全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(5): 486鄄494(2011)
收稿日期: 2010鄄12鄄10; 修回日期: 2011鄄07鄄23
基金项目: 国家“十一五冶支撑计划(2006BAD08A05); 农业部公益性行业科研专项(3鄄15)
通讯作者: 喻大昭,研究员,主要从事小麦病害和植物源杀菌剂研究; E鄄mail: Dazhaoyu@china. com
第一作者: 史文琦 ( 1983 - ),女,江苏盐城人,研究实习员,硕士,主要从事小麦真菌病害检测及其分子生物学研究; Tel:
13437131566&027鄄87380681, E鄄mail: iamjingjing. hi@163. com。
小麦赤霉病流行区镰刀菌致病种及毒素化学型分析
史文琦1, 杨立军1, 冯 洁2, 张 旭3, 曾凡松1, 向礼波1, 汪 华1, 喻大昭1*
( 1湖北省农业科学院植保土肥研究所 农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室, 武汉 430064;
2中国农业科学院植物保护研究所、植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193;
3江苏省农业科学院生物技术研究所, 南京 210014)
摘要: 为从分子水平上明确小麦赤霉病流行区镰刀菌致病种及其 B型毒素化学型的分布特点,本研究对 2008 年度采自四
川、重庆、湖北、安徽、江苏、河南 6 省 33 县市的赤霉病穗上分离获得的 433 个镰刀菌单孢菌株,用鉴定种和鉴定 B 型毒素
化学型的特异性引物进行了鉴定分析。 致病种检测结果表明,四川病穗检测到 Fusarium asiaticum、F. graminearum、F郾
avenaceum和 F. meridionale 4 个镰刀菌种,重庆、湖北、安徽和江苏病穗检测到 F. asiaticum 和 F. graminearum 2 个种,河
南病穗仅检测到 F. graminearum 1 个种。 毒素化学型检测结果表明,Nivalenol(NIV)是四川和重庆镰刀菌主要毒素化学
型,Deoxynivalenol(DON)是湖北、河南、安徽和江苏镰刀菌主要毒素化学型;将 DON化学型进一步划分为 3鄄AcDON和 15鄄
AcDON显示,四川、湖北、江苏镰刀菌毒素以 3鄄AcDON为主,安徽镰刀菌毒素为 3鄄AcDON和 15鄄AcDON两者参半,河南镰
刀菌全部产生 15鄄AcDON。 结果揭示,F. asiaticum是四川、重庆、湖北和江苏等赤霉病流行麦区的优势致病种;镰刀菌产生
的 DON和 NIV毒素化学型存在明显的地域分布,长江上游的麦区以 NIV为优势化学型,长江中下游麦区以 DON 为优势
化学型;镰刀菌致病种与 DON毒素的化学型间存在一定关系。
关键词: 小麦; 赤霉病; 镰刀菌种群结构; 毒素化学型
Analysis on the population structure of Fusarium pathogenic spp. and its mycoto鄄
xin chemotypes in Fusarium head blight epidemic region摇 SHI Wen鄄qi1, YANG Li鄄jun1,
FENG Jie2, ZHANG Xu3, ZENG Fan鄄song, XIANG Li鄄bo, WANG Hua, YU Da鄄zhao摇 ( 1 Institute for Plant
Protection and Soil Sciences, Hubei Academy of Agricultural Sciences; Hubei Key Laboratory of Crop Diseases,Insect Pests and
Weeds Control, Wuhan 430064, China; 2 Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Scieces; State Key La鄄
boratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests, Beijing 100193, China; 3 Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of
Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)
Abstract: A broad survey was conducted and infected heads of wheat were collected from 33 counties in Si鄄
chuan, Chongqin, Hubei, Anhui, Jiangsu and Henan Provinces in 2008. Totally 433 Fusarium single spore
isolates were obtained and the population and mycotoxin chemotypes had been studied through PCR assay.
Four Fusarium species, F. asiaticum, F. graminearum, F. avenaceum and F. meridionale,were detected in
Sichuan , while two species F. asiaticum and F. graminearum were detected in Chongqing, Hubei, Anhui
and Jiangsu. In Henan Province, only F. graminearum was found. Chemotype detection results showed that
Nivalenol was the main chemotype in Sichuan and Chongqing, while Deoxynivalenol was the major chemotype
in Hubei, Henan, Anhui and Jiangsu. After further divided the DON chemotype strains into 3鄄AcDON and 15鄄
AcDON, the results showed that 3鄄AcDON isolates mainly lied in Sichuan, Hubei and Jiangsu, both 3鄄Ac鄄
DON and 15鄄AcDON isolates mixed in Anhui, and all the isolates in Henan belonged to 15鄄AcDON. The
摇
摇 5 期 摇 史文琦,等:小麦赤霉病流行区镰刀菌致病种及毒素化学型分析
results indicated that F. asiaticum was the dominant specie in Sichan, Chongqing, Hubei and Jiangsu Prov鄄
ince. It also showed that there was a clear geographical distribution of DON and NIV produced by Fusarium
species. NIV was the dominant chemotype in wheat producing region belonged to the upper reaches of Yangtze
River while DON was the dominant chemotype in the lower reaches. There were some relationship between
DON chemotype and Fusarium species.
Key words: wheat; Fusarium head blight; population structure; mycotoxin chemotype
中图分类号: S432. 44摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)05鄄0486鄄09
摇 摇 赤霉病是我国长江流域冬麦区以及东北春麦
区常发性病害[1]。 近年来,该病害在河南、河北、
山东、陕西、甘肃和宁夏等省也时有流行,流行范围
明显向北转移[2]。 多种镰刀菌可引起小麦赤霉
病。 Parry等 [3]报道有 17 种镰刀菌可引起赤霉
病,其中最主要有 5 个种。 20 世纪 80 年代,我国
小麦赤霉病攻关协作组对采自全国 21 个省市的
2 450份致病镰刀菌样本进行了形态学鉴定,共鉴
定出 27个种(包括变种),其中禾谷镰刀菌 Fusa鄄
rium graminearum Schw 为致病优势种(94郾 5% ) [4]。
然而,最近研究表明原来定义的禾谷镰刀菌
(F郾 graminearum sensu stricto)是一个进化宗系群
( lineage clade),该进化宗系群内具有明显的遗传
多样性[5 ~ 8]并存在着清晰的生物学“种冶 的分化且
不同种具有明显的地理分布。 O忆Donnell 等[9]将
禾谷镰刀菌宗系群(Fg clade)正式定义为 9 个种,
Starkey 等[10]又进一步将其定义为 11 个种。 过去
研究中提到的禾谷镰刀菌(F. graminearum)现仅
为宗系群中的一个种,因其广泛性分布仍保留原种
名。 最近一些研究表明主要存在于亚洲 Fg 族中
的 F. asiaticum是引起中国大、小麦赤霉病的优势
种群[9,11 ~ 13]。
镰刀菌不仅造成产量严重损失,更重要的是可
以产生十分庞杂的真菌毒素引起食品安全问题,因
而受到全世界人们的广泛关注[14]。 主要的毒素分
子骨架有单端孢霉毒素、玉米赤霉烯酮毒素、链珠
菌毒素、恩镰孢菌毒素、白僵菌毒素和伏马毒素等
多种类型[15],其中单端孢霉毒素是最常见和最重
要的一类毒素,且与致病性相关。 F. graminearum
clade菌株主要产生 B 型 8鄄羰基单端孢霉类毒素,
包括镰刀菌烯醇(NIV)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇
(DON)以及它们的乙酰类化合物。 随着与赤霉病
菌毒素代谢途径相关的基因及其功能的明确,基于
某些基因而设计出的引物被广泛用来鉴定镰刀菌
的毒素化学类型[15,16]。
尽管 20 世纪 80 年代,赤霉攻关协作组对全国
小麦赤霉病致病种进行了鉴定,然而其分类依据主
要是形态学,传统的研究工作量大、专业技术性强
且较为繁琐。 近年来,从分子水平对我国流行区致
病种和毒素化学型的研究也鲜有报道[12,13,16 ~ 19],
但样本量少且来源于不同年度。 为明确不同麦区
镰刀菌种群体结构和毒素化学型的分布特点,本研
究对我国南方小麦赤霉病主要流行区 2008 年度分
离的 433 份镰刀菌进行了致病种及其 B 型毒素化
学型进行检测。
1摇 材料与方法
1. 1摇 病样采集
小麦收割前 1 ~ 2 周,在四川的郫县、德阳、都
江堰、广汉、罗江、绵阳、绵竹、三台、射洪和遂宁;重
庆的潼南;湖北的安陆、谷城、荆门、荆州、襄樊、沙
洋、随州、武昌、孝感、宜城、枣阳和钟祥;安徽的合
肥、蚌埠、淮北和宿州;江苏的宿迁、徐州、淮安、泰
州和盐城;河南的温县等 33 个小麦赤霉病流行县
市采集赤霉病穗,每田块五点取样,每点采集典型
赤霉症状病穗 2 ~ 3 个,分装于不同信封。
1. 2摇 单孢分离
取病位小块颖壳,用 70%无水乙醇表面消毒
30 s,4% NaClO 表面消毒 90 s,无菌水漂洗 2 次,
灭菌滤纸吸干水分后置于 PDA 平板上,26益培养
72 h后挑取少许新鲜菌丝至 30 mL 5%绿豆汁培
养基的锥形瓶中,26益下 110 r / min 振荡培养 3 ~
4 d,将孢子浓度稀释到 1 伊 103个 / mL,在 1%水琼
脂平板背面画好小圈,每圈点接 1 滋L,在光学显微
镜下镜检,将仅有 1 个分生孢子的水琼胶转移至
PDA平板上, 26益下培养 48 h后挑取少量新鲜菌
丝转入斜面培养,置于 4益保存,即获得镰刀菌单
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摇
植物病理学报 41 卷
孢菌株。 共分离获得 433 个单孢菌株,各地分离的
单孢菌株情况见表 1。
1. 3摇 菌丝培养和 DNA提取
从各个菌株分别挑出少许菌丝转移到 PDB平
皿(6 cm直径)上,26益下静置培养 48 h,收集菌丝
并用滤纸吸干,取约 20 ~ 50 mg 菌丝体置于 2 mL
离心管中,液氮冷冻研磨成粉末;加入 600 滋L抽提
液(50 mmol / L Tris鄄HCl、150 mmol / L NaCl、100
mmol / L EDTA),振荡均匀;再加入 60 滋L 10%
SDS混匀后 37益水浴 1 h,其间间歇颠倒混匀数
次;加入 90 滋L 5 mol / L NaCl 和 80 滋L CTAB /
NaCl(10%CTAB、0. 7 mol / L NaCl),65益保温 30
min,每隔几分种混匀 1 次,冷却至室温;加入等体
积的酚 /氯仿 /异戊醇(25 颐 24 颐 1)混合液抽提 1
次,10 000 rpm离心 10 min,上清液再用氯仿 /异戊
醇(24 颐 1)混合液抽提 1 次;取上清液,加入 0. 6
倍体积预冷异丙醇, - 20益放置过夜;10 000 rpm
离心 10 min;弃上清液,沉淀物用 70%乙醇清洗 2
次,风干;加适量 TE 溶解, - 20益保存。 用 1%琼
脂糖凝胶电泳检测,用定量 DNA marker 对其定
量,最后稀释到约 2 ng / 滋L,置于 -20益保存备用。
1. 4摇 镰刀菌种的鉴定
采用 Yang等[11]报道的方法,首先检测出 F郾
asiaticum和 F. meridional,即先对 433 个单孢镰刀
菌和 3 个 NRRL菌株(F. asiaticum NRRL6101、F郾
meridionale NRRL28436、 F. graminearum NRRL28336)
用 FgCTPSf024、 FgCTPSr536、 Fg6CTPSf177 和
FgCTPSr306 共 4 条引物进行竞争 PCR 扩增。 扩
增体系为 25 滋L内含 10 ng DNA模板,200 滋mol /
L dNTPs,2. 5滋L PCR 缓冲液(10 伊 PCR buffer),
1U Taq 酶,0. 4 滋mol / L Fg6CTPSf177,0. 4 滋mol / L
FgCTPSr306, 0. 2 滋mol / L FgCTPSf024 和 0. 2
滋mol / L FgCTPSr536。 PCR 扩增反应程序为:94益
2 min;94益 1 min,55益 30 s,72益 50 s,35 个循环;
72益 10 min。
对不属于 F. asiaticum 和 F. meridionale 的
Fg clade其他菌株,用基于翻译延长 1琢( translation
elongation 1琢 factor, TEF鄄1琢 ) 基 因 设 计 针 对
F郾 graminearum 和 F. acaciae鄄meansii 的 引 物
FgTEFf124、Fg7TEFf364、Fg5TEFr411 和 FgTEFr590
进行竞争 PCR扩增,PCR 反应体系中引物浓度分
别为 0. 1 滋mol / L Fg7TEFf364、 0. 1 滋mol / L
Fg5TEFr411、0. 2 滋mol / L FgTEFf124 和 0. 2 滋mol /
L FgTEFr590,其余组分以及 PCR扩增程序均与上
述的竞争 PCR相同。
对非 Fg clade 菌株,用 F. avenaceum 种的特
异性引物 PCR 扩增,反应体系中引物终浓度均为
0. 4 滋mol / L,其他组分均与上述反应体系相同。
PCR扩增程序为:94益 2 min; 94益 1 min,60益
30 s,72益 1 min,35 个循环;72益 10 min。
以上 PCR 产物均用 1% 琼脂糖凝胶电泳检
测。 PCR引物序列及其扩增的特征带详见表 2。
1. 5摇 镰刀菌毒素化学型的测定
采用 Li等[16]的方法进行 DON和 NIV化学型
检测,PCR反应体系中除引物终浓度为 0. 2 滋M
ToxP1 和 0. 2 滋M ToxP1 外,其余反应组分同 1. 4。
PCR扩增程序为:94益 2 min; 94益 1 min,55益
1 min,72益 50 s,35 个循环;72益 10 min。 对属于
DON毒素化学型的菌株,采用 Jennings 等[17]的方
法进行 3鄄AcDON 和 15鄄AcDON 鉴定。 PCR 反应
体系中引物浓度均为 0. 2 滋mol / L Tri303F / R 和
0郾 2 滋mol / L Tri315F / R,其他反应组分同上。 扩增
程序为 94益 2 min;94益 30 s,60益 1 min,72益 2
min,30 个循环;72益 10 min。 PCR 产物均用 1%
琼脂糖胶进行检测。 引物序列及其扩增的特征带
见表 2。
为验证 ToxP1 / ToxP2 区分 Fg clade族的 DON
和 NIV 化 学 型 准 确 性, 以 及 Tri303F / R 和
Tri315F / R 进一步将 DON 分为 3鄄AcDON 和 15鄄
AcDON的可靠性,用这些引物对已知化学型的 32
个 NRRL 菌株进行了检测(图 1 和图 2),结果与报
道结果一致[8]。
2摇 结果与分析
第一组竞争 PCR反应中,F. asiaticum 菌株扩
增出 536、388、311 和 162 bp 4 条带,其中引物
Fg6CTPSf177 和 FgCTPSr306 仅在 F. asiaticum 菌
株间扩增出 162 bp 带,即该种的特征带;引物
FgCTPSf024 和 FgCTPSr306 在 Fg clade 中 除
F郾 meridionale之外的所有其他种扩增出 311 bp 和
536 bp 特征带(536 bp 并不总能扩出),F. meri鄄
dionale仅由 FgCTPSf0 2 4和 FgCTPSr5 3 6扩增出
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摇 5 期 摇 史文琦,等:小麦赤霉病流行区镰刀菌致病种及毒素化学型分析
Table 1摇 The distribution and detection of Fusarium species in different sampling sites
Provience /
municipality
Site
no.
County
Fusarium
asiaticum
F. graminearum F. avenaceum F. meridionale Total
Sichuan 1 Guanghan 11 1 12
2 Dujiangyan 7 2 1 10
3 Suining 9 1 10
4 Shehong 10 2 12
5 Pixian 5 1 6
6 Luojiang 9 9
7 Mianyang 1 7 1 9
8 Mianzhu 4 1 2 7
9 Deyang 9 9
10 Santai 5 1 6
Chongqin 11 Tongnan 4 2 6
Hubei 12 Anlu 11 6 17
13 Gucheng 14 14
14 Jingmen 12 2 14
15 Jingzhou 18 3 21
16 Xiangfan 10 8 18
17 Shayang 6 6
18 Suizhou 15 3 18
19 Wuchang 13 2 15
20 Xiaogan 8 5 13
21 Yicheng 21 6 27
22 Zaoyang 15 7 22
23 Zhongxiang 13 3 16
Henan 24 Wenxian 25 25
Anhui 25 Hefei 9 1 10
26 Bengbu 3 7 10
27 Huaibei 2 4 6
28 Suzhou 4 12 16
Jiangsu 29 Suqian 13 2 15
30 Xuzhou 4 9 13
31 Huai爷an 11 1 12
32 Taizhou 12 1 13
33 Yancheng 11 5 16
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Table 2摇 Primers sequences and the sizes of the PCR fragments
Species / chemotype Primer Sequence(5忆鄄3忆) Size / bp Reference
Fg clade FgCTPSf024 TCGGAAGAGTTTTCTGCC a [11]
Fg clade FgCTPSr536 GGAGCTGGCGGCG
Fusarium asiaticum Fg6CTPSf177 GTCTCACTTCAAGCCA
Fg clade(except F. meridionale) FgCTPSrR306 CCTTGGTCATCCATAGAG
Fg clade FgTEFf124 CGGTCACTTGATCTACCAG 482 [11]
Fg clade FgTEFr590 GAATGTGATGACAGCAGTG
F. graminearum Fg7TEFf364 CTCGAGCGACAGGCGTC 261b
F. acaciae鄄mearnsii Fg5TEFr411 GACAGGTGGTTAGTGACTA 306b
Chemotypes ToxP1 GCCGTGGGGRTAAAAGTCAAA 300 or 360c [16]
ToxP2 TGACAAGTCCGGTCGCACTAGCA
Tri303F GATGGCCGCAAGTGGA 583 [17]
Tri303R GCCGGACTGCCCTATTG
Tri315F CTCGCTGAAGTTGGACGTAA 863 [17]
Tri315R GTCTATGCTCTCAACGGACAAC
F. avenaceum FaF CAAGCATTGTCGCCACTCTC 920 [19]
FaR GTTTGGCTCTACCGGGACTG
aSize of PCR product with each pair of species primers: ( 1 ) F. asiaticum: with primers Fg6CTPSf177 and
FgCTPSrR306 produce the fragment of 162 bp; ( 2 ) Member of Fg clade except F. meridionale: with primers
FgCTPSf024 and FgCTPSrR306 produce the fragment of 311 bp; (3) All Fg clade: with primers FgCTPSf024 and
FgCTPSr536 produce the fragment of 536 bp, which may be absent because of the competition of 311 bp and 162 bp frag鄄
ments.
b F. acaciae鄄mearnsii: with primers FgTEFf124 and Fg5TEFr411 produce the fragment of 261 bp; F. graminearum: with
primers Fg7TEFf364 and FgTEFr590 produce the fragment of 306 bp.
c DON 300 bp, NIV 360 bp.
Fig. 1摇 PCR products for DON and NIV detection of 32 NRRL strains
M: 100 bp DNA ladder; lanes 1 to 3: Fusarium austroamericanum NRRL2903, NRRL28585, and NRRL28718; lanes 4 to 6:
F. meridionale NRRL28436, NRRL28723, NRRL29010; lanes 7 and 8: F. boothii NRRL29020 and NRRL 29105; lanes 9 and
10: F. mesoamericanum NRRL25797 and NRRL29148; lanes 11 to 13: F. acaciae鄄mearnsii NRRL26752, NRRL26754, NR鄄
RL26755; lanes 14 to 18: F. asiaticum NRRL6101, NRRL13818, NRRL26156, NRRL28720, NRRL 28721; lanes 19 to 25: F.
graminearum NRRL5883, NRRL6394, NRRL13383, NRRL28063, NRRL28336, NRRL28439, NRRL29169; lanes 26 and 27:
F. culmorum NRRL3288 and NRRL25475; lanes 28 and 29: F. cerealis NRRL13721 and NRRL25491; lanes 30 to 32: F. pesu鄄
dograminearum NRRL28062, NRRL28065, NRRL28338. 300 bp represent DON and 360 bp represent NIV.
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Fig. 2摇 PCR products for 3鄄AcDON and 15鄄AcDON detection of 15 NRRL strains
M: 100 bp DNA ladder; lanes 1 and 2: Fusarium austroamericanum NRRL2903 and NRRL28718; lanes 3 and 4: F. boothii NR鄄
RL29020 and NRRL 29105; lane 5: F. mesoamericanum NRRL29148; lanes 6 to 8: F. asiaticum NRRL6101, NRRL26156, and
NRRL28720; lanes 9 to 13: F. graminearum NRRL5883, NRRL6394, NRRL28063, NRRL28336, and NRRL29169; lanes 14
and 15: F. culmorum NRRL3288 and NRRL25475. 583 bp represent 3鄄AcDON and 863 bp represent 15鄄AcDON.
536 bp带。 第二组竞争 PCR反应中,Fg clade菌株
会扩增出 482 bp条带,F. graminearum和 F. aca鄄
ciae鄄meansii还分别会扩增出 261 和 306 bp 条带。
在不属于 Fg 族的菌株中检测出 F. avenaceum,其
特征带为 920 bp。
毒素化学型检测中由 ToxP1 / ToxP2 区分
DON和 NIV 毒素:300 bp 为产生 DON 毒素,360
bp 为产生 NIV 毒素。 DON 毒素菌株中,能由
Tri303R / F这对引物扩增出 583 bp 片段产生的为
3鄄AcDON的菌株,能由 Tri315F / R 这对引物扩增
出 863 bp片段产生的为 15鄄AcDON。
2. 1摇 赤霉病流行区镰刀菌致病种结构分析
433 个单孢菌株中共检测到 F. asiaticum、F.
graminearum、F. avenaceum 和 F. meridionale(图
3 显示 F. avenaceum 部分检测结果) 4 个镰刀菌
种。 除河南温县采样点,其余 32 个采样县市均检
测到 F. asiaticum,占所有分离菌株的 69. 1% (图 4
显示部分检测结果);其次有 26 个采样县市检测
到 F. graminearum,占所有分离标样的 29. 1% (图
5 显示部分检测结果)。
Fig. 3摇 PCR products using primers FaF / R for
Fusarium avenaceum detection
M: 100bp DNA ladder; lanes 1 to 5: isolates all from
Sichuan. Fragments of 920 bp was foundin F. avenaceum.
Fig. 4 摇 Products of a competition PCR for
Fusarium asiaticum and F. meridio鄄
nale detection
M: 100 bp DNA ladder; lane 1: F. asiaticum NRRL6101;
lane 2: F. meridionale NRRL28436; lane 3: F. graminearum
NRRL 28336,lanes 4 to 9: Fusarium species detected in this
experiment ( lanes4,5,6,7,10and 11 showed F. asiaticum,
lanes 12 showed F. meridionale, lanes 8 and 9 showed other
species in Fg clade except F. meridionale) .
Fig. 5摇 Products of a competition PCR for Fu鄄
sarium graminearum and F. acaciae鄄
mearnsii detection
M: 100 bp DNA ladder; lane1 F. acaciae鄄mearnsii NR鄄
RL28436; lane 2: F. graminearum NRRL28336; lanes 3 to
12: Fusarium species detected in this experiment ( they all
belonged to F. graminearum) .
摇 摇 各采样省市的镰刀菌致病种存在差异,四川镰
刀菌种群相对复杂,4 个镰刀菌种均检测到,重庆、
湖北、安徽和江苏仅检测到 F. asiaticum和 F. gra鄄
minearum 2 个种,河南仅检测到 F. graminearum 1
个种。 对不同采样点致病种的统计详见表 1 和
表 3。
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Table 3摇 The distribution and detection of Fusarium species in
each provience and municipality
Provience /
municipality
Fusarium
asiaticum / %
F. graminearum / % F. avenaceum / % F. meridionale / % Totala
Sichuan 70 / 77. 8 12 / 13. 3 7 / 7. 8 1 / 1. 1 90
Chongqing 4 / 66. 7 2 / 33. 3 6
Hubei 156 / 77. 6 45 / 22. 4 201
Henan 25 / 100. 0 25
Anhui 18 / 42. 9 24 / 57. 1 42
Jiangsu 51 / 73. 9 18 / 26. 1 69
Totalb 299 / 69. 1 126 / 29. 1 7 / 1. 6 1 / 0. 2 433
a total isolates collected in each sampling province and municipality;
b total isolates of each Fusarium spp. and their ratio occupied in 433 isolates.
2. 2摇 小麦赤霉病原菌毒素化学型分析
所有分离物毒素化学型检测结果列于表 4。
表中所示,DON和 NIV 毒素化学型之间存在明显
的地域分布。 NIV 毒素化学型是四川和重庆小麦
赤霉病菌的优势毒素类型,而 DON 化学型在湖
北、安徽、江苏和河南赤霉病菌中占优势。 在产生
DON毒素化学型的菌株中,河南和重庆的 DON毒
素类型全部是 15鄄AcDON,而四川、湖北、江苏 3 省
则以 3鄄AcDON为主。
菌株产生乙酰 DON 毒素的类型与该菌株所
属种存在一定关系。 F. graminearum 主要产生
15鄄AcDON(3鄄AcDON / 15鄄AcDON = 29 / 88),而
F. asiaticum 主要产生 3鄄AcDON(3鄄AcDON / 15鄄
AcDON = 200 / 21)。 另外,仅在湖北发现 F. asi鄄
aticum菌株产生 15鄄AcDON(表 4)。
3摇 讨论
对原来单一形态的 F. graminearum Schw 的
系统发育研究表明,F. graminearum clade 族内可
划分为 11 个特定的种[10],其中 Fg clade 中 lineage
6 主要存在于亚洲,由 ODonnel 正式将其定名为
F. asiaticum[9]。 Fg clade 族的各个种在特定的核
苷酸序列上存在单核苷酸多态性[9],可用于设计
特异性引物区分这些种。 Yang等利用单核苷酸多
态性(SNPs)结合竞争 PCR 原理,基于 ammonia
ligase 2 基因设计了用于检测 Fg clade中引起中国
大麦赤霉最重要的种 F. asiaticum 和 F. meridion鄄
ale,基于 TEF鄄1琢 基因设计了用于检测 F. gra鄄
minearum和 F. acaciae鄄meansii 的引物[11]。 用该
竞争 PCR 法,通过 Fg clade 族通用引物与种特异
性引物组合之间竞争,所有的 Fg clade 种除形成
Fg clade族通用特征带外,完全匹配的特异性引物
还会形成该镰刀菌种特有的特征带,可区分存在一
个核苷酸差异的种,而不需测序鉴定,大大降低了
成本。
Gale等[12]对浙江 4 个不同地域田块的 225 份
赤霉病穗样本,用限制性片段长度多态性( restric鄄
tion fragment length polymorphism,RFLP)方法分
析,结果显示所有菌株均为 F. asiaticum。 Zhang
等[13]通过基于特征片段扩增区域( sequence char鄄
acterized amplify region,SCAR)的 PCR 和测序分
析,证实了 F. asiaticum是中国小麦赤霉的优势致
病菌。 本研究用竞争 PCR 方法分析,证实 F. asi鄄
aticum是四川、重庆、湖北和江苏等省市小麦赤霉
病的优势致病种,与 Zhang等[13]的研究结果一致。
F. avenaceum 主要分布于凉爽或海洋性气候地
区[3],本研究从四川的小麦赤霉单孢分离物中检
测到 7 个 F. avenaceum 和 1 个 F. meridionale 菌
株,这可能与四川特殊的地理气候环境有关。 该结
果与 Huang等[18]报道的四川省小麦赤霉病菌的种
群组成较为多样吻合。
294
摇
摇 5 期 摇 史文琦,等:小麦赤霉病流行区镰刀菌致病种及毒素化学型分析
Table 4摇 Distribution of DON and NIV chemotypes among Fusarium
species detected in each province and municipality
Provience /
municipality
Fusarium asiaticum F. graminearum F. meridionale
A B C D A B C D A B C D
Sichuan 47 23 23 3 9 3 6 1 1
Chongqing 4 2 2
Hubei 9 139 118 21 1 41 16 25
He爷nan 25 25
Anhui 3 15 15 2 22 3 19
Jiangsu 7 44 44 18 7 11
Total 70 221 200 21 6 117 29 88 1 1
A:NIV; B:DON; C:3鄄AcDON; D:15鄄AcDON.
Li等[16]发现 DON是中国小麦赤霉病菌产生的主
要毒素化学类型,Zhang 等[13]研究表明 DON 毒素
中 3鄄AcDON 是中国小麦赤霉病菌产生的主要化
学型,且 3鄄AcDON主要存在于平均温度超过 15益
的长江中下游地区,而 15鄄AcDON 主要存在于北
方冷凉地区。 本研究中河南检测到的毒素类型全
部为 15鄄AcDON这一结果支持了上述观点。 有趣
的是,本研究中还发现长江上游的四川和重庆的优
势赤霉致病种 F. asiaticum 产生的毒素化学型以
NIV为主,而其他麦区的赤霉种群 F. asiaticum 以
产生 3鄄AcDON 为主;所有麦区赤霉种群 F. gra鄄
minearum都以产生 15鄄AcDON 为主。 该结果与本
课题组对长江流域 9 省市的大麦赤霉病的研究中
得出的在四川和重庆 NIV 化学型占优势,而在长
江中下游 DON 占优势的结论极为相似。 四川和
重庆发现的赤霉种群 F. asiaticum 产生的毒素类
型明显异于其它麦区赤霉种群 F. asiaticum 的毒
素类型,以及四川赤霉种群结构存在明显的多样
性,值得进一步探索和研究。
参考文献
[1] 摇 Lu W Z, Cheng S H, Wang Y Z. Progress on Fusari鄄
um head blight of wheat [M] . Beijing: Science Press
(北京: 科学出版社), 2001.
[2] 摇 Chen L F, Bai G H, Desjardins A E. Recent advances
in wheat head scab research in China. National Agri鄄
cultural Library, 2000. ( http: / / www. nal. usda. gov /
pgdic / WHS / whsindex. htmL) .
[3] 摇 Parry D W J, Jenkinson P, Mcleod L. Fusarium ear
blight ( scab) in small grain cereals鄄a review [ J] .
Plant Pathol. , 1995, 44: 207 -238.
[4] 摇 Collaborative Group of Chinese Wheat Scab
(CWSCG) . Fusarium species distribution and patho鄄
genicity from scabby heads in China [ J] . Journal of
Shanghai Normal College (上海师范学院学报),
1984,3: 69 -82.
[5] 摇 Carter J P, Rezanoor H N, Desjardins A E, et al.
Variation in Fusarium graminearum isolates from Ne鄄
pal associated with their host of origin [ J ] . Plant
Pathol. , 2000, 49:452 -460.
[6] 摇 Carter J P, Rezanoor H N, Holden D et al, Variation
in pathogenicity associated with the genetic diversity of
Fusarium graminearum [ J ] . Eur. J. Plant Pathol. ,
2002, 108:573 -83.
[7] 摇 O爷Donnell K, Kistler H C, Tacke B K, et al. Gene
genealogies reveal global phylogeographic structure and
reproductive isolation among lineages of Fusarium gra鄄
minearum, the fungus causing wheat scab [ J] . Pro鄄
ceedings of the National Academy of Sciences USA,
2000, 97:7905 -7910.
[8] 摇 Ward T J , Bielawski J P , Kistler H C, et al. Ances鄄
tral polymorphism and adaptive evolution in the tricho鄄
thecene mycotoxin gene cluster of phytopathogenic Fu鄄
sarium[ J] . Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 2002, 99:9278 -9283.
[9] 摇 O爷Donnell K, Ward T J, Geiser D M, et al. Genea鄄
logical concordance between the mating type locus and
seven other nuclear genes supports formal recognition
of nine phylogenetically distinct species within the Fu鄄
sarium graminearum clade [ J] . Fungal Genetics and
394
摇
植物病理学报 41 卷
Biology, 2004, 41:600 -623.
[10] Starkey D E, Ward T J, Aoki T, et al. Global molec鄄
ular surveillance reveals novel Fusarium head blight
species and trichothecene toxin diversity [ J] . Fung.
Genet. Biol. , 2007, 44: 1191 -1204.
[11] Yang L, Van der Lee T ,Yang X, et al. Fusarium
populations on Chinese barley show a dramatic gradient
in mycotoxin profiles [ J] . Phytopathol. , 2008, 98
(6): 719 -727.
[12] Gale L R, Chen L F, Hernick C A, et al. Population
analysis of Fusarium graminearum from wheat fields in
eastern China [ J] . Phytopathol. , 2002, 92: 1315 -
1322.
[13] Zhang J B , Li H P, Dang FJ, et al. Determination of
the trichothecene mycotoxin chemotypes and associated
geographical distribution and phylogenetic species of
the Fusarium graminearum clade from China [ J ] .
Mycological Research, 2007, 111: 967 -975.
[14] Schwara P B, Casper H H, Barr J, et al. Impact of
Fusarium head blight on the malting and brewing quali鄄
ty of barley [ J] . Cereal Research Communications,
1997, 25(2):813 -814.
[15] Jayanand B, Seungho C, Warren M, et al. Transcri鄄
ptome analysis of the barley鄄Fusarium graminearum
interaction[J] . The American Phytopathological Socie鄄
ty, 2006,19(4): 407 -417.
[16] Li H P, Wu A B , Zhao C S, et al. Development of a
generic PCR detection of deoxynivalenol鄄and nivalenol鄄
chemotypes of Fusarium graminearum[J] . FEMS Mi鄄
crobiology Letters, 2005, 243: 505 -511.
[17] Jennings P, Coates M E, Turner J A, et al. Determi鄄
nation of deoxynivalenol and nivalenol chemotypes of
Fusarium culmorum isolates from England and Wales
by PCR assays[J] . Plant Pathology, 2004, 53:182 -
190.
[18] Huang X H, Ye H Z. The population structure of Fu鄄
sarium spp. from wheat in Sichuan [ J] . Southwest
China Journal of Agricultural Sciences (西南农业学
报), 2005, 18(3): 281 -285.
[19] Doohan F M, Parry D W, Jenkinson P, et al. The use
of species鄄specific PCR鄄based assays to analyse Fusari鄄
um ear blight of wheat [ J] . Plant Pathology, 1998,
47: 197 -205.
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