全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
!"#$)"*)#!
&修改稿收到日期$
!"#$)",)!%
!!
基金项目$四川省教育厅青年基金"
#*12"""&
#
!!
作者简介$赵经昊"
#3&&
#!男!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究
4)56.7
$
6
8
6065.
(
9:.!
!
#,%+;<5
!!"
通信作者$赵海霞!副研究员!主要从事资源植物分子生物学研究
4)56.7
$
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!
#,%+;<5
苦荞黄酮转运相关蛋白基因
1#!2$3
的克隆及表达分析
赵经昊!李成磊!姚慧鹏!陈
!
惠!赵海霞"!吴
!
琦
"四川农业大学 生命科学学院!四川雅安
,!$"#*
#
摘
!
要$为研究苦荞黄酮转运相关基因!以苦荞"
!"
#
$
%&
()*"*"+,()
#品种)西荞二号*为材料!克隆到
#
条质膜
-
@
./01"23
基因"
(*$+45+6+*37-
@
./01"23+2$
8
$)*9+:3
!
/-*;
#!将其命名为
!*/-*;
通过开放阅读框
"
ABC
#分析!
*/-*;
基因
;DEF
全长
%%3&G
H
!开放阅读框
!&3&G
H
!编码
3,,
个氨基酸残基!理论分子量为
#"3
ID
!等电点
,+*&
氨基酸保守基序比对分析表明!
FJ*K
在植物种间较为保守在茉莉素诱导处理和
$
种光"白色
荧光+
K4D
白光+
K4D
蓝光+
K4D
红光和
LM)2
#处理芽期苦荞后!采用半定量
BN)OPB
和
F7P7
%
比色法分析结果表
明!茉莉素处理后的苦荞胚轴和子叶中
!*/-*;
基因表达量与黄酮含量均显著上升!且二者呈正相关关系&
$
种光
对子叶中
!*/-*;
表达量无显著影响!但均显著增加其黄酮含量&胚轴中!除
K4D
红光外!各种光均显著提高
!*/-*;
表达量和总黄酮含量!且
K4D
蓝光与
LM)2
的影响极显著该研究结果为深入研究
!*/-*;
基因参与
苦荞黄酮转运奠定了基础
关键词$苦荞&质膜
J
@
)FNO6/:
基因&基因表达&黄酮含量
中图分类号$
Q(&$
&
Q(&,
!!!
文献标志码$
F
%&"#
(
)!*+
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1
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P<7:
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S
9.;V7ZV967L0.[:9/.Z
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Y.;>V60,!$"#*
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P>.06
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09/6-):6
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S
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FJ*K
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<9Z6Z.<0
!
\6/;7<0:]X9<5Z69Z69
8
GV;I\>:6Z;V7Z.[69 .^
_
.6"
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#
$
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#
+N>:7:0
S
Z>S
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H
!
60]Z>:ABC
"
A
H
:0B:6].0
S
C965:
#
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H
:0;<)
].0
S
3,,65.0<6;.]/+N>:5<7:;V769\:.
S
>Z!
60].Z/
H
T\6/,+*&+P<0/:9[:]560]
H
>
8
7<
S
:0:Z.;6067
8
/./]:5<0/Z96Z:]Z>6ZFJ*K/69:9:76Z.[:7
8
;<0/:9[6Z.[:.0].XX:9:0Z
H
760Z/
H
:;.:/+
FZZ>:/::]7.0
S
/Z6
S
:8
GV;I\>:6Z
!
/:5.)
_
V60Z.Z6Z.[:BN)OPB6067
8
=:]Z>::?
H
9://.<0
H
9!*/-*;
S
:0:
!
60]F7P7
%
;<7<9.5:Z9.;5:Z><]5:6/V9:]Z>:Z8
7:]<0/60]>
8
)
H
<;8
7/
!
6XZ:9
-
6/5<06Z:/Z9:6Z5:0Z60]].XX:9:0Z7.
S
>Z.0
S
"
W>.Z:X7V<9:/;:0Z
!
K4DW>.Z:
!
K4D27V:
!
K4D
B:]60]LM)2
#
+N>:9:/V7Z//><\:]Z>6Z!*/-*;:?
H
9://.<060]X76[<0<.]/;<0Z:0Z08
>6]6/.
S
0.X.)
;60Z.0;9:6/:
"
1
#
"+"$
#!
GVZ67/<\:]6
H
8
7:]<0/60]>
8H
<;8
7/6XZ:9
-
6/)
5<06Z:/Z9:6Z5:0Z+L0]:967Z>:7.
S
>Z.0
S
/
!
*/-*;:?
H
9://.<0\6/V09:569I6G7:;>60
S
:
"
1
$
"+"$
#
\>.7:
X76[<0<.]/;<0Z:0Z\6/96./:]8
.0;8
7:]<0/+J<\:[:9
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.0>
8H
<;8
7/
!
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H
9://.<060]X76)
[<0<.]/;<0Z:0Z\:9:
H
9<58
"
1
#
"+"$
#
:?;:
H
ZK4DB:]+O69Z.;V7697
8
!
K4DG7V:60]LM)2
H
9:/)
:0Z:]Z>::?Z9:5:7
8
/.
S
0.X.;60Z6XX:;Z
"
1
#
"+"#
#
+N>./\<9I;H
9<[.]:60.5
H
<9Z60Z9:X:9:0;:Z/Z60]Z>:5:;>60./5S
:0:.0[<7[:].0X76[<0<.]/Z960/
H
<9Z6Z.<0.0Z69Z69
8
GV;I\>:6Z+
;.
1
<"-!/
$
!"
#
$
%&
()*"*"+,()
&
H
76/565:5G960:-
@
./01"23
S
:0:
&
S
:0::?
H
9://.<0
&
X76[<0<.]/;<0Z:0Z
!!
黄酮化合物是植物中一大类重要的次生代谢产
物!由细胞质多酶复合体合成后!可在位于生物膜上
的各类转运蛋白帮助下进行胞内跨膜或长距离运
输-#.现已了解的黄酮转运主要依赖以下
%
种类
型$
F2P)N
8H
:
类型的转运体"
FNOG.0].0
S
;6/)
/:ZZ:)N
8H
:Z960/
H
<9Z:9/
#
-
!
.
!
`FN4
型转运体"
`F)
N4)N
8H
:Z960/
H
<9Z:9/
#
-
%
.和质子依赖型转运"
H
9<)
Z<0)]:
H
:0]:0ZZ960/
H
<9Z:9/
#
-
*
.
其中!质膜
J
@
)
FNO6/:
类蛋白通过建立的跨膜质子电动势!带动
其它次级运输体参与原花青素和黄酮醇的运输-$.
J
@
)FNO6/:
是植物细胞的)主宰酶*!由它建立的
跨膜质子电动势是物质跨膜运送的原初动力近年
研究发现!干旱+低温+盐渍和射线辐照等逆境都影
响
J
@
)FNO6/:
的活力!并认为该酶活力的变化是
植物伤害的原初位点-$.!质子依赖型转运体按亚细
胞定位的结果大致分为定位于细胞质膜的
O)Z
8H
:
J
@
)FNO6/:
!以及细胞内膜上的
M)Z
8H
:J
@
)FN)
O6/:
和焦磷酸酶"
OO6/:
#
%
种!其中
O)Z
8H
:J
@
)
FNO6/:
参与了逆境胁迫下生物膜上的反应-,.
FJF#"
"
/"6+7$
%
2+2*5"9+"4"6VZ<.0>.G.Z:] J
@
)
FNO6/:./#是拟南芥"
/"6+7$
%
2+2*5"9+.
"4"
#中
O)Z
8H
:FNO6/:
家族的一员!
/-/#"
基因
的缺失导致花青素在相应的突变体的种皮中不能积
累!说明定位于细胞内膜系统的
O)Z
8H
:J
@
)FN)
O6/:
与植物黄酮转运存在着相关性-(.
苦荞"
!"
#
$
%&
()*"*"+,()
#为食药两用植
物!含有丰富的黄酮类化合物-&.!对人体具有降脂+
降糖和抗氧化等药理作用和生理功能-3.以芦丁为
代表的黄酮!主要在苦荞萌发阶段的子叶"
$a
"
,a
#
-
#"
.和花期的花蕾"
,+"a
"
,+$a
#
-
##
.中积累!参
与抵抗
LM)2
辐射+抗寒+抗旱等生理过程-#!)#*.!无
论是正常生长或受到环境胁迫!子叶中的黄酮含量
均高于胚轴!但二者黄酮合成相关基因表达水平却
并不如此!即不同组织器官黄酮含量与黄酮相关合
成酶基因表达水平并非线性相关!提示在苦荞中存
在黄酮跨膜运输机制-#$.本研究以高黄酮苦荞栽
培种)西荞
!
号*为材料!克隆其
J
@
)FNO6/:
基因
的
;DEF
!分析在茉莉素和不同光处理后!芽期苦荞
子叶和胚轴中
J
@
)FNO6/:
基因的表达与总黄酮含
量!研究该酶在苦荞黄酮转运中的分子调控机制
#
!
材料和方法
=+=
!
实验材料及处理
)西荞二号*苦荞种子购自西昌学院!种植于四
川农业大学生命科学学院实验田!在花期取新鲜幼
嫩叶片提取
BEF
!用于
!*/-*;
基因的克隆
!"#%
年
##
月!参照赵海霞等-#,.的方法萌发苦
荞种子将苦荞种子置于
*"b
蒸馏水中浸泡
%"
5.0
!均匀铺在盖有滤纸的培养皿中并保持滤纸湿
润!
$b
暗室萌发种子萌发
!]
后!选长度为
#
;5
的苦荞芽!移植在新培养皿中并覆盖
#;5
厚细
砂于光照培养箱光照条件下
!$b
培养
#*>
!黑暗
条件下
#&b
培养
#">
!并保持相对湿度
,"a

参照杨文杰等-#(.和
YV=VI.
等-#&.的方法!选取
萌发
&]
长势相近的芽期苦荞为材料!将终浓度为
#""
#
5<7
%
K
的茉莉素"
-
6/5<06Z:/
!
RF/
#水溶液每
%"5.0
均匀喷洒
#
次!分别收集处理
"
+
!
+
*
+
,
+
&
和
#">
后的子叶和胚轴备用选取萌发
,]
长势相近
的芽期苦荞为材料!在以下光照条件下分别进行培
养$黑 暗 培 养&强 度 为
"+# `W
%
;5
! 的
LM)2
"
%&$05
#照射&白色荧光"
C
#+
K4D
白光"
W
#+
K4D
红光"
B
#和
K4D
蓝光"
2
#照射!光强保持在"
$"c$
#
#
5<7
/
5
!
/
/
#
&光照
#!>
%
]
!连续处理
%]
后!分
别收集子叶和胚轴备用
=+>
!
实验方法
=?>?=
!
苦荞叶片总
@A0
提取和
:BA0
第一链制备
!
称取苦荞新鲜叶片
!+"
S
!以植物
BEF
试剂盒
提取总
BEF
!电泳检测其完整性采用逆转录试剂
盒"
B:[:9ZF.]
N`
C.9/Z/Z960];DEFY
8
0Z>:/./d.Z
#
将总
BEF
逆转录获得
;DEF
模板!分装后置于
&"b
保存
=?>?>
!
苦荞
C
D
E05F)/.
基因的克隆
!
根据
EP2T
中拟南芥及其他被子植物的质膜
J
@
)FNO6/:
基因
/-/#"
"
FN#e#(!,"
#的同源比对结果!设计简并
引物
FJF
<
6)X
和
FJF
<
6)9
"表
#
#!以
;DEF
为模
板!使用高保真
DEF
聚合酶
%8
(
进行
OPB
扩增获
得苦荞
J
@
)FNO6/:
基因保守序列片段反应参数
为$
3*b
预变性
*5.0
&
3*b
变性
$"/
!
$&b
退火
*$
/
!
(!b
延伸
#+$5.0
!
%"
个循环&
(!b
继续延伸
#"
5.0

OPB
产物经
#+$a
琼脂糖凝胶电泳!回收清
晰条带加
F
尾经
N
载体克隆!筛选阳性转化子送上
海立菲生物技术有限公司测序根据测序结果!设
计特异引物
8
*FJ$)#
+
8
*FJ$)!
进行
$f)BFP4
!使
用特异引物
8
*FJ%)#
+
8
*FJ%)!
和
8
*FJE%)%
进行
%f)BFP4
根据
$f)BFP4
和
%f)BFP4
测序结果拼
接获得苦荞
J
@
)FNO6/:
基因全长
;DEF
序列!设
计特异引物
8
*FJ*K)X
和
8
*FJ*K)9
扩增其
ABC
序列
!#$#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
=+>+G
!
生物信息学分析
!
采用
DEF560
"
M:9)
/.<0$+!!
#将得到的核苷酸序列推导为氨基酸序
列!采用
EP2T
数据库的
276/Z)
H
"
>ZZ
H
$%%
G76/Z+0;)
G.+075+0.>+
S
<[
%
276/Z+;
S
.
#进行同源比对!采用
P7V/Z67^
"
#+&
#进行基于氨基酸序列的多重序列比
对!
YAO` F
"
>ZZ
H
$%%
0
H
/6)
H
G.7+.G;
H
+X9
%
;
S
.)G.0
%
0
H
/6
(
6VZ<56Z+
H
7
0
H
6
S
:g
%
EOYF
%
0
H
/6
(
/:;;<0/+
>Z57
#进行二级结构分析!结合
OYTOB4D
"
>ZZ
H
$%%
G.<.0X+;/+V;7+6;+VI
%#预测蛋白质跨膜区!采用
YWTYY)` AD4K
"
>ZZ
H
$%%
G:Z6+/\.//5<]:7+:?
H
6/
8
+
<9
S
%#数据库进行三维同源建模!采用
`4eF,+"
构建系统发育树
=?>?$
!
1#!2$3
表达量分析和总黄酮测定
!
参照
吴琦等-#3.的方法采用半定量
BN)OPB
"
/:5.)
_
V60Z.)
Z6Z.[:BN)OPB
#!使用引物
8
*FJF/)X
和
8
*FJF/)9
检测
!*/-*;
在苦荞子叶和胚轴中的表达量!以引
物
8
*J%/5)X
和
8
*J%/5)X
检测持家基因
-%
的表
表
=
!
基因克隆及
@5EF%@
扩增所用的引物
N6G7:#
!
O9.5:9/V/:].0Z>:65
H
7.X.;6Z.<060]BN)OPB
引物名称
O9.5:9;<]:
引物序列"
$f
%
%f
#
O9.5:9/:
_
V:0;:
FJF
<
6)X PFFeNNPPNeFFeNNPPNeee0ZZ
8
6Z
S
Z
SS
6
FJF
<
6)9 PFPFePFPeNPPFNe;;0
S
;;6Z
8
Z;
8
*FJ$)# FFFPeFFeeNePNNFeFeFNeeNPePNeeF
8
*FJ$)! NNNeeNFFeePNePPPFNNNeeNeFFPF
8
*FJ%)# NNeeNFFeePNePPPFNNNeeNeFFPFe
8
*FJ%)! PPFFPFPPePFFeNFPFeeFeNeeeFNN
8
*FJE%)% PePPFNePPPFPFeNeFNeNPNeNNFPF
8
*FJ*K)X eFNFNFFePFFPeFNeePNePFFFe
8
*FJ*K)9 eFeNPNPNFeFPFeNeNFePNNNePNe
8
*FJF/)X PFeNNFPFeeeFFPNFNPPeFeFNFePPeF
8
*ZFJF/)9 PPPPFFPFPFFFPPFNPPNPPNNFNPP
8
*J%/5)X eFFFNNPePFFeNFPPFeFFeFe
8
*J%/5)9 PPFFPFFeeNFNePPNPFeP
达量为内参"表
#
#利用凝胶成像系统扫描电泳结
果!以
!*/-*;
与
-%
的光密度值比值"
<
H
Z.;67.0)
Z:0/.Z
8
%
<
H
Z.;67.0Z:0/.Z
8
#来表
示
!*/-*;
相对表达量
采用
F7P7
%
法-#&.测定总黄酮!在
*!"05
波长
下测定吸光度!绘制标准曲线!拟合回归方程!并计
算相关系数苦荞子叶和胚轴样品冷冻干燥置至恒
重!研磨样品至粉末!精确称量
"+#""
S
样品至
#"
5K
离心管中!加入
%5K,$a
乙醇并使用封口膜密
封使用超声波细胞破碎仪!以
#$a
的输出功率超
声
!"5.0
提取总黄酮
#!"""9
%
5.0
离心
$5.0
后
转移上清至另一离心管中!再次加入
!5K,$a
乙
醇!继续超声
#"5.0

#!"""9
%
5.0
离心
$5.0
后
转移并合并上清!使用等体积石油醚萃取排除叶绿
素干扰!反复萃取至石油醚为无色透明后!使用分液
漏斗分离并收集下层液体并使用
"+*$
#
5
有机相
滤膜过滤!所得样品即为苦荞总黄酮提取液测定
样品
=>
*!"
!对照标准曲线求得苦荞组织中总黄酮
含量"
a
#
=+>+H
!
数据的分析和处理
!
用
YOYY#3+"
软
件进行
DV0;60
多重比较及显著性检验!同时进行
双变量
O:69/<0
相关性分析
!
!
结果与分析
>?=
!
苦荞
C
D
E05F)/.
基因的克隆
使用简并引物
/-/
<
6)X
和
/-/
<
6)9
扩增
J
@
)
FNO6/:
基因保守片段!获得
#
条长度约为
($"G
H
的特异片段"图
#
!
F
#测序结果表明!该片段长
&#%G
H
!与其他植物
J
@
)FNO6/:
具有
((a
"
&*a
的同源性使用特异引物
8
*FJ$)#
和
8
*FJ$)!
进
行
$f)BFP4
!得到
#
条长约
($"G
H
的特异条带
"图
#
!
2
#使用特异引物
8
*FJ%)#
+
8
*FJ%)!
和
图
#
!
苦荞
!*/-*;
基因克隆
F+#+
保守片段扩增&
2+#)!+$f)BFP4
第一+二轮
OPB
产物&
P+#)%+%f)BFP4
第一+二+三轮
OPB
产物&
D+#+ABC
扩增&
`+DEF569I:9
C.
S
+#
!
P7<0.0
S
@
./01"23
S
:0:!*/-*;X9<5Z69Z69
8
GV;I\>:6Z
F+#+P<0/:9[:]X96
S
5:0Z
&
2+#
"
!+Z>:X.9/Z
!
/:;<0]9H
9<]V;Z/:$f)BFP4
&
P
$
#
"
%+Z>:X.9/Z
!
/:;<0]60]
Z>.9]9H
9<]V;Z/:%f)BFP4
&
D+#+F5
H
7.X.;6Z.<0&
`+DEF569I:9
%#$#
&
期 赵经昊!等$苦荞黄酮转运相关蛋白基因
!*/-*;
的克隆及表达分析
8*FJE%)%
进行
%f)BFP4
!得到
#
条约
#&""G
H
的
特异条带"图
#
!
P
#将保守片段序列与
$f)BFP4
和
%f)BFP4
测序数据进行拼接!根据拼接结果设计
的特异引物
8
*FJ*K)X
和
8
*FJ*K)9
扩增苦荞
J
@
)
FNO6/:
基因
ABC
!获得
#
条约
%"""G
H
的特异条
带"图
#
!
D
#序列分析表明!苦荞
J
@
)FNO6/:
基
因的
;DEF
序列全长
%%3&G
H
!其
ABC
为
!&3&
G
H
!
$f)LNB
为
#("G
H
!
%f)LNB
为
%%#G
H
并包含
!$
G
H
的
O<7
8
F
尾!将该基因命名为
!*/-*;
!
e:0)
260I
登录号为
dC3$$,"#

>?>
!
苦荞
360C$I
的序列分析与系统发育树
>?>?=
!
苦荞
360C$I
序列分析
!
DEF560
分析表
明!
*/-*;
基因编码
#
个
3,,
氨基酸残基的蛋白
CZFJ*K
!分子量
#"3ID
!等电点
,+*&

276/ZO
同
源比对表明!该序列与其他植物
CZFJ*K
蛋白一致
率在
3(a
以上选取双子叶植物拟南芥+单子叶植
物玉米"
?3")"
&
2
#和人类"
-$)$2"
%
+342
#的质膜
O)Z
8H
:J
@
)FNO6/:
蛋白与
CZFJ*K
氨基酸序列进
行序列多重比对!表明其含有
FNO6/:
特异的基序$
磷酸酯酶膜转导区
Ne4
基序+磷酸化作用区
DdN)
eN
基序+连接
FNO
结合区与参加阳离子结合和转
导跨膜区保守功能域
` e^De^ ED^ O
结构"图
!
#
YOA`F
分析表明!
CZFJ*K
二级结构中含有
#"
个
$
螺旋组成的跨膜区!
#"
个
$
螺旋与
*
个
%
片层加
上一些无规则卷曲组成了该蛋白包含底物结合位点
在内的活性中心三维同源建模结果表明"图
%
#!
图
!
!
苦荞
CZFJ*K
与其他
J
@
)FNO6/:*
保守基序比对
Ne4+
磷酸酯酶膜转导区基序&
DdNeN+
磷酸化作用区基序&
` e^De^ ED^ O+
连接
FNO
结合区与参加阳离子结合和
转导跨膜区保守功能域基序
C.
S
+!
!
N>9::;<0/:9[:]5S
05:0ZG:Z\::0CZFJ*K
60]O)Z
8H
:J
@
)FNO6/:*X9<5:9/
H
:;.:/
Ne4+` H
>H
>6Z6/:5:5G960:Z960/]V;Z.<0]<56.0
&
DdNeN+` &
` e^De^ ED^ O+` ;<00:;Z.<0./Z)2D60]Z960/5:5G960:]<56.0
CZFJ*K
蛋白的三维结构与
Y\.//)` <]:7
蛋白质数
据 库 中 拟 南 芥
6VZ<).0>.G.Z:] J
@
)FNO6/: !
"
FJF!
#相似度最高!具备典型的
O)Z
8H
:J
@
)FN)
O6/:
特征
CZFJ*K
的三维结构主要由跨膜区结
构区"
Z960/5:5G960:]<56.0
#与细胞质功能域"
;
8
)
Z<
H
76/5.;]<56.0
#即
FNO
结合功能域"
FNOG.0])
.0
S
]<56.0
!
FNO)2D
#组成前者为质子进出的通
道!后者则由大小
!
个细胞质环组成小的细胞质
环有
!
个螺旋!为能量传动区
F
"
6;ZV6Z<9]<56.0
!
F)]<56.0
#!控制阳离子的结合与释放&大的细胞质
环包括了磷酸化功能域
O
"
H
>H
><9
8
76Z.<0]<)
56.0
!
O)]<56.0
#和核酸结合区
E
"
0V;7:.0
S
]<56.0
!
E)]<56.0
#预测结果表明
CZFJ*K
属于典型的质膜
O)Z
8H
:J
@
)FNO6/:
蛋白
>?>?>
!
360C$I
系统进化树分析
!
选取
e:0260I
数据库中被子植物
O)Z
8H
:J
@
)FNO6/:
的蛋白序
列!采取
`4eF,
软件的邻接法重复
#""""
次构建
基于氨基酸序列的系统进化树"图
*
#结果表明!
该系统进化树可以分为
%
个簇其中
P7V/Z:9
&
主
要由 单 子 叶 植 物 的
O)Z
8H
: J
@
)FNO6/:
组 成!
CZFJ*K
被聚类至
P7V/Z:9
&
!并显示与玉米的亲缘
关系最近
P7V/Z:9

包含了大部分双子叶植物的
O)Z
8H
:FNO6/:
!
P7V/Z:9
(
由包括拟南芥在内的
%
种双子叶植物所组成
>?G
!
茉莉素对苦荞
1#!2$3
表达及黄酮含量的
影响
!!
芽期苦荞经茉莉素连续处理
#">
!
!*/-*;
的
表达量分析表明"图
$
!
F
#!处理后
!*/-*;
表达量
比对照"
">
#均极显著提高"
1
#
"+"#
#子叶中!
!*/-*;
表达对茉莉素诱导应答强烈!处理仅
!>
图
%
!
苦荞
CZFJ*K
的三维结构预测
F+
能量传动区&
O+
磷酸化功能域&
E+
核酸结合区
C.
S
+%
!
N>:%].5:0/.<0/Z9V;ZV9:5<]:7.0
S
X<9CZFJ*K
F+F;ZV6Z<9]<56.0
&
O+O>H
><9
8
76Z.<0]<56.0
&
E+EV;7:S
]<56.0
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
*
!
植物
FJ*K
系统进化树
图中数字为自举检验置信值"
#""""
个复制序列#
C.
S
+*
!
O>
8
7<
S
:0:Z.;Z9::H
760Z/G6/:]<065.0<6;.]/:
_
V:0;:/
EV5G:9/<0Z>:Z9::9:
H
9:/:0Z;<0X.]:0;:[67V:/X9<5G<H
Z:/Z
"
#""""9:
H
7.;6Z:/
#
图
$
!
茉莉素对芽期苦荞
!*/-*;
表达量"
F
#和黄酮含量"
2
#的影响
大写字母表示子叶
!*/-*;
表达量和黄酮含量差异显著性检验"
1
#
"+"$
#&
小写字母表示胚轴
!*/-*;
表达量和黄酮含量差异显著性检验"
1
#
"+"$
#&下同
C.
S
+$
!
!*/-*;:?
H
9://.<0
"
F
#
60]X76[<0<.];<0Z:0Z
"
2
#
.0/::]7.0
S
Z69Z69
8
GV;I\>:6Z\.Z>
-
6/5<06Z:/Z9:6Z5:0Z
P6
H
.Z677:ZZ:9/5:60/.
S
0.X.;60;:Z:/ZH
9://.<060]X76[<0<.]/;<0Z:0Z.0
;8
7:]<0/
"
1
#
"+"$
#&
0<95677:ZZ:9/5:60/.
S
0.X.;60;:Z:/ZH
9://.<060]
X76[<0<.]/;<0Z:0Z.0>
8H
<;8
7/
"
1
#
"+"$
#&
Z>:/65:6/G:7<\+
后其表达量就超过对照的
!+$
倍!相对表达量达到
%"!a
!然后下降至
,>
的
#3%a
!随后迅速上升并稳
定在
%""a
左右胚轴中!处理
!>
后!
!*/-*;
表
达量上升至对照的近
#+%
倍!相对表达量的
!3,a
!
并于
,>
达到最高"
%("a
#!随后下降至
#">
的
%""a
黄酮含量测定表明"图
$
!
2
#!茉莉素诱导
下!芽期苦荞子叶和胚轴中黄酮含量均表现为随时
间逐步升高!并于
#">
达到最大值!子叶中黄酮含
量为诱导前的
#+%
倍"
1
#
"+"#
#!胚轴中则为处理
前的
#$
倍"
1
#
"+"#
#相关分析表明!芽期苦荞子
叶与胚轴
!*/-*;
表达量与黄酮含量均呈正相关!
子叶和胚轴中的相关系数分别为
"+,$$
和
"+,(&

$#$#
&
期 赵经昊!等$苦荞黄酮转运相关蛋白基因
!*/-*;
的克隆及表达分析
图
,
!
光照对芽期苦荞
!*/-*;
表达量"
F
#和黄酮含量"
2
#的影响
C.
S
+,
!
!*/-*;:?
H
9://.<0
"
F
#
60]X76[<0<.];<0Z:0Z
"
2
#
.0/::]7.0
S
Z69Z69
8
GV;I\>:6Z\.Z>].XX:9:0Z7.
S
>Z.0
S
Z9:6Z5:0Z
>?$
!
光照对苦荞
1#!2$3
表达及黄酮含量的影响
以黑暗为对照!采用白色荧光+
K4D
白光+
K4D
红光+
K4D
蓝光和
LM)2
光照处理芽期苦荞!
!*/-*;
表达量分析表明 "图
,
!
F
#$胚轴中!
!*/-*;
表达量仅在
K4D
红光组显著降低"
1
#
"+"$
#!为对照组的
3*a
!在其他光照下都显著升
高!其中在
K4D
蓝光和
LM)2
组为极显著增加"
1
#
"+"#
#!相对表达量达到
%"(a
和
%$*a
子叶中!
!*/-*;
表达量在所有光处理组均无显著变化
!*/-*;
在胚轴中的表达量都显著高于子叶!表明
其表达具有组织特异性黄酮含量测定表明"图
,
!
2
#!所有光照组胚轴与子叶黄酮含量均显著上升
其中!
K4D
蓝光和
LM)2
组呈极显著升高!子叶黄
酮含量为对照的
#+*
倍和
!+"
倍!胚轴黄酮含量则高
达对照的
!+(
倍和
$+3
倍可见!各种光照下苦荞子
叶
!*/-*;
表达量与黄酮含量无明显相关!但胚轴
!*/-*;
表达量与黄酮含量具有正相关性
%
!
讨
!
论
J
@
)FNO6/:
是广泛存在于植物质膜和各种内
膜系统中的一种膜蛋白!在细胞代谢过程中起着重
要的作用!是真核生物必不可少的一类质子泵-!".
业已证明!植物黄酮合成的酶类以多酶复合体的形
式存在于细胞质中-!#.!但黄酮的积累却具有组织特
异性-#.!说明细胞中存在黄酮的转运机制
#3&(
年!
J<
HH
等通过观察从胡萝卜分离出来的经放射
性标记的花青素!从而首次发现液泡吸收类黄酮物
质必须依赖细胞质和液泡之间质子梯度提供能
量-!!.通过该现象!进一步认识到质子梯度的形成
必须依赖液泡膜上质子泵的作用-!%.无论是矮牵
牛花里已经定位到液泡膜上的
OJ$
-
!%
.
!还是拟南芥
中尚未得到精确定位的
FJF#"
-
#
.
!它们在植物黄
酮转运过程中扮演的角色主要是改变质膜两边的电
化学梯度!改变液泡中的
H
J
和影响液泡中的原花
青素含量本研究获得的苦荞
CZFJ*K
在进化上
处于单+双子叶植物进化中的过渡状态-!*.!与拟南
芥
FJF#"
高度同源!提示其可能参与苦荞中的黄
酮转运过程
已有研究表明!在正常生理条件-#,.或在各种处
理条件下-!$.!苦荞胚轴中黄酮合成途径相关酶基因
表达量无论比子叶中高还是低!其黄酮含量均显著
低于子叶!这可能与黄酮在苦荞中的累积特点相关!
即苦荞胚轴中合成的黄酮可被转运到子叶-!,.本
研究中!在茉莉素和各种光处理芽期苦荞前后!胚轴
!*/-*;
表达量均不同程度高于子叶!但子叶黄酮
含量均显著高于胚轴"
1
#
"+"$
#!也支持上述观点
此外!在苦荞胚轴中!
!*/-*;
基因的表达不仅对
茉莉素!而且对蓝光和紫外光均具有强烈的响应&而
在苦荞子叶中!
*/-*;
基因的表达仅对茉莉素具
有强烈的响应该现象提示!苦荞胚轴与子叶中可
能存在两套不同的非生物胁迫响应机制!进而导致
其黄酮积累过程和机制的差异
目前!尽管对于植物黄酮胞内转运+跨膜转运及
其调控机制的了解甚为有限!但随着基因组共表达
微阵列分析和突变体等分子遗传学分析的深入!将
有助于揭示膜转运蛋白在代谢流调控中的重要作
用-!(.本研究拟进一步分析苦荞在各种逆境胁迫
条件下!
*/-*;
基因表达模式及与各种黄酮化合
物含量和组织分布规律!以加深对苦荞黄酮胚轴和
子叶黄酮转运和积累机制的理解
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西
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北
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物
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参考文献!
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