全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(2): 146-153(2012)
收稿日期: 2011-04-22; 修回日期: 2011-10-22
基金项目: 国家自然科学基金项目(310717237), 转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08001-002)
通讯作者: 李多川, 主要从事分子植物病理学研究; Tel:0538-8249071,Fax: 0538-8226399, E-mail: lidc20@sdau. edu. cn
第一作者: 咸洪泉( 1967 - ) , 男, 吉林四平人, 在职博士研究生, 主要从事经济微生物学研究; E-mail: xianli0517@yahoo. com. cn。
黄蓝状菌几丁质酶基因 tfchi1 的克隆、表达
及抗菌活性
咸洪泉1,2, 汤 伟2, 张丽青1, 李安娜1, 李多川1*
( 1山东农业大学植物保护学院, 泰安 271018; 2青岛农业大学生命科学学院, 青岛 266109)
摘要:为研究黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶性质和作用,通过 RT-PCR、3′ RACE及 5′ TAIL-PCR技术克隆了一个
黄蓝状菌几丁质酶基因 tfchi1,该基因全长为 2 561 bp,含有 6 个内含子,包含一个 1 194 bp的 ORF,编码 397 个氨基酸,分
子量为 43. 47 kDa,属于糖苷水解酶第 18 家族。 利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体 pPIC9K / tfchi1,并转化毕赤
酵母,筛选得到一株高效表达几丁质酶的工程菌 GS-TFCHI1-9,甲醇诱导第 7 d 酶活性最高,达 32. 29 U·mL -1。 SDS-
PAGE检测纯化重组蛋白的分子量约 44 kDa。 重组几丁质酶 Tfchi1 最适反应温度为 35℃,最适反应 pH值为 5. 5,在 pH 6
~ 8 之间稳定。 Zn2 + 、Cu2 +对 Tfchi1 活性有明显的抑制作用。 抑菌活性测定结果显示,Tfchi1 可明显抑制敏感植物病原真
菌的菌丝生长和分生孢子萌发。 该酶在几丁质资源的开发利用和生物防治等领域具有较广的应用前景。
关键词:黄蓝状菌; 几丁质酶; trchi1; 克隆; 表达; 抑菌活性
Cloning and expression of a chitinase gene tfchi1 from Talaromyces flavus and the
antifungal activity of the recombinant enzyme 　 XIAN Hong-quan1,2, TANG Wei2, ZHANG
Li-qing1, LI An-na1, LI Duo-chuan1 　 ( 1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018,
China;2College of Life Science, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)
Abstract: In order to study the properties and functions of chitinases from Talaromyces flavus, the full-length
DNA of a chitinase gene, tfchi1 was amplified by RT-PCR, 3′ RACE and 5′ TAIL-PCR. It has 2 561 bp in
length with six introns, and contains an 1194-bp long open reading frame (ORF) encoding a protein of 397
amino acid residues with the calculated molecular mass of 43. 47 kDa. The protein, Tfchi1 belongs to lycoside
hydrolase family No. 18. The plasmid pPIC9K / tfchi1 was constructed and transformed into Pichia pastoris and
a recombinant strain with efficient expression of chitinase, GS-TFCHI1-9 was obtained. Tfchi1 was secreted
successfully with the yield reaching 32. 29 U·mL -1 by the 7-day methanol induction; it had a molecular
weight of about 44. 0 kDa according to the SDS-PAGE detection, which was close to the predicted molecular
mass. The optimal pH and temperature of Tfchi1 were 5. 5 and 35℃ respectively. Tfchi1 was quite stable at
pH ranging from 6 to 8 and its activity was significantly inhibited by Zn2 + , Cu2 + . The results of antifungal ac-
tivity assay showed that Tfchi1 could inhibit the mycelium growth and spore germination of sensitive plant
pathogenic fungi evidently, and the Tfchi1 produced by T. flavus was considered to have potential application
in exploitation of chitin resources and in biological control of plant fungal diseases.
Key words: Talaromyces flavus, chitinase, cloning, Pichia pastoris, gene expression, antifungal activity
中图分类号: S432. 44　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)02-0146-08
　
　 2 期 　 　 咸洪泉,等:黄蓝状菌几丁质酶基因 tfchi1 的克隆、表达及抗菌活性
　 　 菌寄生真菌产生的几丁质酶可以抑制寄主的
菌丝生长、孢子萌发和萌发管的伸长,并能有效降
解寄主细胞壁[1,2],在控制植物病害方面起着重要
的作用。 菌寄生真菌如木霉菌几丁质酶的生物防
治效果优于植物、细菌和其他真菌的几丁质酶 [3]。
黄蓝状菌(Talaromyces flavus)是一种菌寄生真菌,
对核盘菌 ( Sclerotinia sclerotiorum)、齐整小核菌
(Sclerotium rolfsii)、立枯丝核菌(Rhizoctonia sola-
ni)等多种病原菌产生的菌核有重寄生作用[4]。 此
外对棉花大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、刺盘
孢菌(Colletotrichum gossypii)的菌丝生长及分生
孢子萌发,棉立枯丝核菌、棉枯萎尖孢镰刀菌(Fu-
sarium oxysporum f. sp. vasinfectum)的菌丝生长均
有明显的抑制作用[5,6]。 黄蓝状菌做为一种重要
的生防菌,产生的几丁质酶具有很强的抗菌活
性[7]。
随着分子生物学和基因工程技术的发展,越来
越多的几丁质酶基因被分离和克隆,几丁质酶基因
作为重要的抗病基因有些已经被成功转化到生防
菌或植物中[8,9]。 黄蓝状菌是一种重要的生防菌,
但相关几丁质酶基因研究尚未见报道。 本研究从
T. flavus 中成功克隆了一个新几丁质酶基因
tfchi1,获得了高效表达该基因的毕赤酵母工程菌
株,并研究了重组几丁质酶的酶学性质和抑菌活
性,为进一步利用和开发黄蓝状菌几丁质酶奠定了
基础。
1　 材料与方法
1. 1　 菌株与质粒
Talaromyces flavus 菌株 ACCC30960, Esche-
richia coli DH5α、JM109,烟草赤星病菌(Alternaria
alternata) 为本实验室保存; 板 栗 疫 病 病 菌
(Cryphonectria parasitica)、杨树腐烂病菌 (Cyto-
spora chrysosperma)、玉米弯孢病菌(Curvularia lu-
nata)、玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、小麦赤
霉病菌(Fusarium graminearum)由山东农业大学
高克祥教授惠赠。 毕赤酵母 ( Pichia pastoris)
GS115 和 pPIC9K分泌型表达载体购自 Invitrogen
公司;质粒 pMD18-T Vector购自 TaKaRa公司。
1. 2　 酶和生化试剂
RT-PCR试剂盒、胶回收试剂盒、3′ RACE 试
剂盒、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶等工具酶、
IPTG、X-gal、氨苄青霉素、DNA Marker DL2000、λ-
Hind Ⅲ digest DNA Marker 等试剂购自 TaKaRa
公司;Trizol试剂购自 Invitrogen 公司;PCR引物合
成及序列测定由上海博尚生物技术有限公司完成。
1. 3　 培养基
胶体几丁质的制备:称取 20 g 几丁质粉溶于
800 mL预冷的浓盐酸中,搅拌 4 h,待几丁质完全
溶解后,倒入 2 L预冷的 50%乙醇中过夜,用蒸馏
水冲洗至中性,并用水定容至 500 mL备用。
几丁质酶诱导培养基(SM):K2HPO4 870 mg,
KH2PO4 680 mg,KCl 200 mg,NH4NO3 1g,MgSO4
200 mg,4 g 酵母粉,10 g 几丁质粉制备的胶状几
丁质,750 mL蒸馏水,250 mL 自来水,调 pH 值到
6. 5,103. 5 kPa 下湿热灭菌 30 min。 LB、YPD、
MD、MM、BMGY 和 BMMY 培养基见 Invitrogen
公司毕赤酵母操作手册。
1. 4　 主要引物
试验所用主要 PCR引物见表 1。
Table 1　 PCR primers used in the study
Primer Sequence (5′ to 3′ )
Ps1 GCTBTCBATHGGHGGBTGGAC
Ps2 GATGGYATYGAYRTYGAYTGGGA
Pa GCRSWDSYCTCCCAVMACAT
M13M4 GTTTTCCCAGTCACGAC
960bs CCGAATTCTCTGGTTTGAGATCAGTGGTATACTT
960ba GGGCGGCCGCTCAAGGGCCTTGCATCCCT
5′ AOX1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC
3′ AOX1 GGCAAATGGCATTCTGACATCCT
741
　
植物病理学报 42 卷
1. 5　 T. flavus几丁质酶基因的克隆
采用 CTAB法提取 T. flavus基因组 DNA[10],
用 Trizol©试剂从 SM 上 25℃诱导培养 3 ~ 4 d 的
菌体中提取总 RNA,使用 TaKaRa 公司的 RNA
PCR Kit (AMV) Ver 3. 0 试剂盒进行 cDNA 第一
链合成。 根据真菌几丁质酶基因 Aphanocladium
album ( X64104 )、 Aspergillus fumigates ( XM _
742875)、Beauveria bassiana (AY147011)、Botryo-
tinia fuckeliana (AF528506)、Chaetomium cupreum
(EU142805)、Chaetomium globosum (DQ885960)、
Trichoderma harzianum (S78423)、Hypocrea jecori-
na (AB190216 )、 Hypocrea virens (DQ865247 )、
Lecanicillium lecanii ( DQ412944 )、 Metarhizium
anisopliae ( AM181166 )、 Trichoderma hamatum
(THU88560)、Trichoderma sp. w512 (DQ462415)、
Chaetomium thermophilum ( EU697741 )、 Clonos-
tachys rosea (EU000575)和 Paecilomyces lilacinus
(EF183511 ) 的 氨 基 酸 保 守 序 列 LSIGGWT、
DG-D-DWE和MFWEASA设计兼并引物 Ps1、Ps2、
Pa,扩增基因中间片段,进一步采用 RT-PCR、3′
RACE及 5′ TAIL-PCR 的方法克隆该基因的全长
DNA和 cDNA序列。
1. 6　 毕赤酵母重组表达载体的构建
根据克隆到的 T. flavus 几丁质酶基因 cDNA
核苷酸序列,设计一对引物 960 bs 和 960 ba,并在
上下游引物的 5′端分别引入 EcoRⅠ和 NotⅠ酶切
位点及保护碱基。 PCR 反应体系(25 μL):cDNA
2 μL,10 × Buffer 2. 5 μL,10 mM dNTP 2 μL,
25 mM MgCl2 2 μL,0. 5 μL (2. 5 U) EX Taq DNA
聚合酶,10 μM的上下游引物各 1 μL。 PCR 反应
条件为: 94℃ 预变性 3 min; 94℃ 1 min, 56℃
1 min,72℃ 1. 5 min,共进行 32 个循环;72℃延伸
10 min。 PCR 产物与 pMD18-T 连接,得到重组质
粒 pMD18T / tfchi1。
用 EcoRⅠ和 NotⅠ对 pMD18 T / tfchi1 重组质
粒和酵母表达载体 pPIC9K 进行双酶切,回收约
1． 2 kb的 tfchi1 基因片段和约 9. 3 kb的载体片段,
纯化后连接转化 JM109,获得重组质粒 pPIC9K /
tfchi1。
1. 7　 几丁质酶基因转化和在毕赤酵母中的表达
用 SacⅠ对 pPIC9K / tfchi1 线性化,采用电击
法转化毕赤酵母 GS115,G418 筛选多拷贝重组子,
转化子的筛选和鉴定、重组工程菌的诱导表达参照
Invitrogen公司的 Pichia Expression Kit Instruction
Manual。 工程菌株用 BMGY 振荡培养至对数期
(OD600达 2 ~ 6),转接到 BMMY中诱导培养,每隔
24 h 取样 1 mL 并补加 100% 甲醇至终浓度为
0． 5%以维持诱导,直至第 9 d。 4℃、8 000 rpm 离
心 15 min,弃沉淀。
1. 8　 表达产物的纯化
用 90%饱和度硫酸铵沉淀蛋白,0. 05 M pH
6． 0 磷酸缓冲液回溶后,透析除盐得粗酶液,用
SephadexG-100 凝胶过滤层析。 磷酸盐缓冲液
(0． 05 M pH 6. 0)平衡 Sephadex G-100 凝胶过滤
层析柱 ( 40 cm × 1. 0 cm),洗脱流速为 0. 2
mL·min -1。 280 nm 紫外检测吸光值,收集有几
丁质酶活性的组分,进行 SDS-PAGE分析。
1. 9　 表达产物的酶活力检测
采用 DNS法测定几丁质酶的活性[11],反应体
系及反应条件为 500 μL 酶液,加入 1 000 μL 2%
胶体几丁质,37℃反应 60 min,10 000 rpm 离心 5
min,取上清液 1 000 μL,与等体积的 DNS 试剂混
合,煮沸 10 min 后冷却,加水定容至 5 mL,测
OD540值;对照为 100℃处理 10 min 的灭活酶液。
定义每分钟水解几丁质产生 1 μg还原糖所需的酶
蛋白量为一个酶活力单位(U)。
1. 10　 温度和 pH值对几丁质酶反应的影响
测定几丁质酶在不同的温度(25 ~ 80℃)和
pH值(3. 0 ~ 10. 0)下的活性,重复 3 次。 将最高
的酶活力定义为 100% ,分别计算不同条件下的相
对酶活力。
将几丁质酶在不同的温度条件下(25 ~ 55℃)
处理不同的时间(10 ~ 60 min)或在不同的 pH 值
(2 ~ 11)条件下处理 1 h,然后标准条件下测定剩
余酶活力,重复 3 次,将最高的酶活力定义为
100% ,分析酶的稳定性。
1. 11　 不同金属离子对几丁质酶活性的影响
在反应体系中分别加入不同的金属离子
841
　
　 2 期 　 　 咸洪泉,等:黄蓝状菌几丁质酶基因 tfchi1 的克隆、表达及抗菌活性
(Cu2 + ,Ca2 + ,Mn2 + ,Fe2 + ,Zn2 + ,Ba2 + ,K + ,Na + ,
Ag + ,Mg2 + ,Hg + ,NH4 + ),使金属离子的最终浓度
为 0. 05 mol·L -1,以不加金属离子的反应体系中
的酶活性定义为 100% ,测定不同金属离子对几丁
质酶活性的影响。
1. 12　 抑菌活性的鉴定
参照 Guo等[12]和 Zhang等[13]的方法,测定纯
化的几丁质酶抑菌活性。 取无菌水制备的 C. lu-
nata分生孢子悬浮液 (105 ~ 106 个孢子·mL -1)
50 μL与不同剂量的酶液混合,用水补足总体系至
100 μL,使酶活力达到 0 ~ 5 U·mL -1,28℃恒温
培养 6 h后,观察并记录抑制孢子萌发和芽管伸长
的情况;对照以无菌水代替酶溶液。
将病原真菌接种于直径 90 mm 的 PDA 平板
中央,28℃培养 2 ~ 4 d,在菌苔周围距离菌苔边缘
2. 0 cm处放 4 个直径 5 mm灭菌的滤纸片,每个滤
纸片分别加入 0、5、10 和 15 U 的酶液,继续培养,
观察抑菌情况。
2　 结果
2. 1　 T. flavus几丁质酶基因的克隆
采用 RT-PCR、3′ RACE 及 5′ TAIL-PCR 的方
法获得了该基因的全长 DNA 和 cDNA 序列。 基
因全长为 2 561 bp,具有 6 个内含子,长度分别为
129、78、68、65、53 和 59 bp,包含 1 194 bp的 ORF,
编码 397 个氨基酸,理论分子量为 43. 47 kDa,pI
为 4. 97。 编码的蛋白具有典型的几丁质酶催化区
保守序列 SIGG 和 DG-D-DWE,属于糖苷水解酶
第 18 家族几丁质酶。 将该基因定名为 tfchi1,提交
到 GenBank数据库,序列登录号为 GU361769。 将
其氨基酸序列利用 BLAST-P和 DNAMAN程序进
行多序列相似性比较,发现 Tfchi1 与丝状真菌几
丁质酶具有较高的相似性,其中与同属的柄篮状菌
( Talaromyces stipitatus ATCC 10500 ) 几丁质酶
(XP_002480365)相似性最高,达到 96% ,与土曲
霉(Aspergillus terreus NIH2624)几丁质酶 (XP _
001213838)相似性为 75% 。
2. 2　 tfchi1 基因成熟蛋白编码序列的克隆
以引物 960bs 和 960ba 进行 RT-PCR,得到长
约 1 200 bp 的 tfchi1 基因片段,重组质粒酶切鉴
定,结果与理论值相符(图 1-A,图 1-B)。 测序结
果表明,获得了正确的几丁质酶成熟蛋白编码
序列。
2. 3　 表达载体构建
重组质粒 pPIC9K / tfchi1 双酶切 (EcoRⅠ和
NotⅠ)分析显示与理论大小一致(图 1-C),测序结
果表明 ORF正确。
Fig. 1　 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product
A: Lane 1, RT-PCR product amplified with primers 960bs and 960ba. B: Lane 1, pMD18T/ tfchi1 digested with EcoRⅠand NotⅠ.
C: Lane 2, pPIC9K/ tfchi1 digested with EcoRⅠ+NotⅠ. D: Lane 1, PCR product from GS115 / pPIC9K amplified with 5′AOX1
and 3′AOX1; Lane 2, Recombinant yeast PCR product amplified with 5′ AOX1 and 3′ AOX1; Lane 3,
Recombinant yeast PCR product amplified with 960bs and 960ba. M1: DNA Marker DL2 000; M2: λ-HindⅢ
digested DNA marker; M3: DNA marker DL5 000.
941
　
植物病理学报 42 卷
2. 4　 毕赤酵母的电击转化和重组菌株的鉴定
将重组表达质粒 pPIC9K / tfchi1 用限制性内切
酶 SacⅠ线性化,电击转化 P. pastoris GS115(电压
1 500 V),获得 321 个重组转化子。 提取转化子基
因组 DNA作为模板进行 PCR鉴定,用基因特异引
物扩增得到约 1. 2 kb特异片段,用载体 pPIC9K上
的引物 5′AOX1 与 3′AOX1 扩增得到约 1. 7 kb 特
异片段,以转化 pPIC9K 空质粒的 GS115 基因组
DNA为模板扩增得到约 500 bp 特异片段 (图
1-D)。 实际扩增片断长度与理论计算长度一致,
说明 tfchi1 基因已整合到 P. pastoris GS115 的基
因组中。 经发酵和酶活测定筛选到高效分泌表达
Tfchi1 的酵母工程菌株 GS-TFCH1-9。
2. 5 　 重组蛋白诱导表达、纯化及 SDS-PAGE
分析
酵母工程菌株 GS-TFCHI1-9 随着诱导时间的
延长,几丁质酶活性不断增加,甲醇诱导 7 d 酶活
性最高,达 32. 29 U·mL -1 (图 2)。 纯化产物经
SDS-PAGE分析,得到一条约 44 kDa 的特异蛋白
条带,表达蛋白的表观分子量与氨基酸序列推测的
分子量大小基本相符 (图 3)。
Fig. 2 　 The curve of chitinase activity to
times for GS-TFCHI1-9 strain
2. 6　 几丁质酶 Tfchi1 的部分酶学特性
重组几丁质酶的最适作用温度为 35℃,当温
度超过 40℃时,酶活性迅速降低(图 4)。 最适作
用 pH值为 5. 5(图 5)。 在 30℃以下较稳定,35℃
处理 60 min 后,几丁质酶残余酶活力为 44. 36%
(图 6),说明表达的几丁质酶对温度敏感。 在 pH
6 ~ 8 中性环境中几丁质酶较稳定(图 7)。
Fig. 3 　 SDS-PAGE analysis of purified chiti-
nase of Talaromyces flavus ex-
pressed by yeast
M: Molecular weight marker; 1: Purified expression chitinase.
Fig. 4　 The optimum reaction temperature of
the recombinant chitinase
Fig. 5 　 The optimum reaction pH of the
recombinant chitinase
051
　
　 2 期 　 　 咸洪泉,等:黄蓝状菌几丁质酶基因 tfchi1 的克隆、表达及抗菌活性
Fig. 6 　 The thermostability of the recombi-
nant chitinase
Fig.7　 The pH stability of the recombinant chiti-
nase
　 　 不同金属离子(0. 05 mol·L -1)对几丁质酶
Tfchi1 活性的影响不同(表 2),Zn2 + 、Cu2 +等对表
达的几丁质酶有显著的抑制作用,其次是 Fe2 + ;而
K + 、Na + Ca2 + 、Ba2 + 、NH4 + 、Mg2 +对酶活性影响不
大。
Table 2　 Effects of different metal ions on the
recombinant chitinase activity
Metal ion
Relative activity
/ %
Metal ion
Relative activity
/ %
Cu2 + 0. 25 K + 98. 63
Ca2 + 92. 96 Na + 100. 83
Mn2 + 79. 17 Mg2 + 87. 39
Fe2 + 31. 11 NH +4 91. 44
Zn2 + 2. 60 Ba2 + 89. 73
2. 7　 重组几丁质酶的抗菌活性
不同病原菌对几丁质酶的敏感性不同,几丁质
酶对板栗疫病病菌和杨树腐烂病菌菌丝生长抑制
作用最强,对烟草赤星病菌和小麦赤霉病菌抑制作
用较弱,酶活力越高抑制作用越强(图 8)。 几丁质
酶对玉米弯孢病菌和烟草赤星病菌的孢子萌发有
明显的抑制作用(图 9),并且孢子萌发后芽管基本
不再伸长。
3　 讨论
菌寄生真菌几丁质酶基因以木霉菌研究的最
多,已报道木霉几丁质酶基因有 39 个,其中 22 个
为 42 kDa 内切酶基因,开放读码区一般有 3 个内
含子,个别如 nag1 只有 2 个内含子[14]。 黄蓝状菌
在我国土壤中普遍存在,是一种常见的菌寄生真
菌[15,16],我们首次从黄蓝状菌中克隆了一个新的
几丁 质 酶 基 因 tfchi1, GenBank 登 录 号 为
GU361769。 tfchi1 含有 6 个内含子,这在其他菌寄
生真菌几丁质酶基因中极其罕见,它包含一个
1 194 bp的开放阅读框,编码 397 个氨基酸的蛋白
质,理论 MW为 43. 47 kDa,pI 为 4. 97,属 18 家族
几丁质酶。
表达菌寄生菌几丁质酶基因目前常用的有大
肠埃希氏菌表达系统[17]、酿酒酵母表达系统[18]和
巴斯德毕赤酵母表达系统[19],巴斯德毕赤酵母表
达系统不仅具有原核生物易于培养、繁殖快、便于
基因工程操作等特点,同时又具有真核生物蛋白质
加工、折叠、翻译后修饰等功能,其遗传稳定、表达
量高、易于纯化、可高密度发酵,是一种较为理想的
真核蛋白表达系统[20]。 为深入研究 tfchi1 表达产
物的性质,我们构建了毕赤酵母分泌型表达载体
pPIC9K / tfchi1,并成功转化了毕赤酵母,对表达的
几丁质酶进行了酶学性质研究。
Tfchi1 几丁质酶可以强烈抑制敏感病原真菌
菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长,与 Trichothecium
roseum ( Pers. ) Link. [13]、 Trichoderma harzianum
Rifai[21]等其他菌寄生真菌几丁质酶抑菌特性基本
一致。 Tfchi1 对板栗疫病病菌、杨树腐烂病菌、玉
米弯孢病菌和玉米纹枯病菌等病原真菌具有较强
的抑制作用,表明该几丁质酶对植物病原真菌的拮
抗作用具有一定的广谱性,tfchi1 可作为上述植物
病害抗性分子育种的重要候选基因,也可用来构建
151
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 8　 Effect of the recombinant chitinase on mycelial growth of 6 different pathogenic fungi
LY: Cryphonectria parasitica; VS: Cytospora chrysosperma; CM: Curvularia lunata; RS: Rhizoctonia solani;
FG: Fusarium graminearum; AA: Alternaria alternata; CK: 0 U, 1: 5 U, 2: 10 U, 3: 15 U.
Fig. 9　 Effect of the recombinant chitinase on
conidial germination of pathogenic
fungi
CM: Curvularia lunata; AA: Alternaria alternata.
转几丁质酶基因的生防工程菌应用于植物病害的
防治。 Tfchi1 几丁质酶对不同植物病原菌菌丝生
长抑制作用明显不同,说明不同病原菌对几丁质酶
的敏感性不同,这可能与不同植物病原菌的代谢及
细胞壁组成结构差异有关。 T. flavus几丁质酶 Tf-
chi1 分子量约 44 kDa,最适作用温度为 35℃,最适
作用 pH值为 5. 5,Zn2 + 、Cu2 + 、Fe2 +等对表达的几
丁质酶有显著的抑制作用。 Chen等[7]曾从黄蓝状
菌诱导培养 13 d的 SMCS液体培养基中纯化出一
种分子量为 41 kDa 的几丁质酶,其最适反应温度
为 50℃,最适 pH 值是 5,Mn2 +对其有明显的激活
作用,Cu2 + 、Fe2 +对其有强烈的抑制作用。 综合比
较分析,这两种酶的酶学性质明显不同,应为不同
的几丁质酶。 黄蓝状菌可能具有多个几丁质酶基
因,每个基因的表达产物酶学性质亦不尽相同,今
后应加强相关研究。 T. flavus 几丁质酶基因的克
隆、表达、酶学及其抑菌性质研究,为研究菌寄生真
菌黄蓝状菌与寄主之间的相互作用机制奠定了基
础,同时也为植物抗病基因工程研究提供了新的基
因资源。
参考文献
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