全 文 ：RP-HPLC法测定不同采收期贼
小豆中9种有机酸含量
高向阳1,2， 韩 帅2， 王莹莹1
（1.郑州科技学院食品科学系， 河南 郑州 450064； 2.河南农业大学食品科学技术学院， 河南 郑州 450002）
摘 要：为充分利用野生贼小豆资源，建立利用反相高效液相色谱同时测定贼小豆中 9 种有机酸含量的方法，了解不同采收
期贼小豆中有机酸的动态变化，以郑州市区同一位置的野生贼小豆为样品，采用 SunfireTM-C18 色谱柱，pH=2.7 的磷酸盐缓冲溶
液为流动相，在紫外光 210 nm 处检测。 结果表明：25 min 内可完成 9 种有机酸的基线分离，检测限为 0.12～6.00 mg/L。 各有机酸标
准曲线的相关系数为 0.9965～0.9998，加标回收率均值为 96.01％～101.10％，相对标准偏差为 0.56%～1.9%(n=6)。 贼小豆样品含有所
测定 9 种有机酸中的 7 种，其中，酒石酸、柠檬酸、琥珀酸和顺丁烯二酸含量较高。 8 月下旬和 9 月下旬采集样品中所测有机酸的
总含量相对较高，9 月下旬采集样品中柠檬酸和琥珀酸含量较高。 该方法分析速度快、灵敏度高、分离效果和重现性好，可用于贼
小豆中有机酸含量的测定。
关键词：反相高效液相色谱； 贼小豆； 有机酸含量； 变化规律
中图分类号：S529.6 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2013）11-0021-04
Content of nine organic acids in Vigna minima(Roxb.) in different harvest
periods by reversed phase high performance liquid chromatography
GAO Xiang-yang1,2， HAN Shuai2，WANG Ying-ying1
(1.Department of Food Science, Zhengzhou Institute of Science and Technology, Zhengzhou 450064, China;
2.College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)
Abstract： In order to develop and utilize Vigna minima(Roxb.) Ohwi et Ohashi resources, and to understand the dynamic changes of
organic acids in different harvest period, a method of simultaneous determination of 9 organic acids content by reversed phase -high
performance liquid chromatography (RP-HPLC) was established with wild Vigna minima (Roxb.) at the same location of Zhengzhou as
samples, which used SunfireTM-C18 column, pH=2.7 phosphate buffer solution as mobile phase, the 210 nm ultraviolet detection. The
results showed that the baseline separation of 9 kind of organic acids could be finished within 25 min; the detection limit was 0.12~6.00
mg/L, the correlation coefficient was 0.9965～0.9998 on standard curves of organic acids, average recovery rate was 96.01%~101.10%, the
relative standard deviation （RSD） was 0.56%~1.9%(n=6). The samples contained 7 kinds of organic acids, in which tartaric acid, citric
acid, succinic acid and maleic acid content were higher. The total content of organic acid in the late August and late September collected
samples were higher relatively, the content citric acid and succinic acid were higher in late September samples. This method was validated
to be fast, high sensitivity, good separation and reproducibility for the determination of organic acid content in Vigna minima (Roxb.)
samples with satisfactory results.
Key words： reversed phase high performance liquid chromatography; Vigna minima(Roxb.)； organic acids content; change regulation
贼小豆 Vigna minima（Roxb.）为被子植物门（Angios-
permae） 木兰纲 （Magnoliopsida） 豆目 （Fabales） 豆科
（Fabaceae）菜豆族（trib.Phaseolease）豇豆属（Vigna）一年生
缠绕草本，产于我国北部、东南部至南部，生于林中或草
丛中，国外亦有分布 [1]。 贼小豆是我国宝贵的野生豆类植
物资源，有机酸含量是籽粒成熟度、耐储藏性以及加工特
性的重要依据 [2-4]，对贼小豆新陈代谢、酸碱平衡有重要作
用。
目前，测定食品中有机酸的方法有毛细管电泳 [5]、离
子色谱 [6-7]、气相色谱 [8-9]和液相色谱法 [10-17]等，而野生贼小
豆中有机酸的含量水平和变化规律还鲜见报道。 本研究
以郑州市郊同一位置的野生贼小豆为材料， 采用反相高
效液相色谱法 （Reversed Phase High Performance Liquid
Chromatography，RP-HPLC）同时测定样品中 9 种有机酸，
分析不同采收期贼小豆中有机酸的种类及含量变化，为贼
小豆采收质量的营养评价、口感风味以及该食品野生新资
源的进一步合理开发和加工利用提供理论依据和科学参
考，具有一定的现实意义和应用价值。
1 材料与方法
1.1 试验材料
贼小豆于 2012 年秋季采集于郑州龙子湖高校园区
（113°42/E，34°44/N）， 经河南农业大学朱长山鉴定为贼小
豆果实，8~11 月， 每月 25 日采集同一地方的野生果实为
样品；测定时取完整、饱满籽粒，依次用蒸馏水、超纯水快
速淋洗 3 遍后于 60℃烘箱中烘干。 郑州绿豆购于郑州市
丹尼斯超市，籽粒饱满，产地新郑；南阳绿豆籽粒饱满，采
于南阳市唐河县桐寨铺镇。所用样品经植物微型粉碎机粉
碎并过 0.25 mm 筛后，分别置于广口瓶中，于干燥器中保
收稿日期：2013-04-25
基金项目：河南省重点学科建设项目(10466-X-082301)
作者简介：高向阳（1949-），男，教授，E-mail：ndgaoxy@163.com
广东农业科学 2013 年第 11 期 21
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2013.11.040
存，备用。
酒石酸、苹果酸、柠檬酸、DL-苹果酸（分析纯）购于国
药集团化学试剂有限公司；α-酮戊二酸 (生化试剂)、L-乳
酸（分析纯）购于北京拜尔迪生物有限公司；乙酸、琥珀酸
（分析纯）购于天津市科密欧试剂有限公司；顺丁烯二酸
（分析纯）购于上海杉浦化工有限公司；磷酸、磷酸二氢铵
（分析纯）购于天津市大茂化学试剂厂。 实验用水为超纯
水。
仪器设备：Waters 515高效液相色谱仪（717Plus 自动
进样器，2487 紫外检测器，Empower 色谱工作站 ， 美国
Waters 公司）、pH21l 型酸度计 （意大利 HANNA 公司）、
SB-5200DT 超声波清洗器 （宁波新芝生物科技股份有限
公司疗器械厂）、101-2-S-Ⅱ型电热恒温鼓风干燥箱 （上
海跃进医疗器械厂）、FZ102 微型植物粉碎机（浙江上虞盛
科仪器制造有限公司）、Cary 3000 紫外可见分光光度计
（美国瓦里安公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 流动相的配制 10 mmol/L NH4H2PO4缓冲溶液：准
确称取 5.44 g 固体磷酸二氢铵， 用水溶解并定容至 1 L，
以磷酸调 pH值为 2.7后，用 0.45 μm水相滤膜过滤，超声
波脱气。
1.2.2 色谱条件 色谱柱：SunfireTM-C18 色谱柱 （4.6 mm
×250 mm，5 μm）， 以 10 mmol/L 磷酸二氢铵缓冲溶液
（pH=2.7）为流动相，流速 1.0 mL/min，紫外检测波长 210
nm，柱温 30℃，进样体积 10 μL
1.2.3 标准曲线的绘制 精确称取顺丁烯二酸 5 mg，抗
坏血酸、a酮戊二酸各 25 mg，酒石酸 50 mg，苹果酸、柠檬
酸各 100 mg，乳酸、乙酸、琥珀酸各 200 mg，用流动相溶解
并定容至 25 mL 棕色容量瓶中作为标准储备液， 经逐级
稀释配制为标准工作液和混合标准工作液，于 4℃冰箱保
存，使用前经 0.45 μm滤膜过滤后，分别取 10 μL进样，在
1.2.2 色谱条件下，平行进样 3次，以 3次峰面积均值为纵
坐标， 以浓度为横坐标， 由色谱工作站自动绘制工作曲
线，进行回归分析。
1.2.4 样品处理及测定 称取贼小豆样品 1.0000 g，置于
250 mL 锥形瓶中， 加入少量 10 mmol/L NH4H2PO4-H3PO4
缓冲溶液(pH=2.7)后浸泡 30 min，再加适量流动相于 30℃
超声萃取 30 min，抽滤，滤液用流动相定容为 25.00 mL。
9 000 r/min离心 10 min。 取上清液经 0.45 μm滤膜过滤，
滤液供上机分析。 每个样品 3次重复， 用外标法测定，取
平均值。
2 结果与分析
2.1 样品的前处理
2.1.1 样品提取方式的选择 精确称取 1.0000 g 同一贼
小豆样品 3 份，放入洁净 50 mL 比色管中，加入适量蒸馏
水，静置 20 min后，分别选择用 75℃水浴、超声波、摇床振
摇各提取 30 min，定容至 50 mL，过 0.22 μm滤膜后，进行
HPLC分析。 结果表明：用超声波浸提样品 30 min，有机酸
的分离效果较理想。
2.1.2 提取溶剂的选用 考察 35%、50％、70％乙醇水溶
液和水为溶剂的提取效果， 发现不同浓度乙醇和水的提
取效果无明显差异，为降低成本，选用水为溶剂。
2.1.3 提取时间的确定 选用同一样品， 以水为溶剂，按
1.2.4进行处理，考察超声波提取时间为 15、20、25、30、35、
40 min的浸提效果， 结果表明室温下用水提取 30 min 效
果较好。
2.2 色谱条件的选择
2.2.1 检测波长的选择 有机酸标准溶液用紫外可见分
光光度计进行光谱扫描表明：9 种有机酸在 210 nm 处附
近均有较强吸收，经色谱柱分离后，各峰间的分离度和峰
的重复性较好，且不受流动相中其他物质的干扰。 故选择
紫外检测器的检测波长为 210 nm。
2.2.2 柱温的确定 考察 25、30、35℃溶液对测定结果
的影响 ， 结果表明 ：25℃时酒石酸的色谱峰有部分重
叠 ，35℃时出峰时间会略微提前 ， 但琥珀酸分离效果
差，30℃时各酸分离效果较好。 因此， 本方法确定柱温
为 30℃。
2.2.3 流动相及 pH 值的确定 磷酸盐缓冲溶液是一种
弱酸电离抑制剂， 在紫外区几乎无吸收。 分别用 10、15、
20 mmol/L 磷酸二氢铵、 磷酸氢二铵为流动相进行试验，
结果表明：条件相同时，酒石酸、苹果酸在磷酸二氢铵中的
分离效果较好。故选用 10 mmol/L磷酸二氢铵缓冲液为流
动相。
分别考察流动相 pH 值为 2.4、2.5、2.6、2.7、2.9、3.0 时
的分离效果，结果表明：pH＞2.7 时，峰形较差，分离度变
小；pH＜2.7，各组分保留时间有所增加，色谱峰变窄，对称
性变好，但 pH值过低会影响色谱柱的使用寿命。 因此，确
定 pH 2.7的磷酸盐缓冲溶液为流动相。
2.2.4 流动相流速的确定 考察了流动相流速为 0.80、
1.00、1.20 mL/min 时的分离效果， 结果表明： 流速 1.00
mL/min 时系统压力适中，灵敏度较高，分离效果较好，本
试验确定流动相流速为 1.00 mL/min。
2.2.5 色谱峰分离效果 在 2.2.1～2.2.4色谱条件下，按分
析方法对有机酸标准混合液和贼小豆试液进行测定，得
到的色谱图如图 1所示。 由图 1可知，有机酸标样色谱图
（A）和贼小豆样品色谱图（B）在 2.2 色谱条件下分离效果
理想。
2.3 方法学分析
2.3.1 线性回归方程和检出限 准确配制 5 个不同浓度
的 9 种有机酸混标，按照上述色谱条件进样，以各有机酸
的峰面积（Y）为纵坐标，进样质量浓度（X）为横坐标，通过
色谱工作站进行回归分析，按照 3倍信噪比（3S/N）计算检
出限，结果如表 1所示。
由表 1可知：各有机酸标准溶液浓度和检测响应值的
相关系数在 0.9965~0.9998 之间，最低检测限为 0.12~6.00
mg/L。
2.3.2 精密度和加标回收率 按照 1.2.4 方法处理贼小
豆样品，并定量添加混合标准溶液，按 1.2.3 色谱条件各
进行 6 次平行测定检验无可疑值后取平均值报告。 根据
22
C M Y K
表 2 贼小豆样品有机酸的精密度和加标回收率
有机酸
酒石酸
苹果酸
抗坏血酸
乳酸
乙酸
α-酮戊二酸
柠檬酸
琥珀酸
顺丁烯二酸
测定值（mg/L）
127.534
61.153
2.048
1.135
0.000
0.000
366.261
213.262
160.502
添加量（mg/L）
100
100
20
20
100
20
200
400
200
测定结果（mg/L）
228.562
160.895
22.019
20.244
96.157
19.201
567.412
614.269
359.186
回收率（%）
101.10
99.74
99.85
95.54
96.15
96.01
100.57
100.25
99.34
RSD（%）
0.56
1.20
1.90
0.87
1.50
1.10
1.30
0.64
0.79
表 1 9种有机酸的保留时间、回归方程及检测限
有机酸
酒石酸（Tartaric acid）
苹果酸（L-Malic acid）
抗坏血酸（L-Ascorbic acid）
乳酸（Lactic acid）
乙酸（Acetic acid）
α-酮戊二酸（a-Ketoglutaric acid）
柠檬酸（Citric acid）
琥珀酸（Succinic acid）
顺丁烯二酸（Maleic acid）
保留时间（min）
6.06
7.71
8.58
9.37
10.05
12.92
14.97
17.87
24.97
线性方程
Y=5812.1X+600.2
Y=102.37X+717.29
Y=9402.8X+1647.2
Y=923.27X+3062.7
Y=531.09X-255.29
Y=81699X+137.43
Y=135.85X+336.84
Y=899.55X-159386
Y=119219X+5013.1
相关系数 r
0.9998
0.9994
0.9996
0.9993
0.9987
0.9998
0.9992
0.9965
0.9994
检出限（mg/L）
1.50
0.20
6.00
5.00
0.12
0.20
5.00
2.00
3.00
线性范围（mg/L）
2~50
2~800
2~80
2~800
2~1600
2~10
2~800
2~1600
2~50
测定数值分别计算相应的精密度和加标回收率， 结果如
表 2 所示。
由表 2 可知， 贼小豆样品中有机酸的平均回收率为
96.01％～101.10％，相对标准差 RSD为 0.56％～1.9％。
0.035
0.030
0.025
0.020
0.015
0.010
0.005
0
AU
酒
石
酸
苹
果
酸
Vc
乳
酸
乙
酸
α
酮
戊
二
酸
柠
檬
酸
丁
二
酸
顺
丁
烯
二
酸
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
保留时间（min）
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
AU
酒
石
酸
苹
果
酸
Vc 乳
酸
柠
檬
酸
丁
二
酸
顺
丁
烯
二
酸
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
A
B
图 1 有机酸标样（A）和贼小豆样品（B）的色谱图
保留时间（min）
23
C M Y K
表 3 贼小豆中有机酸的测定结果 （mg/g）
有机酸
酒石酸
苹果酸
抗坏血酸
乳酸
乙酸
α-酮戊二酸
柠檬酸
琥珀酸
顺丁烯二酸
累计总含量
2012 年 8月采收
18.377±0.006
3.058±0.023
0.152±0.013
0.090±0.002
16.313±0.006
8.663±0.007
8.691±0.002
55.344
2012 年 9 月采收
16.087±0.003
2.151±0.026
0.102±0.017
0.087±0.001
18.319±0.002
10.655±0.012
8.450±0.005
55.851
2012 年 10月采收
23.948±0.005
1.804±0.015
0.086±0.011
0.062±0.001
15.168±0.003
5.120±0.006
4.954±0.004
51.142
2012 年 11月采收
20.738±0.006
1.753±0.005
0.065±0.016
0.059±0.001
10.963±0.001
6.170±0.009
3.557±0.006
43.305
郑州绿豆
18.310±0.031
2.221±0.010
0.151±0.008
0.226±0.004
13.728±0.009
7.444±0.006
5.473±0.002
47.553
南阳绿豆
19.399±0.008
3.268±0.004
0.333±0.013
0.065±0.002
11.102±0.003
1.667±0.002
7.629±0.003
43.463
不同采收期有机酸含量
注：表中空格表示未检出。
2.3.3 保留时间和峰面积的重现性 对同一有机酸混
合标准溶液进行 6 次平行测定，对其保留时间、峰面积
和 9 种有机酸含量进行统计分析。 结果表明：各有机酸
保留时间的相对标准偏差均低于 0.45％；峰面积的相对
标准偏差均小于 2.1％，说明色谱工作条件稳定，重现性
良好。
2.3.4 有机酸试液的稳定性 取同一样品溶液， 按照色
谱条件和处理测定方法， 取上清液经 0.45 μm 滤膜过滤
后，分别于 0、2、4、8、12 h 进样。 结果表明：各峰相对保留
时间的 RSD 为 0.03%～0.25% ， 相对峰面积的 RSD 为
0.16%～1.8%，表明有机酸组分在 12 h内测定，测定信号较
为稳定。
2.4 测定结果
按照试验方法对贼小豆进行处理后， 用流动相定容，
经 0. 45 μm 滤膜过滤后进行有机酸的测定， 用外标法定
量，由仪器色谱工作站计算结果，如表 3所示。
由表 3 可知， 样品中的有机酸以酒石酸和柠檬酸为
主，占酸总量的质量百分数为 61.60％～76.48％，其次为琥
珀酸、 顺丁烯二酸， 占酸总量的质量百分数为 19.70％～
34.21％，含量较低的是苹果酸、抗坏血酸和乳酸；贼小豆
样品中未检出 α-酮戊二酸和乙酸， 对照样品绿豆中未检
出乳酸和乙酸。
2.5 不同采收期贼小豆中有机酸的动态含量变化特性
由表 3 可知 ，8 月下旬和 9 月下旬采集样品中所
测有机酸的总含量相对较高 ，10 月和 11 月则逐渐下
降 ，11 月下旬采集样品中所测有机酸的总含量与绿豆
对照样品相当 。 其中 ，苹果酸 、抗坏血酸 、乳酸和顺丁
烯二酸随采样时间的延长，含量逐渐下降；9 月下旬采
集样品中柠檬酸和琥珀酸含量较高 ， 以后逐渐下降 。
10 月下旬采集样品中酒石酸含量较高，11 月下旬有所
下降。
3 结论
通过对色谱条件的选择和优化， 建立了反相高效液
相色谱同时测定郑州地区野生贼小豆中 9 种有机酸的分
析方法。 结果表明，贼小豆样品中含有所测 9种有机酸中
的 7 种，其有机酸配比合理，适宜人体吸收利用。 样品中
的有机酸以酒石酸和柠檬酸为主， 占酸总量的 61.60％～
76.48％，其次为琥珀酸、顺丁烯二酸，占酸总量的 19.70％～
34.21％，为充分开发该自然野生资源和评价其营养价值、
口感风味提供科学参考。 该法简单、快捷、准确度和灵敏
度较高，仪器工作性能稳定，可在 25 min 内完成待测样品
中 9种有机酸的分离分析，样品测定的相对标准偏差均小
于 2.0％，回收率为 96.01％～101.10％。8月下旬和 9月下旬
采集样品中所测有机酸的总含量相对较高，9 月下旬采集
样品中柠檬酸和琥珀酸含量较高，10 月下旬采集样品中
酒石酸含量较高， 该野生自然资源有一定的食用开发价
值。
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芹菜叶面微生物吡哆醛还原酶的研究
雷 亮， 陶 朕， 徐 凡， 吴 媚
（安徽农业大学茶与食品科技学院， 安徽 合肥 230036）
摘 要：植物叶际有着丰富的生物多样性，是一个复杂的微生态系统，叶际表面微生物通过与宿主植物的互作，改善其栖居环
境并促进植物生长。 从芹菜叶际生态系统中分离得到吡哆醛还原酶（Pyridoxal Reductase，PLR），采用苯肼衍生方法检测其活性并
确定 PLR 的来源，对叶际表面微生物进行分离、计数，确定储藏过程中芹菜叶片表面微生物的变化情况，并对 PLR 的基本酶学性
质进行初步研究。 结果表明，PLR 主要来源于真菌，在相同菌浓度下，PLR 活性的强弱依次为真菌＞细菌＞放线菌。 该酶的最适温度
为 37℃，最适反应 pH 值为 7.5，并且在 NADPH 的参与下，其催化活性显著提高。
关键词：芹菜； 叶际微生物； 吡哆醛还原酶； 酶性质
中图分类号：S-3；Q554+.2 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2013）11-0025-04
Study on Pyridoxal reductase of phyllosphere
microbe from celery leaf
LEI Liang, TAO Zhen, XU Fan, WU Mei
(College of Tea & Food Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)
Abstract: The phyllosphere is a complicated microecological system where colonized by a variety of Microorganism. The epiphytes
could improve the dwelling environment and promote the growth of plant through interaction with the host plant. The Pyridoxal Reductase
(PLR)isolated from ecosystem of celery leaf, and determine the sources of the PLR with the phenylhydrazine derivative method.
Separation and counts of the microorganism separated from celery leaf, determine the changes of microorgenism at the different storage
condition, and study on the enzymatic properties of PLR. The results showed that PLR was mainly derived from the fungus of celery leaf
surface. The intensity of the PLR activity was fungi >bacteria > actinomycetes at the same bacteria concentration. The enzyme had an
optimal temperature and pH at 37℃ and 7.5. PLR showed a higher catalytic activity of reduction of PL with NADPH.
Key words: celery; phyllosphere microbial; Pyridoxal reductase; enzyme properties
1981年 Blackeman[1]将叶围微生物的概念引入微生物
生态学。 人们把微生物群落附着的叶面微环境域称为“叶
际（phyllosphere）”，而生存在其上并可以定居和增殖的微
生物群体被称为“叶际微生物（epiphytes）”[2-3]，叶际微生物
作为微生物分子生态学一个新兴的研究领域， 已经引起
人们的广泛关注。 吡哆醛还原酶 （Pyridoxal reductase，
PLR）首先在粟酒裂殖酵母 [4]和啤酒酵母 [5]中发现，该酶在
NADPH 的参与下， 催化还原吡哆醛生成吡哆醇， 在 Vb6
代谢过程中起着重要作用。 1999 年，Mitsuhiro 等 [6]采用疏
水层析（Butyl-Toyopearl）、亲和层析（Orange A）及离子交
换层析（DEAE-Toyopearl）等方法从酵母中纯化出 PLR，得
出 PLR为醛糖还原酶家族中的一员。 2011年，Sonia 等[7]首
先从拟南芥中提取到 PLR 基因片段并在酵母中成功表
达，证实 PLR参与植物体内 VB6的补救合成途径。 本文对
芹菜叶表面微生物进行分离筛选， 鉴定各种菌中 PLR 的
活性，确定 PLR的主要来源，并对这个酶进行酶学性质的
初步分析，为进一步研究叶面微生物与芹菜之间的相互影
响关系提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
收稿日期：2013-03-15
作者简介：雷亮（1987-），男，在读硕士生，E-mail：ll9640@163.
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广东农业科学 2013 年第 11期 25
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