全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测
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2013年 第38卷 第09期
收稿日期：2013-03-28
基金项目：河南省重点学科建设基金项目(10466-X-082301)。
作者简介：高向阳(1949—)，男，教授，研究方向为食品分析、天然资源研究与开发。
高向阳1,2，游新侠1，韩 帅2
(1.郑州科技学院食品科学系，郑州 450064；
2.河南农业大学食品科学技术学院，郑州 450002)
摘要：以异硫氰酸苯酯(PITC)作为柱前衍生剂，用二元梯度法洗脱，在柱温40 ℃、紫外检测器
254 nm条件下，通过柱前衍生-反相高效液相色谱法测定贼小豆中的氨基酸种类及含量。结果表
明：贼小豆中17种氨基酸在1.2~250 μmol范围内与峰面积比有良好的线性关系，精密度、稳定性
良好；加标回收率为97.03%~101.3%，相对标准偏差RSD为0.63%~1.9%(n＝3)；17种氨基酸干基总
含量为194.093~225.714 mg/g，贼小豆中氨基酸平均质量分数顺序为谷氨酸＞酪氨酸＞天冬氨酸＞
蛋氨酸＞脯氨酸＞精氨酸＞苯丙氨酸＞亮氨酸＞甘氨酸＞赖氨酸＞丙氨酸＞胱氨酸＞组氨酸＞苏
氨酸＞缬氨酸＞丝氨酸＞异亮氨酸。该方法简便、准确、高效，测定结果令人满意，为贼小豆食
品新资源的食用、药用等开发利用提供参考依据。
关键词：贼小豆；柱前衍生；反相-高效液相色谱法；氨基酸
中图分类号：TS 207.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)09-0262-05
Determination of amino acids in Vigna Minima by
precolumn derivatization coupled with
reversed-phase high performance liquid chromatography
GAO Xiang-yang1,2, YOU Xin-xia1, HAN Shuai2
(1.Department of Food Science, Zhengzhou Institute of Science and Technology, Zhengzhou
450064; 2.College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University,
Zhengzhou 450002)
Abstract: To determine the composition and contents of amino acids in Vigna Minima by reversed-phase
high performance liquid chromatographic (RP-HPLC) method, an ultimate amino acid column was used,
and phenylisothiocyanate (PITC) was the precolumn derivatization agent. Elutions were carried out in a
binary gradient mode. The column temperature was 40 ℃, and detection wavelength was set at 254 nm.
The results show that: Totally 17 amino acids were found, the calibration curves of 17 amino acids all
exhibited good linearity over the range from 1.2 to 250 μmol. and its precision, stability and repeatability
柱前衍生-反相高效液相色谱法测定
贼小豆中的氨基酸
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2013.09.021
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氨基酸是人体不可缺少的营养成分，对动植
物体内蛋白质的合成、促进人体生长发育具有重
要作用，是衡量食品营养价值和资源开发利用的
重要指标[1-3]。
目前，常用氨基酸自动分析仪测定氨基酸，
该法仪器操作复杂，费用较高，且脯氨酸不能
与其他氨基酸一同被检测[4-9]。近年来，用异硫
氰酸苯酯(phenylisothiocyanate，PITC)作柱前衍生
试剂的反相高效液相色谱法(reversed phase -high
performance liquid chromatography，RP-HPLC)因其
衍生反应速度较快，步骤简单、衍生稳定，在食
品科学技术领域得到较广泛应用[10-15]。
贼小豆(Vigna Minima)又名山绿豆，为豆科菜
豆亚组豇豆属一年生缠绕草本植物，产地覆盖我
国北部、东南部至南部，生于旷野、草丛或灌丛
中，国外亦有分布[16]。但其营养特性、食用价值
鲜见报道。因此，测定贼小豆中氨基酸种类和含
量，探索该自然野生资源的营养成分具有一定的
现实意义。本文用柱前衍生RP-HPLC分析技术测
定郑州地区野生贼小豆中氨基酸的种类和含量，
为进一步开发利用贼小豆食品新资源提供科学依
据和重要参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 贼小豆果实：采集于郑州龙
子湖高校园区(113:42E；34:44N)，由河南农业大
学朱长山教授鉴定；郑州绿豆：郑州市丹尼斯超
市，产地新郑；南阳绿豆：采于南阳市唐河县桐
寨铺镇。样品粉碎过60目筛，装入广口瓶中，置
于干燥器中备用。
17种氨基酸混合标准溶液：美国Sigma公司；
Ultimate ® Amino Acid氨基酸分析专用衍生剂A
和B：月旭材料科技(上海)有限公司；正己烷(色谱
纯)：天津赛孚瑞科技有限公司；乙腈(色谱纯)：
天津市四友精细化学品有限公司；三水合醋酸钠
(分析纯)：中国医药公司；盐酸(优级纯)：烟台市
双双化工有限公司。
1.1.2 仪器 Waters515二元高压高效液相色
谱仪(配备有2487紫外检测器，PCM泵控制器，
Empower色谱工作站，柱温箱，717 plus自动进样
器)：美国Waters公司；FZ102微型植物粉碎机：浙
江上虞盛科仪器制造有限公司；101-2-S-Ⅱ型电
热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；XH-C
涡旋混和器：江苏省金坛市医疗仪器厂；Milli-
Q®Advantage®A10超纯水系统(电阻率为18.3 MΩ·
cm)：法国Millpore公司。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件 ultimate Amino Acid氨基酸分析柱
(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；
柱温：40 ℃；紫外检测波长254 nm；进样量：5
μL；流动相A为0.1 mol/L醋酸钠溶液(pH6.5):乙腈
=93:7；流动相B为乙腈:水=80:20(v/v)；线性梯度洗
脱程序：0~11 min，7%B；11~13.9 min，12%B；
13.9~14 min，15%B；14~29 min，34%B；29~32
min，70%B；32~35 min，100%B；35~42 min，
100%B；42~45 min，0%B；45~60 min，0%B。
1.2.2 标准混合溶液的制备 用移液器移取100 μL
的17种氨基酸混合标准溶液，加900 μL水稀释，
混匀，得到0.25 mmol/L混合标准储备液(其中胱氨
酸0.125 mmol/L)。
1.2.3 标准混合溶液的衍生 精确量取1.2.2标准混
合溶液400 μL于衍生用小管中(6 mm×50 mm)，
加入稀释后的衍生剂A溶液200 μL和稀释后的衍
生剂B溶液200 μL，保持涡旋混合15 s摇匀；室
温放置1 min后用石蜡膜封口，于(50±1) ℃烘箱内
加热45 min，取出冷至室温，加入正己烷溶液400
μL，摇匀，用孔径为0.45 μm滤膜过滤，放置30
min后，取澄清的下层液在1.2.1节色谱条件下进行
氨基酸分析。
were good, Mean recoveries for 17 amino acids were between 97.03% and 101.3%. with a relative
standard deviation (RSD) between 0.63% and 1.9% (n=3), and the total content of amino acids in samples
was 194.093~225.714 mg/g. So it has a very good foreground of development of edible. The order of the
amino acid contents was Glu＞Tyr＞Asp＞Met＞Pro＞Arg＞Phe＞Leu＞Gly＞Lys＞Ala＞Cys＞His＞Thr＞
Val＞Ser＞Ile. This method was simple, accurate and effi cient, the measurement results are satisfactory,
to provide a theoretical basis for the new resources Vigna Minima edible, medicinal etc.
Key words: Vigna Minima; precolumn derivatization; reversed-phase high performance liquid
chromatography; amino acids
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1.2.4 试液的制备和测定 将贼小豆样品洗净风
干，粉碎过60目筛，在55 ℃恒温干燥箱中干燥至
恒重，准确称取0.1000 g置于水解管中，加6 mol/L
盐酸10 mL，封口，置110 ℃恒温干燥箱中水解24
h。放冷调pH至9.0，用水定容至50.00 mL，混匀、
过滤，再经0.45 μm滤膜过滤，备用。按1.2.3步骤
衍生后，取标准混合溶液和试液各5 μL，在完全
相同条件下测定，按外标法以峰面积计算含量。
2 结果与分析
2.1 水解条件的选择
准确称取0.1000 g样品于水解管中，分别加
10 mL 4、6、8 mol/L盐酸，封口，110 ℃恒温水解
18、24、30 h，放冷，用氢氧化钠溶液调pH至9，
定容至25 mL，混匀、过滤，经0.45 μm滤膜过滤
后，在1.2.1色谱条件下测定。结果表明：110 ℃
用6 mol/L盐酸恒温水解24 h为最佳水解条件。
2.2 线性关系、检出限、回收率
取17种氨基酸混合标准溶液，准确制备成浓
度为10、20、50、100、250 μmol/L的待测标样，
按1.2.3衍生后进样5 μL．以峰面积为纵坐标，氨
基酸浓度为横坐标进行线性回归，以3倍信噪比计
算检出限。另准确称取贼小豆0.1000 g，加入氨基
酸混合标准溶液100 μL，按照1.2.4色谱条件进行
平行加标回收率测定(n=6)，结果见表1。
由表1知，17种氨基酸在10~250 μmol/L与
峰面积比有良好的线性关系，相关系数均大于
0.999，回收率在97.0%~101.3%范围内，RSD为
0.63%~1.9%，检出限为0.017~0.094 μg/mL。
2.3 精密度
同一贼小豆样品称取0.1000 g 6份，按1.2色谱
条件和方法，分别进行6次平行测定，24 h之内完
成测定。结果表明：17种氨基酸峰面积的RSD为
1.2%~1.9%。
2.4 测定结果
在1.2.4色谱条件下，将贼小豆与绿豆对照进
行测定。取标准混合液和样品溶液各5 μL进样分
析，测定峰面积值，同时对样品进行3次平行测
图2 贼小豆样品中氨基酸的色谱图
表1 17种氨基酸的线性回归方程、检出限和回收率
氨基酸 线性回归方程 检出限
相关
系数
回收率
/%
RSD/%
(n=6)
门冬氨(Asp) Y=22728X-4143.5 0.041 0.9995 100.2 0.63
谷氨酸(Glu) Y=18756X+1604.1 0.036 0.9998 98.5 1.00
丝氨酸(Ser) Y=29421X-1657.1 0.018 0.9994 99.2 1.2
甘氨酸(Gly) Y=44885X+9006.6 0.094 0.9991 98.8 0.95
组氨酸(His) Y=21905X+2468.7 0.053 0.9996 101.3 1.6
精氨酸(Arg) Y=16339X-11694 0.086 0.9997 100.5 1.4
苏氨酸(Thr) Y=22299X-4125.3 0.034 0.9998 99.0 1.4
丙氨酸(Ala) Y=32351X-7578.3 0.081 0.9999 98.2 1.1
脯氨酸(Pro) Y=28504X+12535 0.046 0.9997 99.5 1.9
胱氨酸(Cys) Y=28607X-4927.6 0.035 0.9992 97.0 1.3
缬氨酸(Val) Y=31259X-2448.7 0.068 0.9997 98.9 1.5
蛋氨酸(Met) Y=23182X+3317 0.043 0.9997 99.8 1.3
异亮氨酸(Ile) Y=27606X-6891.2 0.017 0.9999 99.1 0.92
亮氨酸(Leu) Y=25289X+719.85 0.086 0.9993 100.8 0.86
酪氨酸(Tyr) Y=22074X-10223 0.059 0.9998 99.5 0.77
苯丙氨(Phe) Y=22284X-820.81 0.024 0.9998 98.8 0.92
赖氨酸(Lys) Y=40590X-3956 0.064 0.9998 99.4 1.5
6
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图1 17种氨基酸标准品混合溶液的色谱图
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定。色谱图见图1、图2，测定结果见表2。
由图1可见，17种氨基酸混合标准溶液峰型和
分离效果良好。由图2可知，贼小豆中各氨基酸衍
生后峰分离度较好。
表2 样品中氨基酸的测定结果 mg/g
氨基酸
含量
2011年
贼小豆
郑州
绿豆 南阳绿豆
2012年
贼小豆
天门冬氨酸(Asp) 18.628 19.484 19.252 22.789
谷氨酸(Glu) 29.348 29.134 29.639 33.645
丝氨酸(Ser) 1.341 1.347 1.387 1.608
甘氨酸(Gly) 10.530 12.918 10.797 13.787
组氨酸(His) 7.241 7.559 7.183 9.154
精氨酸(Arg) 13.573 14.148 12.841 16.293
苏氨酸(Thr)* 3.836 4.312 3.786 3.980
丙氨酸(Ala) 10.318 10.644 10.174 11.978
脯氨酸(Pro) 14.187 15.693 14.274 16.941
胱氨酸(Cys)** 10.069 11.840 10.812 12.905
缬氨酸(Val)* 2.164 2.126 1.776 2.397
蛋氨酸(Met)* 15.965 17.084 15.843 18.413
异亮氨酸(Ile)* 0.890 0.901 0.706 0.951
亮氨酸(Leu)* 10.782 11.534 10.639 12.231
酪氨酸(Tyr)** 22.918 24.625 22.645 25.597
苯丙氨酸(Phe)* 11.834 12.625 11.541 12.006
赖氨酸(Lys)* 10.469 11.553 10.390 11.039
AA 194.093 207.527 193.685 225.714
EAA 55.940 60.135 54.681 61.017
SEAA 32.987 23.393 33.457 38.502
EAA/SEAA 1.696 2.571 1.634 1.585
EAA/AA/% 28.82 28.97 28.23 27.03
EAA/NEAA/% 67.44 67.38 68.05 68.91
支/芳/% 40.75 39.08 38.41 41.43
注：*.必需氨基酸，**.半必需氨基酸。
上述氨基酸总量、必需氨基酸均不包括色氨
酸。其中AA表示氨基酸总量；EAA表示必需氨基
酸，SEAA表示半必需氨基酸，NEAA表示非必需
氨基酸，支/芳表示支链氨基酸与芳香氨基酸之
比，支链氨基酸为缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸。
芳香氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸。
由表2知，贼小豆中含有的人体必需氨基酸
之和(除色氨酸外)占总氨基酸的质量比(EAA/AA)
为27.03%~28.82%，氨基酸不仅含量高，种类齐
全，比例合适，且必需氨基酸含量和营养价值较
高。谷氨酸、酪氨酸和天门冬氨酸分别占总氨
基酸含量的14.90%~15.12%、11.34%~11.81%、
9.60%~10.10%；氨基酸含量高低顺序为：谷氨酸
＞酪氨酸＞天冬氨酸＞蛋氨酸＞脯氨酸＞精氨酸
＞苯丙氨酸＞亮氨酸＞甘氨酸＞赖氨酸＞丙氨酸
＞胱氨酸＞组氨酸＞苏氨酸＞缬氨酸＞丝氨酸＞
异亮氨酸。野生贼小豆中支链氨基酸与芳香类氨
基酸的比值均高于郑州绿豆和南阳绿豆。
2.5 各种味觉氨基酸的含量分析
味觉氨基酸在食品加工、研发等方面对食品
风味产生一定的影响[17]，样品测定味觉氨基酸的
含量见表3。
(1)鲜味类氨基酸：通过对贼小豆蛋白质分离
提取、酸水解或酶水解，获得的谷氨酸、天门冬
氨酸可作为鲜味剂的加工原料[18-19]。由表3可知鲜
味类氨基酸总量顺序为南阳绿豆>2012年贼小豆
>2011年贼小豆>郑州绿豆。
(2)甜味类氨基酸：由表3可知，各样品中甜味
类氨基酸含量在18.75%~19.64%之间。
(3)芳香族氨基酸：由表3可知，各样品中芳香
族氨基酸含量在16.66%~17.91%之间，其中2011年
贼小豆中芳香族氨基酸含量最高。
表3 样品中味觉氨基酸的含量
类别 氨基酸名称
2011贼小豆 郑州绿豆 南阳绿豆 2012年贼小豆
占总氨基酸
质量分数/% 合计/%
占总氨基酸
质量分数/% 合计/%
占总氨基酸
质量分数/% 合计/%
占总氨基酸
质量分数/% 合计/%
鲜味类
Asp 9.60 24.72 9.41 23.47 9.94 25.24 10.10 25.01Glu 15.12 14.06 15.30 14.91
甜味类
Ser 0.69
18.75
0.65
19.61
0.72
18.91
0.71
19.64Gly 5.43 6.24 5.57 6.11(Ala) 5.32 5.14 5.25 5.31
(Pro) 7.31 7.58 7.37 7.51
芳香类
Tyr 11.81 17.91 11.71 17.80 11.69 17.65 11.34 16.66Phe 6.10 6.09 5.96 5.32
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3 结论
采用反相-高效液相色谱法测定贼小豆中
的17种氨基酸。其中，人体所需的必需氨基
酸有7种，必需氨基酸含量占总氨基酸含量的
27.03%~28.75%。在所含氨基酸中，谷氨酸质量
分数高达29.348~33.645 mg/g，占氨基酸总含量的
14.90%~15.12%，有较高的营养价值。
食用贼小豆可补充人体新陈代谢和肌体生长
发育需要的氨基酸，尤其是必需氨基酸，能够平
衡膳食中氨基酸的不足并具有增强肌体的免疫调
节能力，利于人体健康。贼小豆中含有丰富的味
觉氨基酸，对食品风味会产生一定的良好影响，
研究开发利用贼小豆新型食品资源，进一步丰富
人们的生活，具有一定的积极意义。
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