全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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#(!#%&("*
收稿日期$
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%修改稿收到日期$
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基金项目$江苏省科技支撑项目"
,-.!"##$"!*%
#%无锡市科技项目"
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!"#!
年度中央高校基本科研业务费资助
作者简介$杨
!
岚"
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#!女!在读硕士研究生!主要从事药用植物生物技术育种研究&
-(2345
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6
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通信作者$向增旭!博士!副教授!主要从事药用植物生物技术育种研究&
-(2345
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6
7
389:;89<6
铁皮石斛四倍体离体诱导和鉴定及生理特性研究
杨
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岚#!师
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帅!!向增旭#"
"
#
南京农业大学 中药材研究所!南京
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江苏宜兴爱琴海太湖生态农业专业合作社!江苏宜兴
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#
摘
!
要$以铁皮石斛原球茎为材料!经不同质量浓度的秋水仙素"
/
!!
@
!*
A
B
#和
"9"!
?
20
#二甲基亚砜"
CD,A
#
混合水溶液处理后进行组织培养!通过对变异株进行形态学(细胞学及流式细胞仪鉴定!以期获得稳定的四倍体植
株并分析其生理特性&结果表明$用
!9"
?
0
#秋水仙素和
"9"!
?
20
#
CD,A
混合水溶液处理铁皮石斛原球
茎
$BE
后!植株诱导率达
!"F
%诱导四倍体植株在形态上明显矮化(茎秆粗壮(叶片变小增厚(气孔直径增大%细胞
遗传学观察发现!四倍体植株染色体
!6G)>G+B
!二倍体植株染色体
!6G!>G$%
%流式细胞仪分析显示!
C1H
相
对含量四倍体为
)""
!二倍体仅为
!""
%四倍体植株叶片中叶绿素含量(可溶性蛋白(可溶性糖含量均高于二倍体!
分别为
*9"$
(
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(
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#
%四倍体叶片中主要抗氧化酶
IAC
和
,AC
活性均显著高于二倍体!分别为
&9"%
(
#%"9)J
2
?
#
!且四倍体植株明显降低了
DCH
含量累积&研究认为!
!9"
?
0
#秋水仙素和
"9"!
?
20
#
CD,A
混合水溶液处理原球茎
$BE
可提高诱导成功率(降低嵌合体比例!此组合为诱导四倍体较佳诱导条件&
关键词$铁皮石斛%诱导%四倍体%秋水仙素%二甲基亚砜%生理特性
中图分类号$
K$)$9!
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))
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K&)*9+&
文献标志码$
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4<35
铁皮石斛"
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++
(,(#-."b428T3:U
D4
?
R
#为传统名贵珍稀中药材!以新鲜或干燥的茎
入药!具有滋阴清热(润肺明目(抗癌防老等功效)#*&
在自然环境下铁皮石斛自身繁殖率低!随着生存环
境的破坏及人类长期的采挖!野生资源已濒临灭绝%
目前人工组织培养繁殖是满足铁皮石斛市场需求的
主要手段&但多年来只种不选的栽培模式!致使铁
皮石斛品种退化严重!制约着产量与品质&多倍体
育种具有改变植株形态性状(提高抗性及改善次生
代谢积累等特点)!*&近年来!多倍体育种作为良种
培育和种质创新的重要途径!已在百合)$*(党参)*(
丹参)**(雪莲)B*(金银花)+*(甜叶菊)%*等植物上通过
人工加倍技术成功获得同源多倍体%而铁皮石斛多
倍体育种研究发现!单一采用秋水仙素诱导处理铁
皮石斛原球茎!不仅诱导率低(诱导周期长!且多为
嵌合体)&(#"*&王凤宝等)##*通过秋水仙素和
"9"!
?
20
#二甲基亚砜混合水溶液诱导处理甘薯和豌豆
后!可提高诱导成功率(减少嵌合体比例!提高工作
效率&目前!对铁皮石斛四倍体生理特性的研究在
国内尚未报道&本试验以铁皮石斛原球茎为诱导材
料!采用不同浓度秋水仙素和二甲基亚砜混合水溶
液处理!为成功诱导铁皮石斛四倍体筛选较佳诱导
处理条件!同时测定四倍体植株的生理特性!进而为
铁皮石斛种质创新提供有力依据&
#
!
材料和方法
99
!
试验材料
将成熟的铁皮石斛蒴果经无菌水冲洗
$E
后!置
+*F
酒精中消毒
$"W
!再经
"9#F
氯化汞浸泡灭菌
#*
246
!无菌水漂洗干净&于无菌环境下取出灭菌后的
蒴果!将成熟种胚撒播到
D,L"9!2
?
0
#
1HHL
#""
?
0
#土豆泥培养基表面!经"
!*c#
#
d
!光照强
度
#"""
"
#*""5>
的无菌环境中诱导培养
)*;
!选择
大小一致(分化稳定的原球茎作为诱导材料&
99:
!
试验方法
99:9
!
四倍体的离体诱导
!
将原球茎分别置于质
量浓度为
"9*
(
#9"
(
!9"
?
0
#秋水仙素和
"9"!
?
20
#二甲基亚砜"
CD,A
#混合水溶液中"抽滤灭菌#!
震动摇床内培养
#!
(
!)
(
$B
(
)%E
!各处理重复
$
次!以
清水培养为对照"
/b
#&将各处理后的原球茎经无菌
水冲洗干净!转接于
D,L!9"2
?
0
#
B(.HL"9!
2
?
0
#
1HHL#""20
0
#椰汁培养基中进行恢
复和增殖培养!经
!
次继代后!转入
#
+
!D,L"9"B2
?
0
#
1HHL#*"
?
0
#香蕉泥培养基中分化(生
根!同时观察并记录成活率及形态变化&
99:9:
!
四倍体植株的鉴定
!
!
#
"形态学鉴定
!
经植
株大小(叶片颜色(叶形等外部形态观察比较后!完
成初步筛选&
!"解剖学鉴定
!
选择大小一致的变异植株和
对照植株分别撕取叶下表皮制临时装片!在
A5
X
2(
[
8W
显微镜下观测气孔大小及密度!并镜检拍照&
!
$
"染色体鉴定
!
于
&
$
""
"
##
$
""
取幼苗根尖!
经
"9""!2R5
0
#的
%(
羟基喹啉预处理
)E
!于
)
d
卡诺氏固定液固定
!)E
!无菌水冲洗干净后常温
下解离
#E
!改良苯酚品红染色
!"246
!观察染色体
数目并进一步判断植株倍性!完善植株筛选&
!
)
"流式细胞仪鉴定
!
参考张娜等)#!*的方法!
并最终确定四倍体植株&
99:9;
!
四倍体与二倍体植株生理指标比较
!
分别
选取处理组与对照组的幼嫩叶片后测定叶片中叶绿
素(可溶性蛋白质(可溶性糖(丙二醛"
DCH
#含量以
及叶片中超氧化物歧化酶"
,AC
#(过氧化酶"
IAC
#
活性&各处理重复
$
次!每重复随机选取
#"
株幼
苗!采用
%"F
丙酮研磨法测定叶绿素含量)#$*%采用
硫代巴比妥酸法测定
DCH
含量)#)*!参照高俊凤)#**
的方法测定游离脯氨酸(可溶性糖含量及抗氧化酶
,AC
(
IAC
活性&
!
!
结果与分析
:9
!
铁皮石斛四倍体的离体诱导
由表
#
可知!用不同浓度的秋水仙素和
"9"!
?
20
#二甲基亚砜"
CD,A
#混合水溶液!经不同处理
时间诱导后!对原球茎成活率的影响也不同!且原球
茎成活率随秋水仙素混合液浓度升高而逐渐降低&
尤以
!
?
0
#秋水仙素混合液处理
)%E
!原球茎成
活率最低%同浓度处理下!随处理时间延长!原球茎
成活率也呈减低趋势&当
"9*
?
0
#秋水仙素混
合液处理
#!E
后!诱导率为
"F
!而其他处理的诱导
率为
$9$$F
"
#$9$$F
&其中
!
?
0
#秋水仙素混
合液处理
$BE
效果最佳!诱导率高达
!"F
&
:9:
!
四倍体鉴定
:9:9
!
形态学(解剖学鉴定
!
与二倍体相比!四倍
"&#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
表
9
!
不同浓度的秋水仙素和
:
1
!
<=
>9二甲基亚砜混合水溶液对原球茎的诱导效果
Z3\5:#
!
O6S58:6<:RS
20
#
CD,A]4UE;4SS:T:6U
(,(#-."
质量浓度
/R6<:6UT3U4R6
+"
?
0
#
#
时间
Z42:
+
E
处理数
1R9RS
W32
[
5:W
成活数
1R9RSW8TV4V35
W32
[
5:W
成活率
_3U:RS
W8TV4V35
+
F
四倍体数
1R9RS
U:UT3
[
5R4;
诱导率
_3U:RS
U:UT3
[
5R4;
+
F
"9" " #" #" #" " "
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表
:
!
铁皮石斛二倍体和四倍体植株形态及气孔特征比较
Z3\5:!
!
DRT
[
ER5R
?
4<35
3T4WR6
!
UE:
[
5R4;36;
;4
[
5R4;RS!/&
++
(,(#-."
植株形态和气孔特征
I536U2RT
[
ER5R
?X
36;
UE:WUR23U3
I5R4;
X
!> )>
叶宽
0:3S]4;UE
+
22 )9B*c"9#+%3 $9$%c"9"&+叶长
0:3S5:6
?
UE
+
22 #!9B+c"9!#"3 %9*+"c"9!!$叶厚
0:3SUE4<^6:WW
+
22 "9!%c"9")*\ "9*!c"9"*+3
叶型指数
0:3S46;:> )9$!c"9"%"3 $9!+c"9"+*气孔长径
,UR23U35:6
?
UE
+
#
2 )"9!$c#9&!&\ B"9"%c$9+$*3
气孔短径
,UR23U3;432:U:T
+
#
2 $#9*Bc$9!+!\ )"9$*c!9!#%3
每视野气孔数
,UR23U3;:6W4U
X
"
e#"
#
)*c)9#B$3 !#c$9+%B气孔面积
,UR23U3682\:T
+
#
2
!
#$B%9!$c#$9+B\ !!)*9$!c#9+$%3
!!
注$同行不同小写字母表示差异达
"9"*
显著水平&
1RU:
$
C3U3]4UE;4SS:T:6U6RT2355:UU:TW]4UE46UE:W32:TR]3T:W4
?
64S4(
<36U5
X
;4SS:T:6U3U"9"*5:V:59
体植株表现出扭曲矮化(生长缓慢(茎秆变粗(叶片
变小(叶片颜色加深(叶型指数变小(根尖变粗(原球
茎分化变异等植株形态变异"图版
$
!
#
"
%
#&试验
结果"表
!
#分析发现!四倍体植株叶宽(叶长(叶厚
及叶型指数分别为
$9$%22
(
%9*+22
(
"9*!22
和
$9!+
!与二倍体差异显著%镜检观察发现"图版
$
!
&
(
#"
#四倍体叶片表皮中保卫细胞的长径(短径(气
孔面积分别为
B"9"%
#
2
(
)"9$*
#
2
(
!!)*9$!
#
2
!
!
显著大于二倍体植株!且单位面积内气孔密度显著
小于二倍体&
表
;
!
铁皮石斛四倍体与二倍体叶片部分指标比较
Z3\5:$
!
/R2
[
3T4WR6WRSWR2:4U:2W\:U]::6
U:UT3
[
5R4;36;;4
[
5R4;RS!/&
++
(,(#-."
指标
OU:2 !> )>
,AC
活性
H
+"
J
2
?
#
#
&*9!$ #%"9)
相对比活力
_:53U4V:3
#9"" #9%&
IAC
活性
H
+"
AC
)+"
2
?
#
246
#
#
$9*! &9"%
相对比活力
_:53U4V:3
#9"" !9*%
DCH
含量
/R6U:6U
+"
62R5
?
#
#
"9"+! "9"$
相对含量
_:53U4V:
/E5RTR
[
E
X
5
含量
/R6U:6URS
E
X
5
+"
2
?
?
#
#
!9$* *9"$
相对含量
_:53U4V:
,R58\5:W8
?
3T
含量
/R6U:6URSWR58\5:W8
?
3T
+"
2
?
?
#
#
#9*! !9&%
相对含量
_:53U4V:
,R58\5:
[
TRU:46
含量
/R6U:6URSWR58\5:
[
TRU:46
+"
2
?
?
#
#
!9") $9*&
相对含量
_:53U4V:
!
细胞学鉴定
!
通过压片镜检发现$初步筛选
的疑似四倍体
#""
株!
#*
株为四倍体植株!
*B
株为
嵌合体"图版
$
!
#$
#&与对照植株相比!四倍体细胞
体积(核仁明显变大(染色体数目加倍&对照组植株
细胞染色体数为
!6G!>G$%
"图版
$
!
##
#!四倍体
细胞染色体为
!6G)>G+B
"图版
$
!
#!
#&
:9:9;
!
流式细胞分析
!
以二倍体植株为参照!对
#""
株疑似植株进行流式细胞仪分析%分析
C1H
相
对含量确定二倍体(四倍体和嵌合体植株&结果表
明!二倍体(四倍体
C1H
相对含量分别在
!""
和
)""
处出现主峰值"图版
$
!
#)
(
#*
#!且二者
C1H
含
量呈
!
倍关系!符合四倍体判断标准%此外嵌合体则
#&#!
##
期
!!!!!!!!!!!
杨
!
岚!等$铁皮石斛四倍体离体诱导和鉴定及生理特性研究
在
!""
(
)""
处同时突现主峰"图版
$
!
#B
#&
:9;
!
四倍体与二倍体植株生理指标比较
四倍体植株叶片中超氧化物歧化酶"
,AC
#(过
氧化酶"
IAC
#活性增强!丙二醛"
DCH
#含量降低!
抗氧化能力显著提高&由表
$
可知!四倍体植株
,AC
(
IAC
活性及
DCH
含量分别为二倍体植株的
#9%&
(
!9*%
和
"9)!
倍%这说明在同一培养环境下!
四倍体植株的生长状态(生理特性优于二倍体!从而
保证了四倍体植株的高抗逆性&
植株体内的高叶绿素含量直接反映着光合强
度!其含量越高!光合作用越强!越利于生物量累积%
可溶性蛋白和可溶性糖含量是植物体内主要的渗透
调节物质!不但能促进植株的代谢合成!又能提高植
株的抗逆性&由表
$
中发现!四倍体植株叶片中叶
绿素总量"
*9"$2
?
?
#
#明显高于二倍体植株
"
!9$*2
?
?
#
#!同时可溶性蛋白和可溶性糖的含
量分别是二倍体植株的
#9+B
和
#9&B
倍&试验结果
说明!铁皮石斛四倍体植株的光合作用强度(植物代
谢强度及抗性都优于二倍体&
$
!
讨
!
论
王凤宝等)#B*以秋水仙素和二甲基亚砜为诱导
剂!在甘薯和豌豆等方面的研究已取得成功%甘薯和
豌豆分别在
"9*
?
0
#秋水仙素和
"9"!
?
20
#
二甲基亚砜混合水溶液间歇处理
!)E
和
)%E
后!
获得较高诱导率!而唐娅梅)#+*利用单一
!9"
?
0
#
的秋水仙素处理液!诱导培养铁皮石斛拟原球茎
)%
E
后!也取得较佳的诱导效果!其中成活率为
+%F
!
四倍体变异率为
#$F
&本试验参照前人方法!采用
!9"
?
0
#秋水仙素和
"9"!
?
20
#二甲基亚砜
混合水溶液处理原球茎
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倍体诱导率高达
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!且植株性状稳定&植株生长
后期成活率降低!可能是由于二甲基亚砜的强渗透
力使秋水仙素毒性增强!致使植株受到毒害!影响生
长&至于二甲基亚砜的强渗透力造成的植株毒害还
需更进一步科学研究&
相比简单的形态观察(细胞学观察!流式细胞仪
鉴定更具可靠性&染色体鉴定多通过观察根尖细胞
或花粉母细胞)#%(#&*的染色体数目确定植株倍性%由
于铁皮石斛生长周期长!诱导后植株生长更为缓慢!
尚未开花!所以本试验选取根尖作为鉴定材料&经
细胞染色体压片法确定植株染色体数目(判断倍性
后!再测定其
C1H
含量!既省时又提高工作效率&
叶片中叶绿素含量反映着植株光合作用能力的
强弱!
,AC
作为植物体内清除活性氧的重要细胞保
护酶之一!其活性高低反映出植物对逆境胁迫的适
应能力%呼吸酶
IAC
广泛存在于植物体内!一定水
平的酶活力反映出植物体内的代谢能力)!"*%膜脂过
氧化过程中
DCH
的含量变化!直接反映着膜脂损
伤程度&作为植物细胞内重要的渗透调节物质可溶
性糖(可溶性蛋白!能够维持细胞正常代谢!提高植
物的抗逆性!对植株生长发育及代谢累积有着重要
意义&综合评价分析发现!成功诱导的四倍体植株
具有强大的生长优势和良好的开发利用前景&
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