全 文 ：书西北植物学报!
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!
$$
"
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#&$##&$(
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#""")*"!+
"
!"#$
#
"%)#&$#)"(
收稿日期$
!"#$)",)#&
%修改稿收到日期$
!"#$)"()!!
基金项目$国家自然科学基金"
$##"#+&*
#%南京农业大学青年科技创新基金"
-.!"##""(
#
作者简介$杨玉霞"
#%(&
#!女!硕士研究生!从事观赏植物分子生物学研究&
/)0123
$
#+#,#*%*$##
!
#,$4560
%
!"#!#"*##(
!
7
8
194:;9457
"
通信作者$张昌伟!博士!副教授!主要从事园艺作物分子生物学研究&
/)0123
$
5<17
=
>:2?<
!
7
8
194:;9457
蝴蝶兰全长
!"#$
文库构建及
1%23
基因克隆
杨玉霞#!孙菲菲!!张昌伟#"
"
#
南京农业大学 园艺学院!南京
!#""%+
%
!
南京市蔬菜研究所!南京
!#""*!
#
摘
!
要$以红色蝴蝶兰为材料!利用
@ABCD:E
技术构建蝴蝶兰全长
5FGB
文库!分析从文库中获得的
/@D
序列!
获得蝴蝶兰类黄酮
$H
羟化酶基因"
!"#$%
#的全长!并对其进行生物信息学分析%采用实时荧光定量
IJC
方法!研
究
!"#$%
基因在红色蝴蝶兰和黄色蝴蝶兰花瓣中的表达情况&结果表明$"
#
#从构建的蝴蝶兰文库中随机挑选
!*
个单克隆进行测序!结果显示均含有插入片段!重组率为
#""4"K
!其中扩增片段长度在
&+"L
M
以上的克隆有
!!
个!占
%#4&K
&"
!
#获得的
!"#$%
基因编码的氨基酸序列与大丽花"
&"()
*
)++,
!
BFN

&&(!,4#
#(毛油点
草"
-.)/
0
.,)1").,
!
NBO

!!+#%4#
#等多种观赏植物
#$%
编码的氨基酸序列均具有较高的一致性&"
$
#实时荧光
定量
IJC
检测结果显示!
!"#$%
在红色蝴蝶兰中的表达量大约是黄色蝴蝶兰的
#%
倍!说明该基因对蝴蝶兰花青
素苷的积累有重要影响&该研究结果为蝴蝶兰新基因的挖掘及花色育种奠定了理论基础&
关键词$蝴蝶兰%
5FGB
文库%
@ABCD:E
%
CD)IJC
%
#$%
中图分类号$
P&(,
文献标志码$
B
&()*+,!*-(./,0102(
3
*4!"#$5-6+7+
8
7(9*42!"#$
&0(-(
3
.1%23-(45$*$)/&
6
7-7
QBGRQ9S21
#
!
@TGU:2V:2
!
!
WOBGRJ<17
=
>:2
#
"
"
#J63:
=
:6VO6EX2593X9E:
!
G17
8
27
=
B
=
E2593X9E13T72Y:EZ2X
[
!
G17
8
27
=
!#""%+
!
J<271
%
!G17
8
27
=
\7ZX2X9X:6V]:
=
:X1L3:@52:75:
!
G17)
8
27
=
!#""*!
!
J<271
#
$6)*+7!*
$
5FGB32LE1E
[
>1Z567ZXE95X:;VE60X<:E:;!"(2+3
*
1)1
M
:X13ZL
[
@ABCD:EX:5<72
^
9:4D<:#$
%972
=
:7:27!"(2+3
*
1)1>1Z6LX127:;X=
<1713
[
?27
=
X<:/@DZ:
^
9:75:ZVE6032LE1E
[
17;2X>1Z171)
3
[
?:;9Z27
=
L2627V6E01X25Z4BX31ZX
!
X<::S
M
E:ZZ267
M
1XX:E7Z6V#$%27E:;17;
[
:36>I<131:76
M
Z2Z
M
:X13Z
>:E:1713
[
?:;9Z27
=
E:13)X20:IJC4D<:E:Z93XZ27;251X:;X<1X
$"
#
#
D<:E:560L2717X
M
:E5:7X1
=
:6VX<:32)
LE1E
[
>1Z;:X:E027:;1Z#""4"KL
[
E17;60Z5E::727
=
!*5367:Z4B067
=
X<:Z:5367:Z
!
X<:E:>:E:!!27Z:EXZ
X<1X>:E:367
=
:EX<17&+"L
M
!
9
M
X6%#4&K4
"
!
#
D<:10276152;Z:
^
9:75::756;:;L
[
!"#$%6LX127:;VE60
X<:32LE1E
[
<1;1<2
=
<2;:7X2X
[
>2X*
)++,
"
BFN

&&(!,4#
#!
-.)/
0
.,)1").,
"
NBO

!!+#%4#
#
17;6X<:E6E710:7X13
M
317XZ4
"
$
#
D<:E:Z93X6VCD)IJCZ<6>:;X<1X!"#$% :S
M
E:ZZ2671L97)
;175:6VE:;!"(2+3
*
1)1>1Z1L69X#%X20:ZX<17X<1X6VX<:
[
:36>!"(2+3
*
1)1
!
><25<
M
E6Y:;X<1XX<:
=
:7:
M
31
[
Z1720
M
6EX17XE63:27X<:15590931X2676V17X<65
[
1727Z27!"(2+3
*
1)14\7LE2:V
!
X<:E:Z93XZ>23
M
E6Y2;:1X<:6E:X2513L1Z2ZX6!"(2+3
*
1)1
=
:7:02727
=
17;5636ELE::;27
=
4
:2
8
;+9)
$
!"(2+3
*
1)1
%
5FGB32LE1E
[
%
@ABCD:E
%
CD)IJC
%
#$%
!!
蝴蝶兰"
!"(2+3
*
1)1Z
MM
4
#为兰科蝴蝶兰属植
物!是一种热带气生兰!花型似蝴蝶!形态美妙色彩
丰富!花期长!在热带兰中素有)兰花皇后*之美称!
是近年来在国际花卉市场上最受欢迎的洋兰之一&
近年来!国内外对蝴蝶兰的研究主要集中在组织培
养(快速繁殖和栽培管理方面!对蝴蝶兰的分子遗传
研究(花色的形成机制及相关基因的克隆研究较少!
其潜在的经济和应用价值也未受到应有的重视&
全长
5FGB
文库!是指生物体特定组织或细胞
中所有的
0CGB
分子经反转录后得到的
FGB
分
子群体!是
0CGB
分子群的一个完整拷贝!它能够
提供完整的
0CGB
信息!还可通过基因序列比对得
到转录本的剪接信息%并可以预测蛋白质的氨基酸
序列和通过反向遗传学研究基因的功能+#,&构建全
长
5FGB
文库在研究具体某类特定细胞中某些基
因的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊
的优势!它在个体发育(细胞分化(细胞周期调控等
生命现象的研究中具有广泛的应用价值+!,&
构建全长
5FGB
文库的策略主要包括
_32
=
6)
J1
MM
27
=
法+$,(
JBIX9E:
法+*,(
@ABCD:E
"
@>2X5<27
=
)
A:5<172Z0BX+H:7;6VCGBDE17Z5E2
M
X
#法+,(
JBI)
XE1
MM
:E
法+,,(
J1
M
)@:3:5X
法+&,和
JBI)
8
90
M
27
=
法+(,&
这些方法在文库构建原理(文库的全长率(代表性和
实际应用等方面都存在明显差异!其中
@ABCD:E
法是最常用的一种文库构建方法!具有起始材料少(
过程简单(快速(成本低(全长率高的特点&本研究
以蝴蝶兰花瓣为实验材料!应用
@ABCD:E
策略构
建蝴蝶兰全长
5FGB
文库!并进行大量
5FGB
克隆
+H
端单向测序!然后对所获得的
/@D
序列进行生物
学分析!筛选出调控花色形成的基因!最终获得蝴蝶
兰类黄酮
$H
羟化酶基因"
!"#$%
#!分析其序列特
征并运用
CD)IJC
方法分析该基因在红色蝴蝶兰
和黄色蝴蝶兰花瓣中的表达情况&
#
!
材料和方法
<4<
!
材
!
料
本实验以南京蔬菜研究所蝴蝶兰生产温室提供
的红色和黄色蝴蝶兰为实验材料!取长势良好的幼
嫩花苞!分别拨取其花瓣!置于液氮速冻后!保存于
&"`
冰箱待用&
<4=
!
主要试剂
/B@QZ
M
27
植物
CGB
快速提取试剂盒"购自原
平皓生物公司#!
\7)U9Z267
"
@ABCD:E
DA
F2E:5X267)
135FGBa2LE1E
[
J67ZXE95X267-2X
和
B;Y17X1
=
:
DA
!IJC-2X
"购自
J367X:5<
公司#!
_32
=
6X:S
DA
);D$"
#
Z9
M
:E
$
0CGB
纯化试剂盒"购自
D1-1C1
公
司#!
IE20:@5E2
M
XCDE:1
=
:7X-2Xb2X<
=
FGB/E1Z)
:E
"
I:EV:5XC:13D20:
#试剂盒"购自宝生物工程有
限公司#!实时定量
IJC
采用
@QNC
"
IE:02S/S
-
4
DA
E:1
=
:7X
试剂盒"购自宝生物工程有限公司#&
其他常用试剂购自国内公司&
<>%
!
总
?#$
提取
取
#""0
=
左右的红色蝴蝶兰花瓣!在加有液
氮的研钵中快速研磨成粉 末!迅 速 转 移 到 无
CGB1Z:
的
#4+0a
离心管中&迅速加入
+""
#
a
裂
解液
CaD
!再加入
+"
#
aIaBGD12;
!充分混匀!后
续操作参照 )
/B@QZ
M
27
植物
CGB
快速提取试剂
盒*说明书进行&提取的蝴蝶兰总
CGB
置于
&"
`
保存备用&取
!
#
a
总
CGB
!用
#4!K
的琼脂糖
凝胶电泳检测
CGB
的完整度!并用紫外分光光度
计测定
CGB
的纯度及含量&
<>@
!
A?#$
的纯化
0CGB
的纯化参考
_32
=
6X:S
DA
);D$"
#
Z9
M
:E
$
0CGB
纯化试剂盒说明书进行&具体方法为$在
#4+0a
离心管中加入
#+"
#
a
蝴蝶兰花苞总
CGB
水溶液!
#+"
#
a!cN27;27
=
缓冲液!
#+
#
a_32
=
6)
X:S
DA
);D$"
#
Z9
M
:E
$
!总反应体系为
$#+
#
a
&混
匀后在
&"`
加热
$027
!室温静置
#"027
&室温
#+"""E
-
027
离心
+027
!除去上清!加入
$+"
#
a
洗
脱液!将
_32
=
6X:S
DA
);D$"
#
Z9
M
:E
$
充分悬浮后!
加入到制备管中&室温
#+"""E
-
027
离心
$"Z
!向
制备管中加入
$+"
#
a
洗脱液!使
_32
=
6X:S
DA
);D$"
#
Z9
M
:E
$
充分悬浮后!将制备管移至新的制备管用
离心管上&室温
#+"""E
-
027
离心
$"Z
!将制备管
再次移至新的制备管用离心管上&向制备管中加入
!"
#
aF/IJ
水!充分悬浮
_32
=
6X:S
DA
);D$"
#
Z9)
M
:E
$
!室温
#+"""E
-
027
离心
$"Z
!回收
0CGB
&
取
+
#
a
的纯化产物!利用
#4!K
的琼脂糖凝胶电泳
进行检测&
<>B
!
全长
!"#$
文库的构建
第一条
5FGB
链合成$在
IJC
反应管中依次加
入
!4+
#
a0CGB
!
#
#
a$H\7)U9Z267@ABCD:EJF@
IE20:E
"
#!
#
063
-
a
#!
#4"
#
a;;O
!
_
!共
*4+
#
a
&涡旋
混匀后
&!`
反应
$027
!
*!`
反应
!027
!再向反应
液中依次加入
!4"
#
a+cU2EZX)@XE17;
缓冲液
"4!+
#
aFDD
"
#"" 0063
-
a
#!
#4"
#
a;GDI A2S
"
#"
0063
-
a
#!
#4"
#
a@ABCD:E ] _32
=
67953:6X2;:
"
#!
#
063
-
a
#!
"4!+
#
aCG1Z:
酶抑制剂!
#4"
#
a@ABCD)
@5E2L:
DA逆转录酶"
#""T
#!共计
#"
#
a
!移液枪混匀后
短暂离心!
*!`
保温
%"027
!
,(`
热激
#"027
结束
第一轮反应!
!"`
保存&
FZ5FGB
反应体系$
IJC
管中依次加入
!
#
a
!$&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
单链
5FGB
!
("
#
a;;O
!
_
!
#"
#
a#"cB;Y17X1
=
:!
IJCN9VV:E
!
#
a+"c;GDIA2S
"
#"0063
-
a
#!
!
#
a+HIJCIE20:E
$
B
"
#!
#
063
-
a
#!
!
#
a$H\7)
U9Z267@ABCD:EIJCIE20:E
"
#!
#
063
-
a
#!
!
#
a
+"cB;Y17X1
=
:!I63
[
0:E1Z:A2S
!共计
#""
#
a
!
!
个反应体系!分别混匀后进行
IJC
&
IJC
反应条件
%+`#027
!后
%+`#+Z
!
,+`$"Z
!
,(`,027
&
首先反应
#+
个循环!从其中一管取出
!"
#
a
置于一
新的
IJC
管进行优化!剩余放到
*`
保存&分别在
#$
(
#+
(
#(
(
!#
(
!*
个循环时从优化管中取出
+
#
a
IJC
产物!用
#4!K
的琼脂糖凝胶电泳检测!确定最
佳反应循环数后!将剩余的
#("
#
a
反应体系加到最
佳反应循环数!然后平均分成两管!各加入
#"
#
a
#K
的二甲苯青
UU
!混匀后
!"`
保存&
FZ5FGB
分级纯化$准备
JOC_AB@I\Gd
D/)#"""
柱和
#,
个
#4+0a
离心管并做好标记!将
柱子轻轻上下颠倒几次去除气泡!去掉柱子下端!打
开上面的盖子!让柱子里的缓冲液自然流出!流速控
制在
*"
%
,"Z
每滴&待储藏的缓冲液流尽以后!沿
柱子内壁轻轻加入
&""
#
a
柱缓冲液!待流干以后!
在柱子表面轻轻加入
(+
#
a
二甲苯青
UU
和双链
5FGB
的混合液!待加入的混合液完全被吸收后!用
#""
#
a
柱缓冲液洗原装双链
5FGB
的
IJC
管子!
加到柱子表面&液体自然流干后!向柱子表面加入
,""
#
a
柱缓冲液!开始收集流分!每个离心管一滴&
每管取
$
#
a
进行
#4!K
琼脂糖凝胶电泳!将最先出
现条带的
*
%
+
部分合并&向合并的样品中加入
#
-
#"
体积的醋酸钠"
$063
-
a
!
M
O*4(
#!
#4$
#
a
糖
原!
4+
倍体积
!"`
预冷的
%+K
乙醇!混匀后

!"`
过夜!然后
#*"""E
-
027
室温离心
!"027
!去
掉上清液后!室温风干
#"027
后用
#"
#
a;;O
!
_
溶解沉淀!
!"`
保存&
<>C
!
全长
!"#$
文库中片段的检测
载体连接$
!
#
a+c\7)U9Z267 OF /7?
[
0:
IE:02S
!
#
a
M
@ABCD!\UF]:5X6E
"
#+"7
=
-
#
a
#!
*4"
#
a5FGB
!
4"
#
a;;O
!
_
!反应体系为
#"
#
a
&
混匀后!
+"`
温育
#+027
后迅速置于冰上&向每
管反应液中加入
%"
#
aD/
和
#"
#
aP925eJ3:17
松
脂!涡旋
#027
后离心片刻!吸取上清液置于新的离
心管中!各加入
#4!
#
a
糖原!混匀后加入
!("
#
a
#""K
乙醇!前后摇晃混匀!
&"`
沉淀过夜&第二
天在
#+"""E
-
027
室温离心
!"027
!小心去除乙
醇!室温风干后!加入
#"
#
aF/IJ
水溶解沉淀!
!"`
保存&
重组质粒的转化$将上述
#"
#
a
的连接液加入
到大肠杆菌感受态
FO+
&
中!轻轻混匀!冰浴
$"
027
%
*!`
热激
%"Z
!迅速转到冰上冷却
$027
%加入
$&`
预热的
aN
液体培养基
*""
#
a
!置于
$&`
摇
床上
#""E
-
027
复苏
*+
%
,"027
%涂抹于含
#""
#
=
-
0a
的氨苄青霉素的
aN
固体培养基上"临用时
表面涂抹
*"
#
a!"0
=
-
0a
的
f)
=
13
和
$"
#
a!*
0
=
-
0a
的
\IDR
#%
$&`
倒置培养
#!
%
#*<
!随机挑
选
!*
个白色单菌落进行培养&
菌落
IJC
检测$反应体系包括
#
#
a
菌液(
#*4*
#
a;;O
!
_
(
"4*
#
a
正向筛选引物"
#"
#
063
-
a
#(
"4*
#
a
反向筛选引物"
#"
#
063
-
a
#(
#4,
#
a;GDI
"各
#"0063
-
a
#(
!
#
a#"cIJCL9VV:E
和
"4!
#
a-
5
聚合酶!共
!"
#
a
&反应条件为$
%* `
预变性
+
027
%
*`$"Z
!
++`$"Z
!
&!`!027
!
$"
个循环%
&!`#"027
&反应结束后取
+
#
a
进行
#4!K
琼脂
糖凝胶电泳检测&
<4D
!
蝴蝶兰类黄酮
%H
羟化酶基因序列的获得与
分析
将
!*
个白色单菌落培养后!进行测序&获得的
序列在
GJN中进行
NaB@Df
和
NaB@DG
比对分
析!并进行
/@D
功能注释!获得
#
条
#$%
单一序
列!命名为
!"#$%
"
R:7N17e
登录号$
-J((*(*(
#&
采用
GJN中的
NaB@Df
程序进行同源性比较!用
GJN\_CUU27;:E
程序查找序列的
_CU
%用软件
IE6X)I1E10
"
M
$--
194:S
M
1Z
[
46E
=
-
X663Z
-
M
E6X)
M
1E104#计算蛋白的分子质量和理论等电点&
<>E
!
蝴蝶兰类黄酮
%F
羟化酶基因的
?G1H&?
分析
分别提取红色和黄色蝴蝶兰花瓣总
CGB
!利用
IE20:@5E2
M
XCDE:1
=
:7X-2X b2X<
=
FGB /E1Z:E
"
I:EV:5XC:13D20:
#试剂盒合成第一链
5FGB
&
根据
!"#$$%
基因的开放阅读框序列!利用软件
表
<
!
451%23
荧光定量分析表达的引物
D1L3:#
!
IE20:EZV6E
^
IJC:S
M
E:ZZ2671713
[
Z2Z6V!"#$%
基因
R:7:
登录号
B55:ZZ267790L:E
引物
IE20:E
引物序列
IE20:EZ:
^
9:75:
U C
!"#$% -J((*(*( I6/,)+ T#(#"!4# B5X27 +H)DBDRDDRJJBDDJBRRJJRD)$H +H)BRDJJBBRRJJBJBDBBRJJ)$H
$$&#
%
期
!!!!!!!!!!!!
杨玉霞!等$蝴蝶兰全长
5FGB
文库构建及
#$%
基因克隆
IE20:E+
设计实时荧光定量
IJC
引物"表
#
#!引物
由上海捷瑞公司合成&
^
IJC
采 用
@QNC
"
IE:02S/S-
4
DA
E:1
=
:7X
试剂盒!操作按试剂盒说明书进行&反应总体积为
!+
#
a
!含
@QNCIE:02S/S-
4
DA
#!4+
#
a
!上游引
物"
#"
#
063
-
a
#
#
#
a
!下游引物"
#"
#
063
-
a
#
#
#
a
!
5FGB
模板
#
#
a
!灭菌的
;;O
!
_%4+
#
a
&
IJC
反
应程序为$
%+`
预变性
!027
%
+`!"Z
!
,"`!"
Z
!
&!`$"Z
!
*"
个循环!
&!`#"027
&
融解曲线测定为从
,"`
%
%+`
!反应在
C6X6E)
R:7:$"""
实时定量
IJC
仪上进行&每个反应各设
定
$
次重复!实验数据运用
C6X6E)R:7:C:13)D20:B)
713
[
Z2Z@6VX>1E:,4#
和
/S5:3
软件进行分析&
!
!
结果与分析
=><
!
总
?#$
的提取(纯化及全长
!"#$
文库构建
提取的红色蝴蝶兰花瓣总
CGB
!经琼脂糖凝胶
电泳检测"图
#
#!得知总
CGB
在提取过程中没有降
解!并且无
FGB
(多糖(蛋白(酚类(离子等杂质污
染&经分光光度计检测!总
CGB
浓度为
&""
%
##""
#
=
-
0a
!
_F
!,"
-
!("
为
#4(%
%
!4"!
!
_F
!,"
-
!$"
为
!4"
%
!4$
&说明提取的总
CGB
纯度较高!浓度较
高!符合构建
5FGB
文库的要求&
0CGB
纯化后!经琼脂糖凝胶电泳检测"图
!
#!
0CGB
为大于
+""L
M
的弥散带!主要集中在
+""
图
#
!
蝴蝶兰花苞总
CGB
#
(
!4
花苞总
CGB
U2
=
4#
!
D6X13CGBVE60L9;6V!"(2+3
*
1)1
#
!
4D6X13CGBVE60L9;
图
!
!
纯化的蝴蝶兰花苞
0CGB
U2
=
4!
!
I9E2V2:;0CGBVE60L9;6V!"(2+3
*
1)1
A4Fa!"""
%
#40CGB
%
!"""L
M
左右!
0CGB
大小完整&
0CGB
纯度
_F
!,"
-
!("
为
#4%%
!说明
0CGB
的质量很好!完全可
以采用
@ABCD:E
技术构建
5FGB
文库&
双链
5FGB
的合成利用
@ABCD:E
DA
IJC5F)
GB
合成试剂盒!合成单链和双链
5FGB
后!将
#+
(
#(
(
!#
(
!*
个循环后的双链
5FGB
进行
#4!K
琼脂
糖凝胶电泳检测!结果表明
#(
个循环后的
5FGB
比较合适"图
$
#!符合文库构建要求&按照最佳循
环数反应后!将
aF)IJC
产物分级纯化!每管取
$
#
a
进行凝胶电泳检测"图
*
#!
5FGB
从第
+
管开始
出现&收集
+
%
(
管
5FGB
!除去小于
!+"L
M
的短
片段
5FGB
&也可以看出弥散带主要分布于
+""
%
图
$
!
蝴蝶兰花苞
FZ5FGB
凝胶电泳图
A4Fa!"""
%
#
%
*4
分别为
#+
(
#(
(
!#
和
!*
个循环
U2
=
4$
!
B
=
1E6Z:
=
:3:3:5XE6
M
<6E:
=
E106V
FZ5FGBVE60L9;6V!"(2+3
*
1)1
A4Fa!"""
%
#4#+Z
[
53:Z
%
!4#(Z
[
53:Z
%
$4!#Z
[
53:Z
%
*4!*Z
[
53:Z
图
*
!
蝴蝶兰花苞过完柱子的
5FGB
凝胶电泳图
A4Fa!"""
%
#
%
#,4
过完柱子的
5FGB
U2
=
4*
!
B
=
1E6Z:
=
:3:3:5XE6
M
<6E:
=
E106VFZ5FGB
VE60L9;6V!"(2+3
*
1)11VX:E563907
A4Fa!"""
%
#
%
#,45FGB1VX:E563907
图
+
!
全长
5FGB
文库中片段大小分析
A4Fa!"""
%
#
%
!*4IJC
扩增结果
U2
=
4+
!
UE1
=
0:7XZ2?:1713
[
Z2Z6VV93)3:7
=
X<5FGB32LE1E
[
A4Fa!"""
%
#
%
!*4C:Z93XZ6VIJC10
M
32V251X267
*$&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
!"""L
M
之间!双链
5FGB
片段分布范围广!说明
质量很好&
=4=
!
文库中片段长度的测定
为了检测双链
5FGB
合成的质量和具体的片
段长度!将双链
5FGB
与载体连接后转化到大肠杆
菌
FO+
&
!随机挑取
!*
个白色单菌落!培养后进行
IJC
检测&结果"图
+
#显示!电泳条带分布于
+""
%
!"""L
M
之间!条带清晰!片段长度分布范围广&
图
,
!
不同植物
U$HO
氨基酸序列同源性比较
相同的氨基酸残基用黑色背景表示!灰色背景表明此氨基酸残基的一致性超过
+"K
U2
=
4,
!
B32
=
70:7X6V
M
E:;25X:;10276152;Z:
^
9:75:Z6VU$HOVE60;2VV:E:7XZ
M
:52:Z
D<:2;:7X251310276152;E:Z2;9:Z>:E:27;251X:;>2X=
E697;17;
=
E1
[
Z<1;:27;251X:;+"K
6E06E:567Z:EY1X2671067
=
136VX<:132
=
7:;Z:
^
9:75:Z
+$&#
%
期
!!!!!!!!!!!!
杨玉霞!等$蝴蝶兰全长
5FGB
文库构建及
#$%
基因克隆
图
&
!
不同植物
U$HO
氨基酸序列的系统树分析
U2
=
4&
!
I<
[
36
=
:7:X25XE::1713
[
Z2Z6VX<:;:;95:;10276
152;Z:
^
9:75:Z6VU$HO27;2VV:E:7XZ
M
:52:Z
图
(
!
实时定量
IJC
检测
!"#$%
在
蝴蝶兰红色和黄色花蕾中的表达
U2
=
4(
!^
IJC1713
[
Z2Z6V!"#$%:S
M
E:ZZ267
!!
当扩增片段的长度在
+""L
M
以上时判定为含
有插入片段!结果表明在
!*
个随机挑选的单克隆中
均含有插入片段!重组率约为
#""4"K
&在
!*
个克
隆中!扩增片段长度在
&+"L
M
以上的克隆有
!!
个!
占
%#4&K
&说明合成的
FZ5FGB
质量很好&
=>%
!
451%23
全长及序列分析
对
!*
个克隆进行全长测序后!得到一条
#$%
全长序列!为类黄酮
$H
羟化酶基因"
R:7N17e
登录
号
-J((*(*(
#!命名为
!"#$%
&
!"#$% 5FGB
全长为
#&!%L
M
!最大开放阅读框为
#+*,L
M
!编码
+#*
个氨基酸&基于
@>2ZZ)IE6X
中
/SIB@
[
数据库
的预测和分析!理论等电点为
&4,(
!相对分子量大
约为
+,4$"eF
&将
!"#$%
编码的氨基酸与
R:7)
N17e
中得到的其他植物
U$HO
蛋白基因氨基酸结
构进行比对!该基因编码的氨基酸序列与其他物种
的
#$%
编码的氨基酸有较高的一致性"图
,
#!其
中与大丽花"
&"()
*
)++,
!
BFN

&&(!,4#
#(毛油
点草"
-.)/
0
.,)1").,
!
NBO

!!+#%4#
#(百合杂种一
代"
7)()89<
[
LE2;;2Y2Z267!
NBA

!(%&!4#
#(洋葱
"
6(()89/2
*

!
BB@

*(*#%4#
#(福斯特郁金香"
-8:
()
*

;
31,2.)+
!
BR.+"+(%4#
#的
#$%
编码的氨基
酸一致性高达
,+K
左右!覆盖了
(+K
左右的序列&
应用
FGB017
软件将
!"#$%
编码的氨基酸
序列与从
R:7N17e
中获取的其他植物
U$HO
氨基
酸序列进行系统发育树分析"图
&
#&结果发现!蝴
蝶兰与大丽花"
BFN

&&(!,4#
#最先聚类合并%接着
毛油点草"
NBO

!!+#%4#
#(百合杂种一代"
NBA

!(%&!4#
#(福斯特郁金香"
BR.+"+(%4#
#聚为一类%
洋葱"
BB@

*(*#%4#
#为第三类&
=>@
!
451%23
在黄色蝴蝶兰和红色蝴蝶兰中的表
达分析
对
!"#$%
进行实时荧光定量分析!得知该基
因在红色蝴蝶兰花瓣中的表达量远远高于黄色蝴蝶
兰中!约为黄色蝴蝶兰表达量的
#%
倍"图
(
#!说明
!"#$%
是蝴蝶兰花青素苷合成的关键基因&
$
!
讨
!
论
%><
!
蝴蝶兰花瓣全长
!"#$
文库的构建
尽管自
!""+
年以来!以
C65<:
公司的
*+*
技术(
\390271
公司的
@63:S1
技术和
BN公司的
@_a2F
"
Z9
MM
6EX:;632
=
632
=
1X267;:X:X267
#技术为标志的高
通量测序技术相继诞生!在基因组"包括测序和表观
基因组学以及功能基因组学#研究的许多方面广泛
应用+%,!但基因的
5FGB
全长仍要通过全长
5FGB
文库等方法得到&
由于蝴蝶兰花苞中具有较高含量的酚类和糖类
物质!一般提取
CGB
的试剂盒或者常用提取
CGB
方法 难 以 提 取 到 高 质 量
CGB
&本 研 究 选 用
/B@QZ
M
27
植物
CGB
快速提取试剂盒能够很好地去
除花苞中的酚类和糖类物质!得到高质量蝴蝶兰总
CGB
!这是成功构建全长
5FGB
文库的前提条件&
构建高质量全长
5FGB
文库的关键在于获得
基因完整的
+H
端!虽然有很多方法!但
@ABCD:E
技
术具有其独特的优势$
@ABCD:E
技术是基于
I6>)
:EZ5E2
M
X
反转录酶的末端转移酶活性的一项技术!利
用经过修饰的
_32
=
6
"
;D
#引物!特异结合在
0CGB
加
I63
[
B
的位置!避免过长的
I63
[
B
影响后续的
IJC
反应&当反转录进行到
0CGB
的
+H
端时!能
够在合成的
5FGB$H
端添加几个脱氧胞嘧啶核苷酸
"
;J
#!从而与加入反应体系的
@ABCD

_32
=
6
引
物中的几个连续的脱氧鸟嘌吟核苷酸"
;R
#配对!使
逆转录酶转换模板!以
@ABCD

_32
=
6
作为延伸
模板继续延伸
5FGB
单链到引物的末端!结果第一
链
5FGB
的
+H
端就含有
@ABCD

_32
=
6
的序列!
从而可以合成
+H
端完整的双链
5FGB
!大大提高了
5FGB
的完整率+#")##,&本研究构建的
5FGB
文库
质量较高!在随机挑选的单克隆中均含有插入片段!
,$&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
重组率为
#""4"K
&在
!*
个单克隆中!扩增片段长
度在
&+"L
M
以上的克隆有
!!
个!占
%#4&K
&
%>=
!
451%23
全长克隆及在不同花色蝴蝶兰中的
表达分析
蝴蝶兰花型漂亮!花色鲜艳!是研究花色的理想
材料&在高等植物中!花青素苷的生物合成是一个
极其复杂的过程!包括约
!"
步化学反应!涉及了大约
#+
个结构基因"只有当诱导物存在时!这些基因才迅
速转录!形成多顺反子
0CGB
!并翻译成相应的酶#和
$
类转录因子+#!)#&,!其中
#$%
(
&#<
和
6=>
等为花
青素苷合成途径中极其关键的
,
个结构基因&花青
素
$)
葡糖苷的合成通路普遍存在于高等植物
中+#()#%,&然而在不同物种中!花青素苷合成途径中
的相关结构基因存在一些表达差异!即使在同一物
种不同颜色的植株上也会有表达丰度的不同!如
#$%
在不同颜色的观赏向日葵中表达丰度存在明
显的不同+!",!即每一种植物通常只表达一套特定的
基因!积累有限种类的花青素!呈现特异的花色&
作为花青素合成过程中关键的结构基因!
#$%
主要是催化依赖
GBFIO
和
_
!
的加氧反应&在类
黄酮合成途径中!它催化柚皮素"
71E27
=
:727
#和二氢
堪非醇"
;2<
[
;E6e1:0
M
V:E63
!
FO-
#的
N
环
$H
位置羟
基化!生成圣草酚"
:E26;25X
[
63
#和二氢栎皮黄酮"
;2)
<
[
;E6
^
9:E5:X27
!
FOP
#!这两种产物是花青素和原
花青素生物合成的重要中间产物!而花青素是花的
主要成色物质+!#,&
NE9
=
32:E1
等+!!,从矮牵牛"
!2,8+)
"
0
?.)@
#中首次分离出
#$%
基因!经鉴定得知该基
因属于
JQI&+N!
家族&后来相继在拟南芥"
6.?):
@3
*
1)1,"()+
#(紫茎泽兰"
A8
*
,3.)89@2+3
*
"3:
.89
#(大豆"
B(
0
/)+29C
#(葡萄"
D),)1E)+)
;
2.
#等众
多植物中分离鉴定了
#$%
基因+!$)!&,&
本研究发现
!"#$%
在红色和黄色蝴蝶兰中
的表达丰度存在很明显的差异!说明该基因在不同
花色的植物中存在不同的表达模式&前人对花色素
代谢途径中相关基因的研究表明!
#$%
基因的上调
和抑制都与花青素苷的积累和花色有密切关系+!(,&
在紫色矮牵牛"
!2,8+)"
0
?.)@
#中!人工干预下调
#$%
和
@
;
.
基因!花色会变淡或者变白+!%,!在蓝猪
耳"
-3.2+)"
0
?.)@
#中过量表达
#$%
可以提高矢车
菊素苷的积累量+$",&从生理方面研究发现!红色向
日葵花瓣的花青苷类型主要是矢车菊素!其糖苷类型
主要是和葡萄糖(鼠李糖等结合的配糖体!而在纯黄
色的向日葵中无这些花青苷!说明矢车菊类花青苷是
花色呈现红色的化学基础+$#,&
除了花青苷的含量影响花色外!花色的呈现还
受到其他物质含量的影响!如类黄酮(多酚类(生物
碱(氨基酸和有机酸等+#(,以及液泡中的金属离子如
B3
$d
(
U:
$d
(
A
=
!d 和
G2
!d 等(细胞液
M
O
值的影
响+$!)$$,&另外!花瓣表皮细胞的形状也会影响花青
苷的表达&因此对蝴蝶兰花色和花青苷的研究还需
进一步研究!从而为培育出蝴蝶兰新品种奠定基础&
本研究成功构建了蝴蝶兰全长
5FGB
文库并
得到了
!"#$%
基因!通过
CD)IJC
表达分析发现
!"#$%
在黄色和红色蝴蝶兰中呈现不同的表达丰
度!从而验证其为蝴蝶兰花色素苷合成过程中的关
键基因!这将为未来蝴蝶兰基因挖掘和培育蝴蝶兰
新品种提供理论基础&
参考文献!
+
#
,
!
f\/-N
"谢卡斌#!
WOBGR.b
"张建伟#!
f\BGRQ
"向
!
勇#
4@631X26717;1776X1X2676V#"
!
(!(27;251E25:V93)3:7
=
X<5FGB
+
.
,
4>/)2+/2
)+F")+>2.GF7)
;
2>/)2+/21
"中国科学
J
辑#!
""+
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"
#
#$
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"
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4
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"晏慧君#!
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"黄兴奇#!
JO/GRWP
"程在全#
4B;Y175:Z6VX<:ZX9;2:Z67567ZXE95X267ZXE1X:
=[
17;1713
[
Z2Z6V5F)
GB32LE1E
[
+
.
,
4H38.+(3
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I8++6
4
.)/8(,8.(J+)E2.1),
0
"云南农业大学学报#!
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!
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#
#$
#,
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#
4
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$
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27
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M
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M
315:X<:51
M
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M
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!
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M
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M
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$
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X<5F)
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+
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L
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[
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MM
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X<5FGB27IJC)
0:;21X:;1713
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Z2Z6V0CGBZ
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!
#%%%
!
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"
!#
#$
#$#4
&$&#
%
期
!!!!!!!!!!!!
杨玉霞!等$蝴蝶兰全长
5FGB
文库构建及
#$%
基因克隆
+(
,
!
/U\A_]]B
!
JOB-OAB-OJO/]B_R
!
BCJOF/BJ_G.
!
2,(4F:X:5X2676VX<:+H)51
M
ZXE95X9E:6V0:ZZ:7
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M
27
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1
MM
E615<
+
.
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!
""#
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%
,
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