全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#""")("!$
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,
*-../*#""")("!$*!"#$*#!*!%$$
收稿日期$
!"#$)"0)#(
&修改稿收到日期$
!"#$)#")"#
基金项目$国家自然科学基金"
%#!+!(1#
!
%"1+!#%0
#&教育部高等学校博士学科点专项科研基金"
!"#!(("(##""##
#
作者简介$钟天秀"
#10&
#!女!博士!主要从事牧草生物技术育种的工作
2)34-5
$
678/
9
:-/;-
!
#%*<83
"
通信作者$解新明!博士!教授!博士生导师!主要从事草业生物技术研究
2)34-5
$
:-=:3;.
!
.<4>*=?>*华南象草
1
2
$34
基因的克隆及其
转基因烟草木质素含量分析
钟天秀!李有涵!李
!
菲!彭小群!柯善文!陈
!
曙!解新明"
"华南农业大学 林学与风景园林学院草业科学系!广东省草业工程技术研究中心!广州
$#"(!
#
摘
!
要$为探究华南象草"
!"##$%"&(
)
*
)
*"(<@*A>4/4/
#木质素合成关键酶基因的调控机制!通过同源克隆得
到华南象草
()
香豆酸$
B8C
连接酶基因"
!
)
(+,
#的
序列!长度为
#1(%;
F
!其中编码区序列
#!;
F

G
F
(BH
蛋白由
$$%
个氨基酸组成!分子量为
$1*$+ID
!等电点为
$*!
!属于疏水性蛋白该蛋白含有
CJG
结合结
构域!属于
CKDB54..
"
超家族在系统进化分析中!
G
F
(BH
与
CL(BH#
(
M.(BH#
遗传距离最近!聚为一支
G
F
(BH
氨基酸序列具有
NNOPOHGQOR
和
O2SBSTO
等
!
个保守基序!是典型的植物
(BH
构建原核表达载体
F
O2U)(+,
!得到约
00ID
的
G
F
(BH)ONP
融合蛋白!为
G
F
(BH
酶活性测定及
V=.L=W/
免疫印迹分析奠定了基础
同时构建植物表达载体
F
XC)(+,
!并通过叶盘法对烟草进行了遗传转化!得到
%
个转基因阳性株系"
MU)1
(
MU)+
(
MU)(
#!它们中叶柄木质素总含量分别比非转基因植株"对照#提高了
#"*"Y
(
#*!Y
和
1(*Y
!茎秆基部节木质素
总含量分别比对照提高了
"*1Y
(
*"Y
和
#%*$Y
研究结果表明!
G
F
(BH
蛋白与木质素合成有关!过表达
!
)
(+,
基因能够显著提高植株木质素含量该研究结果为华南象草木质素改良工作打下了基础!同时也为深入开展牧草
分子育种提供了依据
关键词$华南象草&木质素&
(+,
基因&转基因烟草
中图分类号$
Z+0$
&
Z+01
文献标志码$
C
%&"()#"*"+$,-"./(0()12"34#
5
(&161*1+0"/1)//-5)#67
2
6(
2
6()67
-789.(*(*(*!4#
5
*#*2"*)1*)3*(
:
&#&"+;0(*&
5
1*#-;"<(--"=(*)&
[AMEOP-4/:->
!
HS\8>74/
!
HSK=-
!
G2EOU-48
]
>/
!
Q2N74/^ =/
!
BA2EN7>
!
US2U-/3-/
9
"
"
B85=
9
=8_K8W=.LW
`
4/?H4/?.<4
F
=CW<7-L=W=
!
N8>L7B7-/4C
9
W-<>5L>W45a/-@=W.-L
`
!
O>4/
9
?8/
9
2/
9
-/==W-/
9
T=.=4W<7B=/L=W
8_OW4..54/?N<-=/<=
!
O>4/
9
678>$#"(!
!
B7-/4
#
3<&)0(-)
$
A>4/4/=5=
F
74/L
9
W4..
"
!"##$%"&(
)
*
)
*"(<@*A>4/4/
#
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`
>.=?4._8W4
9
=-/N8>L7
B7-/4*SL-.45.847-
9
75
``
-=5?-/
9
=/=W
9`
F
_8W=L74/85
F
W8?>!
L7=5-
9
/-/-/5-
9
/8<=5>58.=
-/7-;-L.L7=4`
8_;-8<8/@=W.-8/*S/8W?=WL8=:
F
58W=L7=5-
9
/-/W=
9
>54L-8//=L^ 8WI
!
=^-.854L=?()<8>)
34W4L=B8C5-
9
4.=
"
(BH
#
_W83!-
)
*
)
*"(<@*A>4/4/*C#1(%;
F
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>=/<=8_!
)
(+,
9
=/= 4^.
<58/=?;
`
783858
9`
);4.=?TP)GBT*!
)
(+,74.4/8
F
=/W=4?-/
9
_W43=8_#!;
F
4/?=/<8?=.4$$%43-/8
4<-?
F
W8L=-/ -^L74
F
W=?-54W34..8_$1*$+ID4/?4-.8=5=F
8-/L8_$*!*G
F
(BH
F
W8L=-/-.4
7
`
?W8
F
78;-/
F
W8L=-/
!
4/?;=58/
9
.L8CKD<54..S.>
F
=W_43-5
`
4.-L<8/L4-/.4/CJG;-/?-/
9
?834-/*S/
F
7
`
58
9
=/=L-!
G
F
(BH 4^.<5>.L=W=? -^L7CL(BH#4/?M.(BH#*P^ 8<8/.=W@=?38L-_.
!
NNOPOHGQOR
4/?O2SBSTO
!
=^W=_8>/?-/G
F
(BH
!
-/?-<4L-/
9
L74L-L 4^.4L
F`
-<45
F
54/L(BH*P7=
F
O2U)(+,
F
W8I4W
`
8L-<
=:
F
W=..-8/@=99
=?G
F
(BH_>.-8/
F
W8L=-/ -^L7L7=385=<>54W34..8_00ID
4^.8;L4-/=?*P7-.W=.>5L54-?_8>/?4L-8/_8WL7= =^.L=W/;58L4/?=/6
`
3858
9`
4/45
`
.-.*P7=8@=W=:
F
W=..-8/
@=F
XC)(+, 4^.<8/.LW>!
4/?L7W==
F
8.-L-@=LW4/.
9
=/-`
5=4_
?-.<3=L78?*S/
F
=L-85=
!
4<=L
`
5;W83-?=5-
9
/-/<8/L=/L 4^.
9
W=4L=W;
`
4
FF
W8:-34L=5
`
#"Y-/MU)1
!
#*!Y-/
MU)+
!
1(*Y-/MU)(<83
F
4W=? -^L7VP
F
54/L.*C/?-/;4.=.L=3
!
L7=L7W==LW4/.
9
=/-<
F
54/L.74?"*1Y
!
(*"Y4/?#%*$Y 38W=4<=L
`
5;W83-?=5-
9
/-/<8/L=/LL74/BQ
F
54/L
!
W=.
F
=`
*S/<8/<5>.-8/
!
8@=W=:)
F
W=..-8/8_!
)
(+,-/L8;4<<85=4?=?L8-/9
8_5-
9
/-/<8/L=/L
!
L7>.
!
!
)
(+, 4^.W=54L=?L85-
9
/-/;-8)
.
`
/L7=.-.*P7-.W=.=4W<7
F
W8@-?=..<-=/L-_-<;4.-._8W5-
9
/-/-3
F
W8@=3=/L-/=5=
F
74/L
9
W4..4/?385=<>54W
;W==?-/
9
-/_8W4
9
=
9
W4..*
>1
:
?"0!&
$
=5=
F
74/L
9
W4..
"
!"##$%"&(
)
*
)
*"(<@*A>4/4/
#&
5-
9
/-/
&
(+,
9
=/=
&
LW4/.
9
=/-!!
象草"
!"##$%"&(
)
*
)
*"(
#又被称为紫狼
尾草!是禾本科"
G84<=4=
#狼尾草属多年生丛生大型
草本!原产于非洲!后被广泛引种到世界各地大部分
热带及亚热带地区)#*象草生长完全时高达
%3
以
上!是生物量最高的草本植物之一!其干物质产量高
达
01*(L
%
73
!
!被认为是提供木质纤维素的优秀能
源植物)!)%*同时!象草因其较好的营养品质和良好
的适口性!作为中国南方地区重要的牧草资源)()$*
牧草中含有的粗纤维对牛等草食家畜是非常重要
的!因为纤维能使家畜产生饱腹感!同时刺激消化
道!促进肠道蠕动和粪便排泄粗纤维不是一个确
切的化学实体!只是在公认强制条件下测出的概略
养分!其中以纤维素为主!还包括半纤维素和木质
素)*粗纤维的消化率是评价牧草营养品质的主要
指标之一干物质可消化性每增加
#Y
!牲畜毛重
就可增加
%*!Y
)
+
*
其中!木质素通过充当机械屏
障而影响微生物对纤维多糖的降解!已被证明是限
制牧草消化的因素)0*在象草作为能源草提供木质
纤维素获得乙醇和生物气体等的过程中!木质素的
含量仍然是限制其利用的主要因素!因为木质纤维
素由木质素(纤维素(半纤维素相互交联形成!其中
木质素对纤维素有保护作用!使得纤维素难以被分
离降解!从而影响生物乙醇等发酵过程所以!在象
草育种中!对木质素含量进行调控不仅能改变其营
养品质!提高家畜的产量和质量!还能促进其作为能
源草的发展
()
香豆酸$辅酶
C
连接酶"
(BH
#参与了木质素
合成苯丙烷途径的最后一步反应!是木质素合成过
程的限速酶!它催化香豆酸形成相应的
B8C
酯类
利用反义
TEC
技术!将紫穗槐"
.(/*
)
01
2
*&$3/4
%1
#反义
(+,
基因转入烟草中!最终导致烟草木质
素含量下降
!1*Y
#
(#*!Y
)
1
*
利用反义
TEC
技
术抑制三倍体毛白杨"
!/
)
5%&/("#&/%1
#
(+,
基
因的表达!导致植株木质素总量下 降 最 高 达
(#*+%Y
!并且木质素下调后的植株茎秆呈现红褐
色)#"*抑制了
(+,
表达量的毛白杨植株木质化程
度降低!叶片数量(株高等性状均优于对照!反义
(+,
基因并未影响植株的生长!甚至会促进生
长)##*在反义
(+,
烟草植株中!
(BH
蛋白表达量
下降!茎秆木质化程度降低!并且伴随茎秆木质部细
胞的畸变)#!*通过
TEC-
技术!下调拟南芥"
.*14
6$7/
)
%$%&015$1#1
#
(+,#
和
(+,!
基因表达量!导致
植株木质素总量下降
+*Y
#
#0Y
!并伴随纤维素
含量的提高)#%*通过
TEC-
技术下调毛白杨
(+,#
和
(+,!
基因表达!导致植株木质素总含量的下降!
其中
O)
木质素降低明显!但对植株正常生长没有影
响)#(*利用
TEC-
技术下调柳枝稷
!8(+,#
基因
表达量!使植株木质素的含量下降了
#+Y
#
%!Y
!
同时
O
%
N
木质素比例下降!茎秆及叶脉出现红褐
色)#$*由此可见!下调植物
(+,
基因表达量!能够
有效降低植株木质素含量!同时改变木质素单体组
成比例!并且不影响植物正常生长另外!
(+,
表
达受到抑制后!植株茎秆出现红褐色板块!这种现象
可作为转基因植株的鉴定手段之一
本研究以华南象草"
!"##$%"&(
)
*
)
*"(
<@*A>4/4/
#为研究对象!克隆了华南象草木质素合
成关键基因
!
)
(+,
!对该基因进行了生物信息学分
析!并且对
G
F
(BH
蛋白进行了原核诱导表达!最后
通过转基因技术获得过表达
!
)
(+,
基因的转基因
烟草植株!分析了转基因烟草中木质素含量的变化
#
!
材料和方法
@*@
!
试验材料
本研究实验材料为华南象草!取自华南农业大
学草业科学系引种园植物遗传转化研究材料为烟
草"
9$3/&$1#1&1613(
#
Q%!
!为本实验室保存
@*A
!
基因克隆
本实验室在先前的研究中已经 克隆得到
$%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
!)
(+,
基因的部分
片段约
#!"";
F
)
#
*
本
工作根据该已知序列设计了特异性下游引物
G
F
(BH)T
"
$b)OCOPPOCOBOCOPCOCPOPOO)
%b
#!根据禾本科植物
(+,
基因
片段
$b
端
CPO
处保守序列!设计了上游引物
G
F
(BH)K
"
$b)
COCPOOOPPBBOPOOCBOBO)%b
#以 华 南 象
草
为模板进行
GBT
扩增!
GBT
产物经胶回
收后直接送到上海英骏生物技术公司测序
TEC
提取及
合成分别采用超纯
TEC
提取试剂盒
"北京康为世纪生物科技公司#和
TECGBTQ-L
"
CJR
#
R=W*%*"
"宝生物生物工程有限公司#胶
回收试剂盒采用快速琼脂糖凝胶
DEC
回收试剂盒
"北京康为世纪生物科技公司#!具体操作按照相应
说明书进行
@*B
!
生物信息学分析
利用
EBXS
的
X54.L/
和
X54.L
F
对核苷酸序列
和氨基酸序列进行检索或比对分析&应用
N<4/
F
W8.)
-L=
在线软件预测蛋白保守结构域&使用
B5>.L45V
对核酸或氨基酸序列进行比对分析&利用
J2OC
$*"
进行氨基酸序列系统进化树的构建!用邻接法
进行进化树构建!并用
X88L.LW4
F
校正&应用
GW8L)
G4W4
对蛋白的基 本理化特 征 进 行 分 析&利 用
GW8L.<45=
对蛋白的亲疏水性进行分析&应用
PJ)
F
W=?
对蛋白的跨膜结构域进行预测
@*$
!
原核表达载体的构建及表达
设计象草
!
)
(+,
基因上游引物
(X43)K
"
$b)
BOOOCPBBCPOOOPPBBOPOOCB)%b
!划 线 处
为
:1(A
"
酶切位点#和下游引物
(2<8)T
"
$b)BO)
OCCPPBPBCOPOOCBOBBCOB)%b
!划 线 处 为
;3/T
"
酶切位点#通过
GBT
反应获得
!
)
(+,
基
因
BDN
序列!用
#Y
琼脂糖凝胶电泳检测以
F
O2U)G)#
为目标载体!通过
:1(A
"
和
;3/T
"
酶切位点!将
!
)
(+,
基因
BDN
序列插入载体!将连
接产物转化大肠杆菌
P8
F
#"
!通过菌液
GBT
鉴定重
组子菌液
GBT
所用引物分别为
O2U$)K
"
$b)
OOBPOOBCCOBBCBOPPPOOPO)%b
#和
O2U$)
T
"
$b)BOBOCOOBCOCPBOPBCOPBC)%b
# 对
阳性重组子进行测序"上海英骏生物技术公司#和双
酶切鉴定重组质粒鉴定完成之后!热激法转入
XH!#
菌种中!
!c!""W
%
3-/
摇菌
!7
进行融合蛋
白的诱导表达!利用细菌蛋白抽提试剂盒"北京康为
试剂生物科技公司#对诱导蛋白进行提取!最后通过
NDN)GCO2
对获得的蛋白进行电泳和染色
@*C
!
过表达载体构建及烟草遗传转化
设计象草
!
)
(+,
基因
上游引物
BHU)
;4)K
"
$b)PBPCOCCPOOOPPBBOPOOCBOBOP)
BOP)%b
!划线处为
<61
"
酶切位点#和下游引物
BHX43)T
"
$b)OOCPBBPBCOPOOCBOBBCOBO)
OBOCOB)%b
!划线处为
:1(A
"
酶切位点#通过
GBT
反应获得
!
)
(+,
基因
BDN
序列!用
#Y
琼脂
糖凝胶电泳检测以
F
XC""!
%
%AC
为载体"细菌筛
选标记为
N
F
=W
!植物筛选标记为
X4W
#!通过
<61
"
和
:1(A
"
酶切位点!将
!
)
(+,
基因
BDN
序列插
入载体!从而构建
F
XC)(+,
过表达载体重组质粒
经过测序和双酶切鉴定后!通过冻融法转化进农杆
菌
2AC#"$
中!利用烟草叶盘转化法获得转基因植
株!最后通过
GBT
和
TP)GBT
对植株进行鉴定
以引 物
F
XC)K
"
$b)CPOBBPBPOBBOCBCOPO)
OP)%b
#和
F
XC)T
"
$b)OOOCCCPPBOCOBPBCB)
PCO)%b
#!以及
X4W)K
"
$b)BOCBPOBBCOCCCB)
BBCBOP)%b
#和
X4W)T
"
$b)BPOBCBBCPBOPBCC)
BBCBP)%b
#!分别鉴定
!
)
(+,
基因和
:1*
基因片
段
TP)GBT
鉴定阳性植株所用引物为
TPBH)K
"
$b)OPBOPBOCOCPBOBBCCOCO)%b
#和
TPBH)
T
"
$b)OOOCPOOCOPBOOPOCCOCCCCB)%b
#
@*D
!
转基因植株木质素组织化学染色及含量测定
利用赵华燕等)#+*研究中提到的
V-=./=W
和
Jd>5=
染色方法对植物组织的木质部进行特异性染
色利用溴乙酰法)#0*测定木质素总含量!在
MD
!0"
测得吸光值!根据木质素标准曲线回归方程求得木
质素含量
!
!
结果与分析
A8@
!
1
2
$34
基因克隆与蛋白特性分析
本研究以前期获得长约
#!"";
F
!
)
(+,
基因
片段为基础!根据禾本科植物
(+,
基因
端
CPO
处保守序列设计上游引物!通过
GBT
扩增!获
得
!
)
(+,
基因
端序列!约
+$";
F
"图
#
#
图
#
!
!
)
(+,
基因
端序列扩增
J*DH!"""
&
#*$b
端
GBT
扩增产物
K-
9
*#
!
$b=/?43
F
5-_-<4L-8/8_!
)
(+,J*DH!"""
&
#*GBT
F
W8?>F
5-_-<4L-8/
+$%!
#!
期
!!!!!!!!
钟天秀!等$华南象草
!
)
(+,
基因的克隆及其转基因烟草木质素含量分析
拼接后获得全长
#1(%;
F
的基因序列!其中编码区
序列
#!;
F
!
OB
含量为
*+Y
!
O=/X4/I
登录
号
eE10"1+"*#
"图
!
#该基因共编码
$$%
个氨基
酸!其中丙氨酸
C54
"
##*(Y
#含量最高!色氨酸
PW
F
"
*!Y
#含量最低该蛋白分子量为
$1*$+ID
!理论
等电点为
$*!
!不稳定系数为
%$*+
!属于稳定蛋白
利用
GW8L.<45=
在线预测工具分析
G
F
(BH
蛋白
的亲疏水性!表明该蛋白属于疏水蛋白利用
PJ)
F
W=?
软件预测
G
F
(BH
蛋白存在跨膜结构!可能定
位在细胞内膜结构上
A8A
!
=
E
$24
蛋白结构域分析和同源性比较
N<4/
F
W8.-L=
在线软件预测表明!
G
F
(BH
蛋白具
有一个
CJG;-/?-/
9
位点"氨基酸残基
#10
#
!"1
#!
属于
CKDB54..
"
超家族
X54.L
F
搜索
O=/X4/I
数据库!发现
G
F
(BH
与柳枝稷"
!1#$3(=$*
>
14
&(
#
G@(BH#
(玉米"
?"1(1
@
%
#
[3(BH
(水稻"
A*
@
4
B1%1&$=1 @4W*
C
1
)
/#$31
9
W8>
F
#
M.(BH%
(黑麦草
"
,/5$(
)
"*"##"
#
H
F
(BH%
和水曲柳"
D*1E$#%
图
!
!
!
)
(+,
基因
编码区序列
K-
9
*!
!
M
F
=/W=4?-/
9
_W43=8_!
)
(+,(1#7%0*$31
#
K3(BH(
有较高相似性"
1#Y
#
$Y
#
序列比对表明"图
$
#!不同
(BH
氨基酸序列在长度上
有一定差异!但一些序列具有高度保守性!如
KT)
NQHGD
(
RCHG\NNOPPOHGQORJH
和
HG\NNOP)
POHGQ
等其中!
HG\NNOPPOHGQ
是一个保守基
序!能够使
(BH
在
CPG
和
J
9
!f作用下!催化底物形
成相应的
B8C
酯!并最终形成
CJG

A8B
!
=
E
$24
蛋白的系统进化树分析
(BH
蛋白在植物基因组中一般以基因家族的
形式存在分别从
!"
种植物中选取了
%!
条序列采
用
J2OC
软件中的邻接法"
/=-
9
7;8W)
,
8-/-/
9
#构建
进化树结果"图

#表明!各物种
(BH
蛋白被分为
两大类群!第一个分枝中包含火炬松"裸子植物#(双
子叶植物(单子叶植物而第二个分枝由单子叶和
双子叶植物组成
G
F
(BH
与拟南芥(水稻中的
(BH#
聚为一支!说明
G
F
(BH
应该属于
(BH#
蛋白
家族
"
"图

#
A8$
!
=
E
$24
蛋白的原核诱导表达
本研究以
F
O2U)G)#
载体为原核表达载体!将
!
)
(+,
基因
BDN
序列插入载体"图
%
#!构建了
G
F
(BH
原核表达载体
F
O2U)(+,
利用检测引物
对重组子进行
GBT
鉴定!
GBT
结果"图
(
#表明!在
重组载体中均能扩增出
#*I;
的
!
)
(+,BDN
序
列"图
(
#!
!
)
(+,
编码区序列已成功插入到载体
中为进一步对阳性重组载体进行鉴定!对
F
O2U)
(+,
进行了双酶切鉴定和测序
F
O2U)(+,
载体
图
%
!
!
)
(+,BDN
序列扩增
J*DH!"""
&
#*G
F
(BHBDN
K-
9
*%
!
BDN43
F
5-_-<4L-8/8_!
)
(+,
J*DH!"""
&
#*GBT43
F
5-_-<4L-8/
F
W8?>图
(
!F
O2U)(+,
载体构建的
GBT
鉴定
J*DH!"""
&
#
#
%
$重组载体
GBT
鉴定产物
K-
9
*(
!
GBT-?=/L-_-<4L-8/8_@=F
O2U)(+,
J*DH!"""
&
#&%*GBT43
F
5-_-<4L-8/
F
W8?>8_W=<83;-/4/L
F
54.3-?
0$%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
不同物种
(BH
氨基酸序列比对
黑色实线标出的为保守的结构域
K-
9
*$
!
C3-/84<-?3>5L-
F
5=45-
9
/3=/L8_(BH_W83?-__=W=/L.
F
=<-=.
P7=;54F
W=.=/L<8/.=W@=?38L-_
经
;3/T
"
和
:1(A
"
双酶切后可得到
#*I;
的片
段"图
+
#!表明
F
O2U)(+,
载体构建成功将
F
O2U)(+,
载体转入大肠杆菌
XH!#
中进行原核蛋
白诱导!
F
O2U)(+,
载体原核诱导后将产生带有
ONP
标签的
G
F
(BH
融合蛋白蛋白诱导表达后!
在蛋白提取过程的水相中未能检测到
(BHfONP
融合蛋白!推测
(BH)ONP
融合蛋白可能以包涵体
形式存在于沉淀物中进一步将沉淀用包涵体溶解
液进行处理后!得到了约
00ID
的
(BH)ONP
融合
蛋白"图
0
#!其中包括
$1*$ID
的
G
F
(BH
蛋白和
!1
ID
的
ONP
蛋白!这个结果与理论预期结果相一致
A8C
!
转
1
2
$34
基因烟草植株的获得
以
F
XC""!
%
%AC
载体为植物表达载体!利用
<61
"
和
:1(A
"
两个酶切位点!将
!
)
(+,
基因编
码区序列插入载体!构建了过表达载体
F
XC)(+,

对重组子载体进行了
GBT
鉴定"图
1
#和双酶切鉴
1$%!
#!
期
!!!!!!!!
钟天秀!等$华南象草
!
)
(+,
基因的克隆及其转基因烟草木质素含量分析
图

!
基于不同物种
(BH
氨基酸序列构建的系统进化树
树形图中分叉点处数值为重复
#"""
次
X88L.LW4
F
校正值&标尺为遗传距离
K-
9
*
!
G7
`
58
9
=/=L-9
/3=/L8_L7=43-/84<-?.=
]
>=/<=.8_(BH_W83?-__=W=/L
F
54/L.
F
=<-=.
P7=@45>=.4LL7=-/L=W-8W/8?=.4W=L7=;88L.LW4
FF
=W<=/L4
9
=.?=W-@=?_W83#"""W=
F
5-<4L=.*P7=.<45=;4WW=
F
W=.=/L.
9
=/=L-图
+
!F
O2U)(+,
的双酶切鉴定
J*DH$"""
&
#*
F
O2U)(+,
载体双酶切产物
K-
9
*+
!
D8>;5==/6
`
3=?-
9
=.L-8/8_@=F
O2U)(+,
J*DH$"""
&
#*2/6
`
3=?-
9
=.L-8/
F
W8?>F
54.3-?
定"图
#"
#!鉴定结果表明!
!
)
(+,
编码区序列已插
入到目的载体中通过农杆菌侵染法转化烟草!获
得转化植株!通过
GBT
和
TP)GBT
方法鉴定阳性
植株提取成熟叶片
DEC
!利用除草剂抗性基因
"
X4W)K
%
X4W)T
#和
!
)
(+,
插入片段两端引物"
XC)
K
%
XC)T
#对转基因植株进行
GBT
鉴定结果表明!
1
个株系中仅
MU)(
(
MU)+
和
MU)1
株系能够扩增出
#*I;!
)
(+,
片段"图
##
!
C
#和
"*(I;61*
基因片
段"图
##
!
X
#!说明
MU)(
(
MU)+
和
MU)1
株系为阳
性株系在后续的研究中以假阳性株系
MU)#
为对
照进行分析研究为了进一步对转基因株系在转录
水平进行鉴定!本研究利用
TP)GBT
对阳性株系进
行了鉴定提取了对照和
%
个阳性株系
TEC
!并反
图
0
!
(BHfONP
融合蛋白的诱导表达
J*
广谱蛋白
J4WI=W
&
#*
F
O2U)G)#
诱导表达的
ONP
蛋白"阳性
对照#&
!*
未经诱导的
F
O2U)G)#
"阴性对照#&
%*
F
O2U)(BH
诱导
表达的
ONP)(BH
融合蛋白&
(*
未经诱导的
F
O2U)(BH
&
$*
经诱导
表达的
ONP)BCD
融合蛋白"平行对照#&
*
未经诱导的
F
O2U)BCD
K-
9
*0
!
S/?><=?=:
F
W=..-8/8_ONP)L4
99
=?
G
F
(BH_>.-8/
F
W8L=-/
J
$
F
W8L=-/34WI=W
&
#*S/?><=?ONP
F
W8L=-/8_
F
O2U)G)#
@="
F
8.-L-@=<8/LW85
#&
!*E8-/?><=LW=4L3=/L8_
F
O2U)G)#
@="
/=
9
4L-@=<8/LW85
#&
%*ONP)L4
99
=?G
F
(BH_>.-8/
F
W8L=-/
4^.-/?><=?8_
F
O2U)(+,@=&
(*E8-/?><=LW=4L3=/L8_
F
O2U)(+,@=&
$*ONP)L4
99
=?BCD_>.-8/
F
W8L=-/ 4^.
-/?><=?8_
F
O2U)BCD@="
F
4W45=5<8/LW85
#&
*E8-/?><=LW=4L3=/L8_
F
O2U)BCD@="%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
1
!F
XC)(+,
载体构建的
GBT
鉴定
J*DH!"""
&
#*
F
XC""!
%
%AC
"阴性对照#&
!*
F
JD)(+,
"阳性对照#&
%
#
#$*
重组子载体的
GBT
扩增!其中
#"
(
#!
(
#(
(
#$
为阳性重组子
K-
9
*1
!
GBT-?=/L-_-<4L-8/8_
F
XC)(+,@=J*DH!"""
&
#*
F
XC""!
%
%AC
"
/=
9
4L-@=<8/LW85
#&
!*
F
JD)(BH
"
F
8.-L-@=<8/LW85
&
%&#$*GBT43
F
5-_-<4L-8/
F
W8?>F
XC)(+,W=<83;-/4/L@=?-/
9
#"
!
#!
!
#(4/?#$_8>W
F
8.-L-@=W=<83;-/4/L
F
54.3-?.
图
#"
!F
XC)(+,
载体的双酶切鉴定
J*DH!"""
&
#
(
!*
F
XC)(+,
载体双酶切产物
K-
9
*#"
!
D8>;5==/6
`
3=?-
9
=.L-8/8_@=F
XC)(+,
J*DH!"""
&
#
!
*2/6
`
3=?-
9
=.L-8/
F
W8?>8_W=<83;-/4/L
F
54.3-?
转录为
!利用检测引物"
TPBH)K
%
TPBH)T
#
进行了
TP)GBT
鉴定结果表明!
MU)(
(
MU)+
(
MU)
1
株系
均能扩增出
++";
F
的片段!
!
)
(+,
能够在烟草中转录表达"图
#!
#
A8D
!
转
1
2
$34
基因烟草植株木质素的组织化学染
色及木质素含量的测定
本研究利用
V-=./=W
和
Jd>5=
两种染色法对
转基因株系的叶柄和茎秆基部切片进行了染色经
过
V-=./=W
染色处理!植物组织中木质化组织将被
染成紫红色!紫红色越深则代表木质素含量越高
从图
#%
!
C
中可以看出
MU)(
(
MU)+
和
MU)1
株系叶
柄木质部细胞被染成深紫红色!而对照的木质部细
胞则是较浅的紫红色!这表明
MU)(
(
MU)+
和
MU)1
株系叶柄木质素含量高于对照!而且对照与阳性转
基因株系在叶柄木质部细胞形态上没有明显差异
经
Jd>5=
染色处理后!
N
木质素被染成红色!
O
木质
素被染成棕色植物组织着色程度越深!则表明木
质素含量越高由
Jd>5=
染色结果可看出"图
#%
!
X
#!
%
个阳性转化株系叶柄木质化细胞均被染成棕
黄色!表明木质部细胞中可能主要含有
O
木质素!
而
N
木质素含量较低
MU)(
株系木质部细胞着色
明显比其他株系深!其木质部细胞被着色为深棕色!
表明
MU)(
木质素含量较高
木质素含量测定结果表明!对照中"
BQ
#叶柄木
图
##
!
!
)
(+,
过表达烟草株系的
GBT
鉴定
C*!
)
(+,
片段
GBT
鉴定&
X*:1*
基因片段
GBT
鉴定&
J*DH!"""
&
#*
未转化烟草植株
DEC
"阴性对照#&
!*
F
XC)(BH
"阳性对照#&
%
#
##*
转基因株系!其中

(
1
(
##
为阳性转化株系
K-
9
*##
!
GBT-?=/L-_-<4L-8/8_!
)
(+,
8@=W=:
F
W=..-8/L8;4<<8
F
54/L.
C*GBT43
F
5-_-<4L-8/
F
W8?>)
(+,
9
=/=
&
X*GBT
43
F
5-_-<4L-8/
F
W8?>9
=/=
&
J*DH!"""
&
#*GBT
43
F
5-_-<4L-8/
F
W8?>/LW4/._8W3=?L8;4<<8
F
54/L.
"
/=
9
4L-@=<8/LW85
#&
!*GBT43
F
5-_-<4L-8/
F
W8?>F
XC)(+,@="
F
8.-L-@=<8/LW85
#&
%&##*GBT
-?=/L-_-<4L-8/8_LW4/._8W3=?L8;4<<85-/=.L74L
-/<5>?-/
9

!
14/?## =^W=
F
8.-L-@=LW4/._8W3=?5-/=.
图
#!
!
!
)
(+,
过表达烟草
TP)GBT
鉴定
J*DH!"""
&
#*MU)#
"阴性对照#&
!
#
(*MU)(
(
MU)+
和
MU)1
"阳性株系#
K-
9
*#!
!
TP)GBT-?=/L-_-<4L-8/8_!
)
(+,
8@=W=:
F
W=..-8/L8;4<<8
F
54/L.
J*DH!"""
&
#*MU)#
"
/=
9
4L-@=<8/LW85
#&
!&(*MU)(
!
MU)+4/?MU)1
"
L7W==
F
8.-L-@=5-/=.
#
#%!
#!
期
!!!!!!!!
钟天秀!等$华南象草
!
)
(+,
基因的克隆及其转基因烟草木质素含量分析
图
#%
!
!
)
(+,
过表达烟草叶柄
V-=./=W
"
C
#和
Jd>5=
"
X
#染色
K-
9
*#%
!
V-=./=W
"
C
#
4/?Jd>5=
"
X
#
.L4-/-/
9
8_
F
=L-85=8_!
)
(+,)8@=W=:
F
W=..-8/L8;4<<8
F
54/L.
图
#(
!
!
)
(+,
过表达烟草叶柄和茎秆基部木质素含量
图中所列为各株系中木质素含量的平均值"
/g%
#&
不同小写字母表示转基因株系与对照之间
同一器官木质素含量之间的差异"
!
#
"*"$
#
K-
9
*#(
!
H-
9
/-/<8/L=/L-/
F
=L-85=4/?.L=38_
!
)
(+,)8@=W=:
F
W=..-8/L8;4<<8
F
54/L.
D4L4W=
F
W=.=/LL7=3=4/h.L4/?4W?=WW8W
"
N2
#
8_
L7W==W=
F
5-<4L-8/.
&
D-__=W=/L5=LL=W.-/?-<4L=.-
9
/-_-<4/L
?-__=W=/<=.;=L^==/L7=LW4/.
9
=/-<
F
54/L.4/?
VP-/L7=.43=8W
9
4/.4L!
#
"*"$
质素含量为
$*#!Y
!而转基因阳性株系
MU)(
(
MU)
+
(
MU)1
叶柄木质素含量均高于对照!其中
MU)(
株
系木质素含量最高"
1*1#Y
#!比对照增加了
1(*Y

MU)+
和
MU)1
株系叶柄木质素含量分别比对照提
高了
#*!Y
和
#"*"Y
"图
#(
#对于植株茎秆基部
的木质素含量来说!
MU)(
(
MU)+
(
MU)1
株系的茎秆
木质素含量均高于对照!分别比对照提高了
#%*$Y
(
(*"Y
和
"*1Y
"图
#(
#综上所述!
!
)
(+,
基因在
烟草中过表达后!可显著地提高烟草植株的木质素
含量
%
!
讨
!
论
禾本科植物
(+,
编码区一般具有较高的
OB
含量!平均达
$*(#Y
!而双子叶植物
(+,
编码区平
均
OB
含量仅为
(+*$$Y
)
#1
*
在对水稻
(+,
基因
研究的过程中发现!
(+,
基因编码区的密码子有偏
态选择第三位
O
%
B
的现象!导致了基因
OB
含量偏
高)!"*
!
)
(+,
编码区序列
OB
含量为
*+Y
!并
且在
$b
端有着较高的
OB
含量!这与禾本科植物水
稻
(+,
基因高
OB
含量的规律一致在氨基酸比
对中!
G
F
(BH
蛋白与禾本科参与木质素合成的
(BH
在基序特征上有较高的一致性!并具有一些共同特
征这说明
!
)
(+,
基因在序列上与其他植物的
(+,
基因有诸多相似之处
植物
(BH
一般可分为
B54..
"
和
B54..
$
两大
类群!其中
B54..
"
中的
(BH
主要参与植物木质素
的合成!而
B54..
$
中的
(BH
与木质素合成没有紧
密联系!可能参与了黄酮类物质的合成代谢)!#*
M.(BH!
(
CL(BH%
(
O3(BH%
已经证明与木质素合成
无紧密联系!可能参与黄酮类物质的代谢)#$!#)!%*!并
且这些
(BH
都属于
B54..
$
!在蛋白进化分析中!被
归到
OW8>
F
C
中华南象草
G
F
(BH
被归到
OW8>
F
X
中!与典型的
B54..S
类蛋白
CL(BH#
聚为一支!
CL(BH#
主要限定在维管组织中表达!编码的同工
酶与木质素合成有关!并与植物维管系统的木质部
组织中可溶解的或细胞壁结合的苯丙烷类衍生物的
结构合成有关)!()!*而且!在华南象草中
G
F
(BH
中
发现的肽基序
NNOPPOHGQOR
在
(BH
蛋白序列
中几乎绝对保守另一个肽基序
O2SBSTO
在所有
!%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
(BH
蛋白中绝对保守!其中新的
B
残基被认为直接
参与催化过程)!+)!0*更重要的是!华南象草中
JONR
序列被认为是参与木质素合成
(BH
的依据
之一!因为在禾本科植物中!参与木质素合成的
(BH
在氨基酸序列
E
端均为
JONR
序列以上这些结
果都说明
G
F
(BH
蛋白的功能上可能类似于其他
(BH
蛋白
为了证明以上推测!我们将华南象草
!
)
(+,
基因转化到烟草中!共获得
%
个转基因烟草株系!在
叶柄中!
%
个阳性株系总木质素含量比对照分别提
高了
1(*Y
(
#*!Y
和
#"*"Y
&而在基部茎秆中!总
木质素含量比对照分别提高了
#%*$Y
(
(*"Y
和
"*1Y
这与
P-4/
等)#(*(赵艳玲等)!1*(
A>4/
等)%"*
的研究结果一致其中!
MU)(
株系叶柄和茎秆木质
素含量提高最多!而
MU)+
和
MU)1
株系叶柄和茎秆
木质素含量仅比对照有较低程度的提高!可能是由
于转基因株系间
!
)
(+,
基因的表达量有所差别
另外!转基因植株目的基因的拷贝数与基因表达量
呈负相关)%#*!这可能是导致转基因株系基因表达差
异的原因之一为了对
!
)
(+,
过表达株系进行更
深入研究!还有待开展
!
)
(+,
基因表达量测定以
及拷贝数检测的研究
本研究中!
%
个
!
)
(+,
超表达烟草株系的木质
素含量均比对照有不同程度的提高!表明过表达
!
)
(+,
基因能提高植株木质素含量!而且进一步证
明
!
)
(+,
是参与木质素合成的基因!说明
!
)
(+,
基因可以用于培育象草木质素改良新品种的研究
但是
(+,
基因家族成员众多!许多
(+,
基因家族成
员并不参与木质素的合成!而有些基因补偿了木质
素合成过程!所以在进行木质素合成途径研究时!分
析
(+,
基因家族中的家族成员功能与关系才能更
好地达到调控木质素含量的目地
参考文献!
)
#
*
!
D2HTe
!
GTSEN2EG
!
T2EBMT2Pe
!
"&15*NLW>W45<74W49
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F
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