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Genetic Diversity of Pennisetum longissimum var.intermedium Germplasm Resources Using ISSR Markers

中型狼尾草种质资源遗传多样性的ISSR分析



全 文 :书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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#&甘肃省农业科技创新项目"
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#&中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金
"
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#&兰州市科技计划项目"
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作者简介$张怀山"
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#!男!博士!助理研究员!主要从事草类植物种质资源与育种研究
6)78.9
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中型狼尾草种质资源遗传多样性的
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分析
张怀山#!夏曾润!!栗孟飞%!王春梅#!杨世柱#
"
#
中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所!农业部兰州黄土高原生态环境重点野外科学观测试验站!兰州
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&
!
兰州大学
草地农业科技学院!草地农业生态系统国家重点实验室!兰州
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%
甘肃农业大学 生命科学技术学院!干旱生境作物学重点
实验室!兰州
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#

!
要$运用
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标记对采自云南的
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份野生种质和
$
份驯化新品系中型狼尾草材料进行遗传多样性分析结
果显示$"
#
#
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?@@A
引物中共筛选出
#"
条能扩增出清晰条带且多态性明显的引物!
*
份材料
B3C
共获得
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个扩增位点!其中多态性位点
!
个!多态性比率为
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!平均每条引物扩增位点为
,+!
个&平均观察等位基因数
"
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多样性信息指数"
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(
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"
"+*"%
!表现出丰富的遗传多样性"
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#利用
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2HC
聚类分析!以遗传相似系数
"+&#
为界!
*
份材料划分为
$
大类!但
H80IE9
检测表明
!*
份种质材料的遗传聚
类和地理距离之间不存在显著的正相关关系"
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!
J"+!"$
#研究结果首次从分子水平揭示了中型狼
尾草的遗传多样性和变异水平!为合理地引种(驯化(保护和利用中型狼尾草野生资源提供了重要的参考依据和数
据支持
关键词$中型狼尾草&
?@@A
标记&种质资源&遗传多样性
中图分类号$
K%$
L
+&
&
K,1*
文献标志码$
C
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中型狼尾草"
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#是陈守良等在
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年发现并命名的长
序狼尾草新变种*#+!为禾本科"
2P87.0E8E
#狼尾草属
"
#(()*#+,-
#多年生疏丛型草本植物!中国云南(四
川(贵州(湖南(甘肃等地均有分布中型狼尾草茎
秆较粗壮!根系发达!具有适应性广(再生能力强(容
易栽培(产草量高(少有病害等优良特性*!+!营养成
分相对较高!是一种重要的饲草资源!其抗旱(耐湿
性较强!并具有适度的耐盐碱性!也是一种良好的水
土保持(防风固沙植物!具有较高的生态价值
遗传多样性不仅表现在表型性状上的差别!更
重要的是表现在蛋白质(染色体和
B3C
水平上的
差异分子标记的发展为从
B3C
水平检测种质资
源的遗传多样性提供了有利的工具
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"
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9E/E
a
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E8I/
#是由加拿大蒙特利尔大学

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等*%+于
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年提出的一种建立在
G4A
反应基础上的新型微卫星类分子标记技术
该技术具有无需预知基因组背景信息(
B3C
样品用
量少(信息量大(结果记录方便(实验成本低(操作简
单(重复性好等优点!可以揭示出比
C]QG
(
ACGB
(
@@A
更丰富的多态性!而且不受季节(环境等外在
因素的影响*$)&+
?@@A
目前已被广泛运用于植物种
质资源鉴定(基因定位(遗传作图(进化(系统发育(
物种分类及分子标记育种等研究中!是植物遗传多
样性分析中的主要技术手段之一*)#"+
中型狼尾草属于典型的异花授粉植物!分布甚
广!在其演化过程中无疑存在着种间杂交或平行进
化等复杂现象!揭示其演化途径和不同地域野生种
间的明确亲缘关系是一项繁复而持久的探究工作
国内目前对中型狼尾草的研究主要侧重于形态分
类*##+(引 种驯化*#!+(生 产 性 能*#%+(生 理 生 态 特
性*#$)#&+等方面!而从分子水平对中型狼尾草遗传多
样性的研究还未见报道基于此!本研究利用
?@@A
分子标记手段对从采自云南的
!&
份野生种质和
$
份驯化新品系的中型狼尾草材料进行种间遗传多样
性分析!旨在探索
?@@A
分子标记法在中型狼尾草
品种鉴定与分类(系统发育等研究中的可行性!同时
也为中型狼尾草种质资源的开发利用及新品种培育
提供理论依据
#
!
材料和方法
@+@
!
供试材料
!*
份中型狼尾草材料均采自云南(甘肃两省各
地其中!
#
"
$
号材料是人工驯化品系!原材料来
自云南昆明!
""1
年引种栽培于甘肃兰州大洼山牧
草试验基地!
"##
年收种&
&
"
!*
号材料于
!""*
"
!"#"
年采自云南各地的野生种质!具体来源见表
#

@3A
!
,B<
提取及定量
每份材料随机取
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"
#&
个单株的新鲜幼嫩叶
片!等量混合!采用改良
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"
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W
9/O9)
R8IE
!十二烷基硫酸钠#法*#+提取植物总
B3C

#+"D
的琼脂糖凝胶电泳检测
B3C
质量!经紫外可
见分光光度计"
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#测定其浓度和相对纯度
后!最终用
X6
稀释至
#"0
<
%
#
Q
!
(!"b
保存备用
@3C
!
$%%&
引物的筛选
本试验根据加拿大哥伦比亚大学"
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!
Fc4
#核酸蛋白服务工作室公
布的
#""

?@@A
引物"
Fc41"#)Fc4*""
#序列设
计!挑选
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条交由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成最终筛选出
#"
条扩增条带较多(结果稳
定(背景清晰的引物用于中型狼尾草
?@@A)G4A

应"表
!
#
@3D
!
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反应体系的建立与优化
将筛选引物分别在野生大麦"
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0
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*
#,
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(早熟禾"
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#
*
#1
+
(沙鞭"
*"-6
-/9:./"7)../*"
#
*
#*
+和小花棘豆"
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8
)*
0
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#
*
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+的
?@@A
反应体系和反应程序下进行扩增!
通过预试验!建立了一套中型狼尾草
?@@A
分析的
优化反应体系及反应程序
!"
#
Q
反应体系包括$
*+,$
#
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!
Y
!
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#
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引物!
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@
B3C
聚合酶!
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<
B3C
模板反应程序为$
*$
,&!
!

!!!!!!!!!!!!
张怀山!等$中型狼尾草种质资源遗传多样性的
?@@A
分析

@
!
试验材料及来源
X8U9E#
!
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EP.7E0I8978IEP.89/
编号
3>+
采集地点
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海拔
C9I.IOVE
%
7
经纬度
Q>0
<
.IOVE80V98I.IOVE
#
甘肃兰州大洼山
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Q80:;>O
!
280/O #,&" %e"#f3
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甘肃兰州大洼山
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Q80:;>O
!
280/O #,&" %e"#f3
!
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%
甘肃兰州大洼山
B8_8/;80
!
Q80:;>O
!
280/O #,&" %e"#f3
!
#"%e$&f6
$
甘肃兰州大洼山
B8_8/;80
!
Q80:;>O
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280/O #,&" %e"#f3
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云南昆明官渡区福保村
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云南昆明西山区采莲河
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云南昆明呈贡区中和村
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#1*% !$e$*f3
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云南昆明呈贡区罗家村
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O^07.0
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#1*" !$e$*f3
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云南昆明晋宁县杨家河
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云南昆明西山区河尾村
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!
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##
云南昆明官渡区新河村
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#11* !$e&*f3
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#"!e%*f6
#!
云南昆明呈贡区滇池边
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#1*" !$e&#f3
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#"!e$$f6
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云南嵩明县腰站村
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#"!e"f6
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云南嵩明县苔才村
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#"!e$f6
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云南嵩明县青龙潭
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#
云南宜良县凤鸣村
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7.0
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TO0080 #,1% !$e&,f3
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#"%e"!f6
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云南禄劝县施宽村
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云南安宁县八街镇
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#*$ !$e%*f3
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#"!e!#f6
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云南武定县高桥镇
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<
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TO0080 #*1 !&e%f3
!
#"!e##f6
!"
云南澄江县小窑村
5.8>
W
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TO0080 #,%& !$e%1f3
!
#"!e&%f6
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云南澄江县廖官营
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TO0080 #,&& !$e$"f3
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#"!e&$f6
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云南姚安县栋川镇
B>0
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TO0080 #11# !&e%"f3
!
#"#e#$f6
!%
云南禄劝县撒营盘
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TO0080 !!,& !&e&*f3
!
#"!e%#f6
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云南宜良县清水沟
K.0
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T.9.80
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TO0080 #&1$ !$e&$f3
!
#"%e",f6
!&
云南嵩明县水海村
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!
4;>0
<
7.0
<
!
TO0080 #1* !&e%,f3
!
#"%e#*f6
!
云南祥云县王家山
S80
<-
.8/;80
!
5.80
O0
!
TO0080 #**, !&e!1f3
!
#""e%%f6
!,
云南祥云县红土坡
N>0
<
IO
>
!
5.80
O0
!
TO0080 !"#$ !&e!1f3
!
#""e%!f6
!1
云南马龙县中小屯
M;>0
<
[.8>IO0
!
H89>0
<
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TO0080 !""$ !&e%#f3
!
#"%e%"f6
!*
云南马龙县通泉镇
X>0
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H89>0
<
!
TO0080 !"$ !&e!&f3
!
#"%e%$f6
b
预变性
%7.0
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变性
#7.0
!
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退火
#7.0
!
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延伸
#+&7.0
!共
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个循环&
,!b
延伸
#"7.0
!
$b
保存
扩增产物在含有
"+&
#
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7Q6c
"
EI;.V.O7UP>)
7.VE
!溴化乙锭#的
#+&D
变性聚丙烯酰胺凝胶

S
恒功率电泳约
,&7.0
!电泳结束后于紫外凝胶成
像系统"
X80>0!&""
#拍照并分析
@+H
!
数据统计及分析
?@@A
通常被认为是显性标记!视每条多态性为
一个等位基因凝胶上相同迁移率位置上有
B3C
条带的记为
#
!没有
B3C
条带或模糊不清的记为
"
!将结果输入
6[=E9
表格!得到
?@@A
表型数据矩
阵采用
GYG2636%!
"
hEP/.>0#+%!
#软件计算
?@@A)G4A
扩增产物的多态位点数(多态位点比率
"
2
#(
@;800>0
多样性信息指数"
$
#(
3E.
)
/
基因
多样性指数"
%
#(观察等位基因数"
!"
#及有效等位
基因数"
!#
#利用
3X@T@)G4
"
hEP/.>0!+#"E
#软
件的
@.7.98P.I
W
程序
)KO89.I8I.ZEV8I8
对原始数据矩
阵进行
3E.
遗传相似性系数"
<
E0EI.=/.7.98P.I
W
!
34
#计算!应用
49O/IEP.0
<

@3C3
程序的非加权
成组配对算术平均法"
FG2HC
#对中型狼尾草材料
进行遗传相似性聚类分析!最后在
2P8
;.=
中的
XPEE
9>I
程序下建立树状图*!#+运用
X]G2C
"
hEP/.>0#+%
#软件*!!+对种质地理距离与遗传聚类
之间的相关性进行
H80I9E
检验
!
!
结果与分析
A3@
!
$%%&
扩增产物及多态性分析
按照最优反应体系及程序最终筛选出的重现性
好(特异性高(多态性明显的
#"

?@@A
引物!用于
!*
份中型狼尾草材料
B3C

G4A
扩增"图
#
#

!
显示!
#"
条引物共扩增出
,!
个位点!其中多态
1&!
西
!

!

!

!

!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$

性位点
!
个!平均多态性比率"
2
#达
1,+$D
&每
条引物扩增位点
$
"
#&
个不等!平均
,+!
个!其中多
态性位点
%
"
#!
个不等!平均
+!
个&多态性比率最
高的达
#""D
!最低的为
,&D
!引物
Fc41**
扩增位
点最多!为
#&
个!
Fc41&&

Fc41*&
位点最少
这说明供试中型狼尾草种质资源间存在较高的遗传
变异!且
?@@A
标记能有效地从分子水平上揭示材
料间的多态性
A+A
!
遗传多样性分析
观察等位基因数"
!"
#(有效等位基因数"
!#
#(
@;800>0
多样性信息指数"
$
#及
3E.
)
/
基因多样性
指数"
%
#都是衡量遗传多样性水平的常用指标将
!*
份中型狼尾草材料的
?@@A
扩增谱带通过
GYG)
2636%!
软件分析!结果"表
%
#表明中型狼尾草的
平均
!"
(
!#
(
$

%
值分别为
#+1##
(
#+,$!1
(
"+&#"

"+%*&*


#
!
引物
Fc41**
扩增的中型狼尾草
?@@A
图谱
#
"
!*
为中型狼尾草材料!编号同表
#
&
H+H8P`EP
$
].
<
+#
!
?@@A87
9.R.=8I.>0PE/O9I>R5./(
0
)**)-,-Z8P+)(+#&-#1),-_.I;
P.7EPFc41**
#
"
!*+C==E//.>0/>R5./(
0
)**)-,-Z8P+)(+#&-#1),-
!
0O7UEP/_EPE/;>_EV.0X8U9E#
&
H+H8`EP
$

A
!
引物序列及位点多态性
X8U9E!
!
@E
a
OE0=E80V87
9.R.EV9>=.
>9
W
7>P
;./7>R#"
P.7EP/
引物
GP.7EP
序列
@E
a
OE0=E
"
&f)%f
#
退火温度
C00E89.0
<
IE7
EP8IOPE
%
b
位点数
3>+>R9>=.
多态位点数
3>+>R
>9
W
7>P
;.=9>=.
多态位点比率
GP>
>PI.>0>R
>9
W
7>P
;.=9>=.
%
D
Fc41!
"
C4
#
1
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&" * , ,,+1
Fc41!*
"
X2
#
1
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Fc41$
"
4C
#
1
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Fc41$,
"
4C
#
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Fc41&&
"
C4
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Fc41&
"
C4
#
1
TC
&# , 1&+,
Fc41
"
4X4
#

&& & $ 1"+"
Fc41,*
"
4XX4C
#
%
&" 1 , 1,+&
Fc41*& C2C2XX22XC24X4XX2CX4 &% $ $ #""
Fc41** 4CX22X22X22X4CXX2XX44C & #& #! 1"+"
平均
CZEP8
<
E ,+! +! 1,+$
总计
X>I89 ,! !
!!
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AJ
"
C
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TJ
"
4
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X
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+

C
!
AI
份中型狼尾草材料遗传多样性指数
X8U9E%
!
2E0EI.=V.ZEP/.I
W
.0VE[E/>R!*5./(
0
)**)-,-Z8P+)(+#&-#1),-8==E//.>0/
项目
?IE7
样本
@87
9E/.:E
观测等位基因数
YU/EPZEV89E9E
0O7UEP
"
!"
#
有效等位基因数
6RRE=I.ZE0O7UEP
>R89E9E/
"
!#
#
@;800>0
多样性信息指数
@;800>0
)
/
.0VE[
"
$
#
3E.
基因多样性指数
3E.
)
/.0VE[
"
%
#
平均
HE80 !* #+1## #+,$!1 "+&#" "+%*&*
标准差
@I+BEZ "+%$1% "+%!,1 "+!%#% "+#&
*&!
!

!!!!!!!!!!!!
张怀山!等$中型狼尾草种质资源遗传多样性的
?@@A
分析

!
!
基于
?@@A
标记的
!*
份中型狼尾草种质资源聚类图
].
<
+!
!
BE0VP>
<
P87>R=9O/IEP8089
W
/./U8/EV>0?@@A>R!*5./(
0
)**)-,-Z8P+)(+#&-#1),-
<
EP7
98/7PE/>OP=E/
A+C
!
遗传相似性系数分析
3E.
遗传相似性系数"
34
#是用来比较群体或个
体间相似程度的度量参数!平均相似系数越高!说明
相似程度越大!遗传背景一致性越强*!%+
!*
份中型
狼尾草材料之间的
3E.
遗传相似性系数变化范围为
"+!%
"
"+*"%
"表
$
#其中!亲缘关系最近的是来
源于云南昆明市官渡区新河村的
##
号材料和安宁
县八街镇的
#1
号材料!
34
值为
"+*"%
&遗传相似性
系数最低的是来源于云南昆明市禄劝县施宽村的
#,
号材料与来源于云南曲靖市马龙县中小屯的
!1
号材料!
34
值为
"+!%
!亲缘关系最远
!*
份中型
狼尾草种质材料中!大多数来自相同或相近地理位
置的材料间
3E.
遗传相似性系数较大!亲缘关系较
近&但由于采样地理分布较广!生境相差较大!有一
小部分材料之间
34
值较小!从而使得供试材料间
整体存在较大的遗传差异
A+D
!
聚类分析
利用
FG2HC
法对
!*
份中型狼尾草材料进行
聚类分析!建立聚类分支树状图"图
!
#供试材料
以遗传相似系数
"+&#
为分类界限!聚为
$
大类$第
%
类有
*
份材料!按地理来源划分为
!
个亚类!来自
云南崇明县的
!&
号(
#&
号(
#$
号(
#%
号材料与来自
武定县的
#*
号材料为第
#
亚类!来自云南马龙县的
!1
号(
!*
号材料与来自宜良县的
!$
号材料及来自
澄江县的
!"
号材料为地
!
亚类&第
&
类有
#$
份材
料!大部分都来自云南昆明市城郊附近!又分为
!

亚类!第
#
亚类包括来自昆明市官渡区的
&
号(
##
号及来自禄劝县的
#,
号共
%
份材料!第
!
亚类有
##
份材料!分别是来自昆明市晋宁县的
*
号材料(
西山区的

号(
#"
号材料(呈贡区的
1
号(
,
号和
#!
号材料以及来自安宁县的
#1
号材料(澄江县的
!#
号材料(宜良县的
#
号材料(姚安县的
!!
号材料和
禄劝县的
!%
号材料&第
$
类只包含
#
份来自甘肃兰
州的
!
号材料&第

类有
&
份材料!也是划分为
!

亚类!来自甘肃兰州的
$
号(
%
号和
#
号材料为第
#
亚类!来自云南祥云县的
!,
号和
!
号材料为第
!
亚类经
H80I9E
检验!中型狼尾草种质的地理距离
和遗传聚类之间并不存在显著的相关性"
&J
"+$%,"
!
J"+!"$
#
%
!

!

鉴定(分析材料的遗传多样性是研究物种起源
进化(发现新的基因资源(改良现有育种材料的基础
性工作分子标记是从
B3C
水平上揭示品种及种
群间差异性和相关性的有效工具之一!运用它可以
确定样本材料之间的遗传多样性和亲缘关系!通过
聚类分析可以划分出杂种优势群!提高杂交优势的
应用效率!对种质资源保护和品种改良具有重要
意义
中型狼尾草作为一种兼具饲草(生态型的优良
草种而受到禾草学家的高度重视张怀山等*##+研
究表明!采自云南祥云的中型狼尾草种子在昆明地
"!
西
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对畜牧业发展和生态建设发挥突出作用的禾草新品
种然而!狼尾草属牧草分子方面的研究起步较晚!
目前主要集中在
ACGB
分子标记解新明等*!$+采

ACGB
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1
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研究发现!品种间已有一定的遗传分化!具有较高的
遗传变异钟小仙等*!&+对
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性系数变幅为
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!这表明中型狼尾草在
长期的适应和进化过程中形成了广泛的遗传变异!
不同种质材料间存在着丰富的多态性中型狼尾草
具有较高的遗传多样性!可能是由其自身的生物学
特性决定的中型狼尾草是多年生草本植物!风媒
传粉!而且它产生的花粉量极大!花粉粒小而干燥(
重量极轻!利于远距离传播!使个体之间基因流动频
繁!为基因重组提供了广阔的空间和机会此外!一
般来说植物的多样性中心可能是该物种的起源中
心*!1+!因此!中国西南地区"云南#可能是中型狼尾
草的部分起源中心或是第四纪冰期避难所中型狼
尾草在云南省从南至北都有分布!而云南地形地貌
复杂!南北之间在气温(土壤(水肥(植被等生态因子
上差异较大!也可能导致不同地区种质由于适应环
境的需要产生不同的表型和基因型!从而扩大了中
型狼尾草的遗传多样性水平本研究结果表明采用
?@@A
分子标记进行中型狼尾草种质资源遗传多样
性的分析是可行的!并且具有较高的多态性检测水
平!这些多态性对了解中型狼尾草的遗传背景(为中
型狼尾草牧草资源的开发利用(新品种培育和生产
提供了理论依据
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聚类分析显示!以遗传相似系数"
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同或相近地理生态型的多数资源可以聚于同一类或
亚类!呈现出一定的地域性分布规律!这可能是长期
自然选择使个体中发生的不定向变异演变为群体遗
传结构的定向变异从而导致同一地区的大部分中型
狼尾草种质基因型趋于相似的结果但是!来自兰
州大洼山的栽培种质与来自云南祥云县的野生种质
归为一类!而同样栽培于大洼山的
!
号材料却独聚
一类!形成,大杂居(小聚居-的现象!表现出较大的
地域分布差异性!即各种质材料间遗传分化程度较
大!并且没有依据地理位置的渐变而呈现出遗传距
离上的渐变规律!与前人相关野生资源的分析结论
不尽一致*!*+
!
号材料单独聚为一类!说明其遗传
上具有一定的特殊性!可能是由于材料在引种驯化
过程中有个别基因发生了适应当地环境的基因突
变!引种地兰州地处黄土高原西端!气候干燥!蒸发
量远大于降水量!风沙活动频繁!土壤碱化贫瘠!水
土流失严重!相对于原产地雨量充沛(土壤肥沃的优
越生境!这种不利的环境使得种质发生了较大变异!
产生了比较独特的基因型
4>::>9.0>
等*%"+研究表
明!高山或河道的物理隔离对生物居群间的遗传分
化有一定的影响然而!本研究中!基于种质地理距
离和遗传聚类的
H80IE9
检测表明!中型狼尾草种质
的遗传分化与
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+提出的地理距离分化模式
不太相符!即地理分布与遗传多样性分布没有直接
的相关性!这与
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同样地!实验中遗传相似系数最大(亲缘关系最近的
来源于云南昆明市官渡区的
##
号材料和安宁县的
#1
号材料虽然聚为一类!但却分属于两个不同的亚
类!而地理距离最近(均来自于宜良县的
#
号和
!$
号材料更是聚于两个不同的大类!进一步表明中型
狼尾草的遗传聚类与地理来源无严格的一致性关
系由此可以看出!中型狼尾草种质的遗传分化受
距离的影响不大!云南地区野生中型狼尾草资源遗
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西
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传变异的形成并非主要是由地理距离产生的遗传漂
变所致!可能跟其生殖方式和基因的突变等有关
中型狼尾草属于异花传粉植物!花粉串粉导致天然
杂交!使得相同生态型的种质产生特异的基因型&另
一方面!环境饰变作用引起地区间偶然的基因交流
导致某些基因在不同地区的入渗!造成不同地理环
境中种质材料性状的交叉!使得野生中型狼尾草的
遗传距离与地理来源的关系复杂化
@80I;>/;
等*%%+在腰果"
A("9"&1),-/99)1#(+".#
#种质资源遗
传多样性的研究中认为不同地区之间的相互引种可
能导致种质的聚类结果与种质地理来源没有直接联
系同样!易杨杰等*%$+在狗牙根"
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#种质遗传多样性的
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研究中发现一些地
理来源及遗传背景不一的品种聚在一起!这可能与
江河冲刷(人类活动等将其转入异地进行无性扩繁
有关
物种的遗传多样性是大自然最珍贵的自然资
源!是人类赖以生存的基础遗传多样性可以用来
描述种群遗传变异和维持变异的机制!其丰富程度
决定了物种对环境的适应能力与进化潜力通过遗
传聚类了解中型狼尾草遗传变异在地理上的分布格
局对于制定科学的保护策略并促进其开发利用具有
极为重要的作用云南野生中型狼尾草存在较为丰
富的遗传变异与分化虽然多数资源在聚类上呈现
一定程度的地域分布规律!但是中型狼尾草的遗传
关系和地理距离之间并不存在显著的正相关关系
因此!在实际开发应用研究过程中!应该重点对中型
狼尾草种质资源实施异地保护!并在迁地栽培后加
快对中型狼尾草的繁育技术(引种驯化研究!保持并
扩大中型狼尾草资源的多态性丰富程度此外!对
中型狼尾草野生资源的原生境保护工作也不能松
懈!在广泛深入评价的基础上进一步建立中型狼尾
草地方种质资源库!与此同时需要加强当地农户的
科普教育!防止人类活动造成的基因混杂!以保护其
独特的基因资源!为中型狼尾草的生物分子进化(地
理分异和物种形成等研究奠定必要的材料基础
参考文献!
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