全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(６): ５８１￣５８５(２０１４)
收稿日期: ２０１４￣０３￣０６ꎻ 修回日期: ２０１４￣０８￣０９
基金项目: 国家现代农业产业技术体系建设专项(ＣＡＲＳ￣０９)
通讯作者: 朱振东ꎬ研究员ꎬ主要从事豆类病害研究ꎻＴｅｌ: ０１０￣８２１０９６０９ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｚｈｕｚｈｅｎｄｏｎｇ＠ｃａａｓ.ｃｎ
第一作者: 支 叶ꎬ女ꎬ硕士ꎬ主要从事豆类病害研究ꎻＴｅｌ:０１０￣８２１０９６０９ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ａｂｃｄｅｆｇｈｚｈｉｙｅ＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０６.００３
小豆锈病病原菌鉴定
支 叶ꎬ 段灿星ꎬ 孙素丽ꎬ 王晓鸣ꎬ 朱振东∗
(中国农业科学院作物科学研究所ꎬ农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程ꎬ北京 １０００８１)
摘要:小豆锈病是小豆的重要病害ꎮ 然而ꎬ小豆锈病病原菌在我国还没有被鉴定ꎮ 本文对从黑龙江省和内蒙古自治区采集
的 ５个小豆锈病菌样品的分类地位进行了研究ꎮ 形态学观察表明ꎬ小豆锈病菌夏孢子芽孔位于赤道线或赤道线上方ꎬ冬孢
子平均壁厚为 ２.０ μｍꎮ 分子标记检测发现ꎬ小豆锈病菌不能被疣顶单胞锈菌特异性引物对 ＵＡ￣ＩＴＳＦ / ＵＡ￣ＩＴＳＲ扩增ꎬ小豆
锈病菌和豇豆锈病菌不能被豇豆单胞锈特异性引物对 ＵＶ￣ＩＴＳＦ / ＵＶ￣ＩＴＳＲ 区分ꎮ 对豇豆单胞锈特异性引物对扩增的 ４ 个
小豆锈病菌样品 ＰＣＲ产物进行测序ꎬ比对分析表明目标序列与小豆单胞锈 ＩＴＳ序列的同源性为 ９９％ ~ １００％ꎮ 基于夏孢子
的芽孔位置、冬孢子壁的厚度、疣顶单胞锈菌及豇豆单胞锈特异性引物检测结果和 ＩＴＳ 序列分析ꎬ小豆锈病菌被鉴定为小
豆单胞锈ꎮ
关键词:小豆ꎻ 锈病ꎻ 小豆单胞锈
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｒｕｓｔ ｏｎ Ａｄｚｕｋｉ ｂｅａｎ 　 ＺＨＩ Ｙｅꎬ ＤＵＡＮ Ｃａｎ￣ｘｉｎｇꎬ
ＳＵＮ Ｓｕ￣ｌｉꎬ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ￣ｍｉｎｇꎬ ＺＨＵ Ｚｈｅｎ￣ｄｏｎｇ　 ( Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｆｏｒ Ｃｒｏｐ Ｇｅｎｅ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｒｕｓｔ ｉｓ ａ ｓｅｖｅｒｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｎ ａｄｚｕｋｉ ｂｅａｎ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｒｕｓｔ ｆｕｎｇｕｓ ｈａｓ ｎｏｔ ｂｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎａ.
Ｆｉｖｅ ｒｕｓｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ａｄｚｕｋｉ ｂｅａｎ ｉｎ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｎｄ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ. Ｔｈｅ
ｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｒｕｓｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ. Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ
ｕｒｅｄｉｎｉｏｓｐｏｒｅ ｇｅｒｍ ｐｏｒｅｓ ｗａｓ ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ ｏｒ ｓｕｐｅｒｅｑｕａｔｏｒｉａｌꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｎ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｏｆ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅ ｗａｌｌ ｗａｓ ２.０
μｍ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ＵＡ￣ＩＴＳＦ / ＵＡ￣ＩＴＳＲ ｆｏｒ
Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ａｐｐｒｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ａｍｐｌｉｆｙ ａｎｙ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｅｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｕｓｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａｄｚｕｋｉ ｂｅａｎ
ａｎｄ ｃｏｗｐｅａ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｕ. ｖｉｇｎａｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ＵＶ￣ＩＴＳＦ / ＵＶ￣ＩＴＳＲ. Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｕ. ｖｉｇｎａｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ＵＶ￣ＩＴＳＦ / ＵＶ￣ＩＴＳＲ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｒｕｓｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ. ＢＬＡＳＴ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ９９％ ｔｏ １００％ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ
ｔｈｅ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕ. ａｚｕｋｉｃｏｌａ ｉｓｏｌａｔｅｓ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍ ｐｏｒｅｓ ｉｎ ｕｒｅｄｉｎｉｏｓｐｏｒｅｓꎬ ｔｈｅ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅ￣
ｗａｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓꎬ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕ. ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ￣ ａｎｄ Ｕ. ｖｉｇｎａｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒｓꎬ ａｎｄ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ
ｔｈｅ ｒｕｓｔ ｆｕｎｇｕｓ ｏｎ ａｄｚｕｋｉ ｂｅａｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｕ. ａｚｕｋｉｃｏｌａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓꎻ ｒｕｓｔꎻ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ａｚｕｋｉｃｏｌａ
中图分类号: Ｓ４３５.２１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０６￣０５８１￣０５
　 　 小豆(Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ)是我国主要的食用豆
类作物之一ꎮ 由于其具有较高的营养和药用价值ꎬ
作为传统和特色作物ꎬ在我国农业生产和人们生活
中具有独特的作用ꎮ 在世界上ꎬ小豆主要栽培于亚
洲地区ꎬ其中我国在栽培面积及产量均居首位ꎮ 小
豆在我国大部分地区都有种植ꎬ其中东北、华北、黄
　
植物病理学报 ４４卷
河中下游和长江中下游为主要产区[１]ꎮ 小豆锈病
是我国小豆生产中重要病害之一ꎬ尤其在华北及东
北地区发生严重ꎬ常导致叶片枯黄脱落ꎬ植株早衰ꎬ
籽粒瘪瘦ꎬ产量损失严重ꎬ甚至绝收[２~４]ꎮ
　 　 小豆锈病最早于 １９２２年在日本报道ꎮ 由于夏
孢子形态与菜豆(Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ)上的相似ꎬ
Ｉｔｏ[５]将小豆锈病菌视为疣顶单胞锈 (Ｕｒｏｍｙｃｅｓ
ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ)ꎮ 后来ꎬＨｉｒａｔａ[６]发现小豆、野生小
豆(Ｖ. ａｎｇｕｌａｒｉｓ ｖａｒ. ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｉｓ)和饭豆(Ｖ. ｕｍ￣
ｂｅｌｌａｔａ)上的锈病菌与疣顶单胞锈在夏孢子和冬孢
子形态与大小上存在差异ꎬ将这些寄主上的锈病菌
描述为一个新种ꎬ即小豆单胞锈(Ｕ. ａｚｕｋｉｃｏｌａ)ꎮ
然而ꎬＨｉｒａｔｓｕｋａ 等根据夏孢子芽孔位置、冬孢子壁
上饰物及寄主专化性ꎬ界定小豆锈病菌为疣顶单胞
锈的一个变种 ( Ｕ. ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ ｖａｒ. ａｚｕｋｉｃｏ￣
ｌａ) [７]ꎮ 最近ꎬＣｈｕｎｇ 等[７]发现疣顶单胞锈小豆变
种的锈孢子形态与疣顶单胞锈其他变种的相似ꎬ但
夏孢子和冬孢子形态特征及寄主关系不同于其他
变种ꎬ根据对日本豆类的疣顶单胞锈和豇豆单胞锈
(Ｕ. ｖｉｇｎａｅ)进行形态和系统发育分析结果ꎬ将不
同寄主来源的锈病菌划分为疣顶单胞锈、小豆单胞
锈和豇豆单胞锈 ３个种ꎬ其中疣顶单胞锈主要为害
菜豆ꎬ小豆单胞锈主要为害小豆、野生小豆、饭豆
(Ｖ. ｕｍｂｅｌｌａｔａ)、土坘儿(Ａｐｉｏｓ ｆｏｒｔｕｎｅｉ)ꎬ豇豆单胞
锈主要为害豇豆(Ｖ. ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ) [８]ꎮ 在我国ꎬ迄
今还没有鉴定小豆锈病菌的报道ꎬ在少数几篇文献
中ꎬ一些研究者将小豆锈病菌分别视为小豆单胞
锈[２~３]或疣顶单胞锈[４ꎬ９]ꎮ ２０１２ 年 ８ 月和 ９ 月ꎬ在
黑龙江省牡丹江市、萝北县及内蒙古自治区呼和浩
特市调查发现部分小豆田锈病发生严重ꎮ 本研究
对这 ３个地点采集的小豆锈病菌样品进行形态学
和分子鉴定ꎬ以期确定小豆锈病的病原ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 试验材料
　 　 ５个小豆锈病菌样品ꎬ于 ２０１２ 年 ８ 月和 ９ 月
分别从黑龙江省牡丹江市(样品号 ＸＤＲ１￣ＸＤＲ３)、
萝北县 (ＸＤＲ４) 和内蒙古自治区呼和浩特市
(ＸＤＲ５)小豆田采集ꎬ其中牡丹江市采集的 ３ 份样
品分别来自不同小豆品种ꎮ １ 个菜豆锈病菌和 １
个豇豆锈病菌样品作为对照菌ꎬ其中菜豆锈病菌于
２０１２年 ９月从贵州省毕节市菜豆田采集ꎬ豇豆锈
病菌于 ２０１２年 ９月本实验室试验基地采集ꎮ 采集
的病叶夹于多层吸水纸间带回实验室ꎬ之后多次更
换吸水纸以保持叶片干燥ꎮ
１.２　 夏孢子和冬孢子形态鉴定
　 　 无菌解剖刀从病叶上刮取单孢子堆ꎬ用 Ｏｌｙｍ￣
ｐｕｓ ＣＸ３１光学显微镜观察夏孢子和冬孢子的形态
特征ꎬ测量孢子大小及孢子壁厚度ꎮ 每个样品分别
测量 ５０个夏孢子和冬孢子ꎮ
１.３　 特异性分子标记检测及序列分析
　 　 用无菌解剖刀从病叶上刮取孢子堆ꎬＤＮＡ提取
采用 ＣＴＡＢ方法ꎮ 用 Ｃｈｕｎｇ 等[１０]基于 ＩＴＳ 序列设
计的疣顶单胞锈特异性引物对 ＵＡ￣ＩＴＳＦ / ＵＡ￣ＩＴＳＲ
( ５′￣ＧＧＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＡＧ￣３′ / ５′￣ＣＡＴＴＴ￣
ＧＴＴＴＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＡＣ￣３′)和豇豆单胞锈特异性
引物对 ＵＶ￣ＩＴＳＦ / ＵＶ￣ＩＴＳＲ(５′￣ＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＡＴＴ
ＧＣＡＣＴＣＡＧ ￣ ３ ′ / ５ ′ ￣ ＡＧＴＴＡＧＴＴＴＡＧＧＡＧＴＴＣＴＡ
ＡＣ￣３′)分别扩增锈病菌样品基因组 ＤＮＡꎮ ＰＣＲ 扩
增体系和程序参照文献[１０]ꎮ ＰＣＲ 产物用 １.５％琼
脂糖凝胶电泳检测ꎮ
　 　 回收小豆锈病菌样品 ＸＤＲ１、ＸＤＲ２、ＸＤＲ４ 和
ＸＤＲ５的 ＰＣＲ产物ꎬ并克隆到 ｐＧＭ￣Ｔ 载体ꎮ 挑取
阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司
测序ꎮ 测序结果在 ＮＣＢＩ网站直接进行 ＢＬＡＳＴ 比
对ꎬ根据比对结果从 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库获得疣顶单
胞锈、小豆单胞锈 和豇豆单胞锈的 ＩＴＳ 序列ꎬ应用
ＭＥＧＡ ５.０ 采用 ＮＪ 算法构建系统发育树ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 夏孢子形态特征
　 　 ７个锈病菌样品的夏孢子均为球形、卵形或椭
圆形ꎬ壁上有刺ꎬ黄褐色(图 １)ꎮ 小豆锈病菌样品
夏孢子大小为(２２.２￣２５.９)μｍ ×(１９.１￣２３.３)μｍꎬ平
均为 ２５.０ μｍ × ２１.８ μｍꎬ壁厚为(１.３￣１.９) μｍꎬ平
均为 １.６ μｍꎮ 菜豆锈病菌样品的夏孢子大小为
(２２.４￣２８.６)μｍ ×(１９.１￣２４.０) μｍꎬ平均２４.２ μｍ×
２２.５ μｍꎬ壁厚为(１.２￣１.９) μｍꎬ平均为１.５ μｍꎮ 豇
豆锈病菌样品的夏孢子大小为(２３.６￣２９.０) μｍ ×
(１９.８￣２４.６) μｍꎬ平均为 ２６.０ μｍ × ２１.８ μｍꎬ壁厚
为(１.２￣１.６) μｍꎬ平均为 １.４ μｍꎮ 这些结果表明ꎬ
３个寄主来源的锈病菌夏孢子形态和大小没有明
２８５
　
　 ６期 支 叶ꎬ等:小豆锈病病原菌鉴定
显差异(Ｐ >０.０５)ꎮ ３ 个寄主来源的锈病菌夏孢子
均具有 ２个芽孔ꎬ但芽孔所在位置存在差异ꎮ 小豆
锈病菌样品夏孢子芽孔位于赤道线或赤道线上方
(图 １￣Ａ)ꎻ菜豆锈病菌样品夏孢子芽孔位于赤道
线ꎬ但不明显(图 １￣Ｃ)ꎻ豇豆锈病菌样品夏孢子芽
孔位于赤道线上方(图 １￣Ｅ)ꎮ
２.２　 冬孢子形态特征
　 　 ７ 个锈病菌样品的冬孢子均为亚球形至椭圆
形ꎬ褐色ꎬ顶部有无色至淡黄褐色乳状突起(图 １)ꎮ
小豆锈病菌样品冬孢子大小为(２６.６￣３２.５) μｍ ×
(１９.６￣２２.９) μｍꎬ平均为 ２９.３ μｍ ×２１.４ μｍꎬ壁厚
为(１.７￣２.３) μｍꎬ平均为 ２.０ μｍꎮ 菜豆锈病菌样
品冬孢子大小为(２７.６￣３４.７)μｍ×(２３.２￣２６.９) μｍꎬ
平均为 ３１.６ μｍ ×２４.９ μｍꎬ壁厚为(２.４￣３.５) μｍꎬ
平均为 ３.１ μｍꎮ 豇豆锈病菌样品冬孢子大小为
(２８.４￣３９.７)μｍ ×(１２２.６￣２７.５) μｍꎬ平均３３.０ μｍ
× ２５.４ μｍꎬ壁厚为(２.９￣３.６) μｍꎬ平均为 ３.４ μｍꎮ
３个寄主来源的锈病菌冬孢子形态存在差异ꎬ小豆
样品锈病菌冬孢子的大小和壁的厚度都显著小于
豇豆和菜豆的样品(Ｐ <０.０５)ꎮ
２.３　 特异性分子标记检测
　 　 根据 Ｃｈｕｎｇ等[１０]研究结果ꎬ引物对 ＵＡ￣ＩＴＳＦ /
ＵＡ￣ＩＴＳＲ只在疣顶单胞锈基因组 ＤＮＡ 中扩增约
５００ ｂｐ的特异性片段ꎬ而引物对 ＵＶ￣ＩＴＳＦ / ＵＶ￣ＩＴＳＲ
仅在豇豆单胞锈基因组 ＤＮＡ 中扩增 ５００ ｂｐ 特异
性片段ꎮ 在 ３个寄主来源的 ７ 个锈病菌样品基因
组 ＤＮＡ中ꎬ 引物对 ＵＡ￣ＩＴＳＦ / ＵＡ￣ＩＴＳＲ只在 １个菜
豆锈病菌样品中扩增约 ５００ ｂｐ 片段ꎬ在其他 ６ 个
样品中没有扩增出条带(图 ２)ꎬ表明菜豆锈病菌样
品为疣顶单胞锈ꎻ引物对 ＵＶ￣ＩＴＳＦ / ＵＶ￣ＩＴＳＲ 在 ５
个小豆锈病菌样品和 １ 个豇豆锈病菌样品中扩增
大小约 ５００ ｂｐ 片段ꎬ而在菜豆锈病菌样品中没有
扩增出条带(图 ２)ꎬ表明该引物对不能区分豇豆单
胞锈和小豆单胞锈ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｕｒｅｄｉｎｉｏｓｐｏｒｅｓ ａｎｄ ｔｅｌｉｏｓｐｏｒｅｓ ｏｆ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ. ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
Ａꎬ Ｂ: Ｆｒｏｍ Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ ｖａｒ. ａｎｇｕｌａｒｉｓꎻ Ｃꎬ Ｄ: Ｆｒｏｍ Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓꎻ
Ｅꎬ Ｆ: Ｆｒｏｍ Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ. Ｂｌａｃｋ ａｒｒｏｗ ｐｏｉｎｔｉｎｇ ｔｏ ｂｅ ｇｅｒｍ ｐｏｒｅ ｏｎ ｕｒｅｄｉｎｉｏｓｐｏｒｅ.
３８５
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ２ 　 ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｓｔ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ
ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｚｕｋｉ ｂｅａｎꎬ ｃｏｍｍｏｎ
ｂｅａｎ ａｎｄ ｃｏｗｐｅａ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉ￣
ｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ＵＡ￣ＩＴＳＦ / ＵＡ￣ＩＴＳＲ ｆｏｒ Ｕｒｏ￣
ｍｙｃｅｓ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ (ｔｏｐ) ａｎｄ ＵＶ￣
ＩＴＳＦ / ＵＶ￣ＩＴＳＲ (ｂｏｔｔｏｍ) ｆｏｒ Ｕ. ｖｉｇｎａｅ
Ｍ: ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ Ｄ２０００ꎻ Ｌａｎｅ １: Ｆｒｏｍ ｃｏｍｍｏｎ ｂｅａｎ ｉｎ Ｂｉｊｉｅꎬ
Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｆｒｏｍ ｃｏｗｐｅａ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇꎻ Ｌａｎｅ ３:
Ｆｒｏｍ ａｄｚｕｋｉ ｂｅａｎ ｉｎ Ｌｕｏｂｅｉ Ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
(ＸＤＲ４)ꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｆｒｏｍ ａｄｚｕｋｉ ｂｅａｎ ｉｎ Ｈｏｈｈｏｔꎬ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎ￣
ｇｏｌｉａ (ＸＤＲ５)ꎻ Ｌａｎｅ ５￣７: Ｆｒｏｍ ａｄｚｕｋｉ ｂｅａｎ ｉｎ Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇꎬ
Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ (ＸＤＲ１￣ＸＤＲ３)ꎻ Ｌａｎｅ ８: Ｗａｔｅｒ.
　 　 测序引物对 ＵＶ￣ＩＴＳＦ / ＵＶ￣ＩＴＳＲ 扩增的小豆
锈病菌样品 ＸＤＲ１、ＸＤＲ２、ＸＤＲ４ 和 ＸＤＲ５ 的 ＰＣＲ
产物ꎮ 将获得序列在 ＮＣＢＩ 网站上进行 ＢＬＡＳＴ 比
对ꎬ结果表明ꎬ４ 个样品的序列与小豆单胞锈 ＩＴＳ
序 列 ( ＡＢ１１５７０６、 ＡＢ１１５７０７、 ＡＢ１１５７０８、
ＡＢ１１５７１０、 ＡＢ１１５７１２、 ＡＢ１１５７１４、 ＡＢ１１５７１５、
ＡＢ１１５７３２)的同源性为 ９９％ ~ １００％[８]ꎮ 从 Ｇｅｎ￣
Ｂａｎｋ 数据库获得疣顶单胞锈、小豆单胞锈和豇豆
单胞锈的 ＩＴＳ 序列ꎬ用 ＭＥＧＡ ５.０ 的 ＮＪ 算法构建
系统发育树ꎮ 结果表明ꎬ疣顶单胞锈、小豆单胞锈
和豇豆单胞锈被分为 ３ 个明显不同的聚类组ꎬ
ＸＤＲ１、ＸＤＲ２、ＸＤＲ４ 和 ＸＤＲ５ 与小豆单胞锈聚类
在一起ꎮ 与疣顶单胞锈相比ꎬ小豆单胞锈和豇豆单
胞锈具有更近的遗传关系(图 ３)ꎮ
　 　 综合夏孢子芽孔位置、冬孢子侧壁厚度、特异
性分子标记检测及 ＩＴＳ序列分析结果ꎬ将来源于小
豆的锈病菌鉴定为小豆单胞锈(Ｕ. ａｚｕｋｉｃｏｌａ)ꎬ而
来源于菜豆的锈病菌鉴定为疣顶单胞锈(Ｕ. ａｐ￣
ｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ)ꎬ来源于豇豆的锈病菌鉴定为豇豆单
胞锈(Ｕ. ｖｉｇｎａｅ)ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ａｚｕｋｉｃｏｌａꎬ Ｕ. ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ
ａｎｄ Ｕ. ｖｉｇｎａｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＩＴＳ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
４８５
　
　 ６期 支 叶ꎬ等:小豆锈病病原菌鉴定
３　 讨论
　 　 Ｃｈｕｎｇ等[８]基于夏孢子芽孔位置、冬孢子侧壁
厚度和 ＩＴＳ序列变异ꎬ将几种不同豆类寄主的疣顶
单胞锈和豇豆单胞锈区分为寄主关系不同的 ３ 个
单胞锈种ꎬ即疣顶单胞锈、小豆单胞锈和豇豆单胞
锈ꎮ 本研究鉴定的 ５ 个小豆锈病菌样品夏孢子芽
孔位于赤道线上或赤道线上部区域ꎬ冬孢子侧壁平
均厚度为 ２.０ μｍꎬ这 ２ 个特征与 Ｃｈｕｎｇ 等描述的
小豆单胞锈一致[８]ꎮ 然而ꎬ用疣顶单胞锈和豇豆
单胞锈特异性标记进行基因组 ＤＮＡ 检测ꎬ发现 ５
个小豆锈病菌样品不能被疣顶单胞锈特异性引物
对 ＵＡ￣ＩＴＳＦ / ＵＡ￣ＩＴＳＲ扩增ꎬ但能被豇豆单胞锈特
异性引物对 ＵＶ￣ＩＴＳＦ / ＵＶ￣ＩＴＳＲ 扩增ꎬ且片段大小
与豇豆单胞锈相近(图 ２)ꎬ表明小豆锈病菌不是疣
顶单胞锈ꎬ但豇豆单胞锈特异性引物对 ＵＶ￣ＩＴＳＦ /
ＵＶ￣ＩＴＳＲ不能将小豆锈病菌和豇豆锈病菌分开ꎮ
Ｃｈｕｎｇ等[１０]设计的疣顶单胞锈和豇豆单胞锈特异
性引物扩增的目标片段为部分 ＩＴＳ序列ꎬ但引物设
计没有考虑小豆锈病菌的 ＩＴＳ序列ꎬ引物特异性检
测也没有用小豆锈病菌作对照ꎬ因此不能排除对小
豆锈病菌的扩增ꎮ 从 ＧｅｎＢａｎｋ 中下载 ３ 个小豆单
胞 锈 ＩＴＳ 序 列 ( ＡＢ１１５７０７、 ＡＢ１１５７０８、
ＡＢ１１５７３０) [８]ꎬ利用 ＣｌｕｓｔａｌＸ２ 与豇豆单胞锈特异
性引物序列进行比对ꎬ我们发现上游引物 ＵＶ￣ＩＴＳＦ
序列与 ＡＢ１１５７３０序列的第 ９１ 到 １１１ 碱基序列完
全一致ꎬ与 ＡＢ１１５７０７ 和 ＡＢ１１５７０８ 序列比较只在
第 ９４个碱基上存在差异ꎬ而下游引物 ＵＶ￣ＩＴＳＲ序
列与 ＡＢ１１５７３０、ＡＢ１１５７０７和 ＡＢ１１５７０８也分别只
有一个碱基不同ꎮ 显然ꎬ豇豆单胞锈特异性引物对
ＵＶ￣ＩＴＳＦ / ＵＶ￣ＩＴＳＲ完全可以在小豆单胞锈扩增ꎮ
进一 步 将 小 豆 单 胞 锈 ＩＴＳ 序 列 ＡＢ１１５７３０、
ＡＢ１１５７０７和 ＡＢ１１５７０８ 与 Ｃｈｕｎｇ 等[１０]用于引物
设计的豇豆单胞锈 ＩＴＳ 序列 ＡＢ１１５７１８ 进行比对
分析ꎬ发现相似性分别为 ９６.９％、９３.６％和 ９２.９％ꎬ
这一比对结果表明小豆锈病菌不同于豇豆单胞锈ꎮ
４个小豆锈病菌样品 ＩＴＳ 序列测定也证明了这一
结果ꎬ４个样品与小豆单胞锈聚类在一起ꎬ与豇豆
单胞锈相似性仅为 ９４％ ~ ９５％ꎮ 因此ꎬ我国黑龙江
省和内蒙古自治区小豆锈病病原菌为小豆单胞锈ꎮ
参考文献
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责任编辑:于金枝
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