2 ±1109 cm2 ; 而添加有表达 S tV e番茄可溶蛋白 PDA平板的黄萎
图 6　转基因番茄叶片粗蛋白抑菌试验 ( 14 d)
A: 对照 , 非转基因番茄 ; B～F: 18、19、28、33和 54号转基因番茄。
F ig. 6　The result of tran sgen ic toma to plan ts in restra in ing for V erticillium dah liae ( 14 d)
A: Control, untransformed tomato p lant; B - F: 18, 19, 28, 33 and 54,
transgenic tomato p lants.
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　5期 陈玉辉等 : 抗黄萎病基因 S tV e转化番茄的研究 　
病菌菌环面积显著小于对照 ( F = 633105 > F0101 = 5106) , 分别为 14118 cm2 ±0113 cm2 ( 18号 )、
12192 cm2 ±0134 cm2 ( 19号 )、13193 cm2 ±0154 cm2 ( 28号 )、15102 cm2 ±0112 cm2 ( 33号 ) 和
11125 cm2 ±0110 cm2 (54号 ) , 说明转 S tVe番茄总可溶性蛋白具有显著抑制黄萎病菌在 PDA培养基
上生长的作用 , 据此可以初步推断克隆自水茄 S tV e基因具有抗番茄黄萎病菌的功能。并且有 54号的
抑菌效果优于其它转基因番茄植株的趋势 , 不过转 S tV e番茄株间 ( T0代 ) 黄萎病菌的抑菌差异不显
著。
3　讨论
本研究所获得的 72株卡那霉素抗性番茄仅有 5株是阳性 (阳性率 6194% ) , 这可能与分化筛选
后期 MS2培养基卡那霉素筛选压下降、再生植株逃逸或抗性增强有关 ( Frary & van Eck, 2005; 谢志
兵 等 , 2006) , 因而该受体材料的遗传转化条件还有待优化。
外源基因低拷贝整合是农杆菌介导植物遗传转化最突出的特点之一 , 本研究所获得 5株转 S tV e
番茄外源基因拷贝数介于 1 ～4 之间 , 与前人研究结果一致 (Akama et al. , 1992; 王守才 等 ,
1999)。整合有 4个拷贝 S tV e的 54号转基因番茄 , 外源基因转录表达和抑菌效果均优于其它 4个转基
因番茄植株 ( T0代 ) , 甚至优于 S tV e单拷贝的 28号 , 这可能与 S tVe在转基因番茄基因组中整合位点
有关 ; 迄今转基因植物外源基因表达水平与拷贝数依存关系的研究尚无定论 ( Hobbs et al. , 1993;
Neuhuber et al. , 1994; Stam et al. , 1998, 2000; Jakowitsch et al. , 1999; Lechtenberg et al. , 2003) ,
还有待于更多研究数据的支持。
转 S tV e番茄叶片可溶性蛋白具有显著抑制大丽轮枝菌生长的作用 , S tV e抗番茄黄萎病功能得到
了初步确认 ; 不过除 54号以外 , 其它 4株转 S tV e番茄 (18、19、28和 33号 ) 对大丽轮枝菌的抑菌
效果无显著差异 (图 6)。
为了进一步阐释 S tVe功能和创造抗性育种材料 , 有必要获得大量独立转 S tV e番茄植株或纯系并
进行分子检测 (核酸和表达水平 )、遗传分析和抗病性鉴定 (田间接种鉴定 ) , 在研究转基因番茄
S tV e表达水平与黄萎病抗性依存关系的同时 , 筛选获得抗性育种资源。不过 , 本研究为了将获得转
S tV e番茄纯系用于后续研究 , 未对转基因当代 ( T0 ) 的 5株转基因番茄进行田间黄萎病接种鉴定 ,
仅通过室内抑菌试验对 S tV e功能进行了初步验证 , 后续的研究正在进行中。
本研究将克隆自属间水茄 (S. torvum ) 的 S tV e导入番茄 , 并初步确认 S tV e具有抗番茄黄萎病功
能 ; 对利用基因工程技术跨越物种生殖障碍创造番茄黄萎病抗性资源研究进行了有益的尝试 , 该研究
也将对棉花和苜蓿等重要农作物黄萎病抗性育种和资源创新具有重要的借鉴意义。
References
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