全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""("!%
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#
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收稿日期$
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%修改稿收到日期$
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基金项目$陕西省科技攻关项目"
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#%西安市科技攻关计划&
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#
作者简介$杨明琰"
#*.)&
#!女!副教授!博士!主要从事应用微生物技术方面研究(
/(0123
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4
15
6
025
64
15.7
!
#.$89:0
杜仲内生真菌
!"#$
的鉴定及抗菌生物活性研究
杨明琰#!!梁语燕#!田
!
稼$!杨建军#!!孙
!
超$!董岁明#!
"
#
长安大学环境科学与工程学院!西安
7#"".#
%
!
旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室!西安
7#"".#
%
$
陕西省微生物研
究所!西安
7#""$
#
摘
!
要$结合菌株的形态学特征和
;<=
序列分析结果!对
#
株分离自杜仲茎部的内生真菌菌株
>?"%
进行鉴定!并
对其在
@>A
液体培养基摇床培养
$B
获得的发酵液对多种测试菌进行抗菌活性研究(结果显示$"
#
#分离自杜仲
茎部的内生真菌菌株
>?"%
经形态学特征和
;<=
序列分析!被鉴定为淡紫色拟青霉("
!
#其发酵液的乙酸乙酯提取
物对
.
种测试细菌和
*
种测试植物病原菌均具有明显的抑菌活性!抑菌圈直径在
#$
"
%00
之间!其中对番茄灰
霉病菌)番茄叶霉病菌和苹果炭疽病菌抑菌圈直径
"
"00
(研究表明!杜仲内生真菌
>?"%
的代谢产物具有广谱
的抗菌活性!在植物病原菌的生物防治领域具有较大的应用前景(
关键词$杜仲内生真菌
>?"%
%分类鉴定%淡紫色拟青霉%抗菌活性%最低抑菌浓度
中图分类号$
C*$($$#
文献标志码$
A
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G252TSQ
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#
4
319RS1SRRWSQ19S2:5:OSMRORQ0R5S1S2:5UQ:SMRWM2U2SRBT2
6
52O2915S25M2U2S:Q
4
19S2P2S
4
1
6
125TS.SRTS
U19SRQ2115B*
X
M
4
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X
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15S2029Q:U21319S2P2S
4
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4
M1PR
X
:SR5S2131
XX
3291S2:525SMR
X
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X
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4
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X
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6
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15S2(
029Q:U21319S2P2S
4
%
02520I025M2U2S:Q
4
9:59R5SQ1S2:5
"
G;,
#
!!
植物内生菌是指在其生活史的某一段时期生活
在植物组织内!对植物组织没有引起明显病害症状
的真菌&#(!(
#**$
年
=S2RQ3R
等从太平洋红豆杉
"
,#&
4
&#
-
*:
#树皮中分离出
#
株内生真菌"
;<$8
%
-
#*+.)1*.*
#!其能够产生与宿主植物相同的
代谢产物+++紫杉醇&$(其后很多研究证实了植物
内生菌能够产生与宿主植物相同或相似的代谢产
物!并且有很多化合物对植物具有一定的保护作用!
可以使其免受植物病原菌的侵害&(.(此外!很多植
物内生菌所产生的活性物质具有新颖性!研究显示
从植物内生菌分离的生物活性物质有
%#[
是以前
没有发现的&7(这些研究结果表明植物内生菌是一
类非常重要的微生物菌种资源!其在工业)农业)医
药等领域具有重要的应用前景(
杜仲是中国传统的药用植物!可以产生绿原酸!
枫叶珊瑚苷!京尼平苷等多种具有药用价值的代谢
产物!具有降血压)降血脂)抗菌)抗病毒及利尿的生
物活性&)(目前对杜仲内生真菌的研究主要集中在
内生菌的分离方法)生物多样性和生物活性等方
面&*(#"!很多研究结果表明杜仲内生真菌具有普遍
的抗菌活性!在植物病害的生物防治领域有一定的
应用前景&##(#!(
本文作者从秦岭杜仲茎部分离得到
#
株内生真
菌
>?"%
!结合菌株的形态学特征和
;<=
序列分析
结果对其进行分类学鉴定!并对
>?"%
发酵液的乙
酸乙酯提取物对
.
种细菌和
*
种常见果蔬病原菌的
抗菌活性进行了研究!以期为该菌株进一步的开发
利用提供研究基础(
#
!
材料和方法
A8A
!
实验材料
ABABA
!
杜仲内生真菌菌株
!"#$
!
分离自杜仲茎
部!经纯化培养后以
@>A
斜面培养基
保存于
冰箱&#!(
A8A8C
!
测试细菌
!
共
.
种!由陕西省微生物研究所
提供(包括革兰氏阳性菌$枯草芽孢杆菌"
/#&(("+
+"=0&(&+
#)藤黄八叠球菌"
>1#&.("0*
#)蜡样芽孢
杆菌"
/#&(("+#*1*"+0=(*0+
#)金黄色葡萄球菌
"
>0
9
6
-
($##$#"+"1*"+]:TR5U19M
#和革兰氏阴性
菌$铜绿假单孢杆菌"
,+*")$%$.+*1"
7
&.$+
#)大
肠杆菌"
!+#6*1&#$(&
#(
A8A8D
!
测试病原菌
!
共
*
种!由西北农林科技大学
植物保护学院提供(包括番茄灰霉病菌"
/$01
-
0&+
#&.*1*
#)苹果炭疽病菌"
5$((*0$01"%
7
($*$+
9
$8
1&$&)*+
#)烟草赤星病菌"
?(
7
*1.1&(0*1.0
#)辣
椒炭疽病菌"
5$((*0$01"%#
9
+&#&
#)番茄早疫病
菌"
?(0*1.1&+$(.&
#)苹果腐烂病菌"
@(+%(&
P1Q8%(&
#)苹果轮纹病菌 "
/$01
-
$+
9
6*1&)$8
06&)*
#)梨炭疽病"
A($%*1*((#&.
7
"(0
#和番茄叶
霉病菌"
2"(3&
4
"(3
#(
A8C
!
培养基
@>A
固体培养基)
@>A
液体培养基)肉汤蛋白
胨培养基)查氏培养基&#$(
ABD
!
杜仲内生真菌
!"#$
的鉴定
A8D8A
!
菌落及孢子形态
!
将菌种以点种于
@>A
平板上!
)培养
$
"
7B
!观察菌落形态)质地和颜
色等形态特征(
将菌种划线接种于
@>A
培养基平板!
%^
斜插
入无菌盖玻片!
)培养
$B
后!按以下步骤制作
扫描电镜样品$将盖玻片切成
%00_%00
小块
#
!8%[
戊二醛溶液固定
!
"
M
#
@` =
缓冲液清洗
$
次
#
#[
锇酸固定

"
.M
#
@` =
缓冲液清洗
$
次
#
用
$"[
)
%"[
)
7"[
)
%[
)
*%[
脱水各
#
次
#
#""[
乙醇脱水
!
次
#
乙酸异戊酯置换
!
次
#
临界点干燥
#
喷金(扫描电子显微镜观察孢子着生情况及形态
特征&#(
ABDBC
!
杜仲内生真菌
!"#$
的分子生物学鉴
定&#%(#.
!
提取
>?"%
基因组
>EA
!采用通用引物$
;<=#
"
%a(<,,F#!
;<=
"
%a(<,,<,,F,<#进行
@,]
扩增(
@,]
产物用
#[
凝胶电泳进行检测!送北京
奥科鼎盛生物科技有限公司测序(将扩增序列提交
到
FR5`15b
核酸序列数据库!应用
3`1TS
程序对所
测得的内生真菌
;<=
序列进行相似性比对(进一
步采用
,3ITS13-#8)$
软件对高同源序列进行多序
列联配分析!然后采用
GR
6
18"
进行进化树构建(
ABE
!
杜仲内生真菌
!"#$
的抗菌活性测试
ABEBA
!
杜仲内生真菌
!"#$
的培养及代谢产物的
提取
!
将杜仲内生真菌
>?"%
经
@>A
固体培养基
活化
7!M
后!用直径
.00
的打孔器取菌饼接种于
#""0H
的液体
@>A
中!置于"
!)c!
#
摇床"
#%"
Q
,
025
#培养
$
"
%B
!
"8%
#
0
滤膜过滤去除菌丝体(
取滤液加
*%[
乙醇至乙醇终浓度为
7"[
"
7%[
!室
温放置
$
"
%M
!
."""Q
,
025
离心
#%025
!分别收集
沉淀和上清(取上清液减压浓缩至原体积后!加等
量乙酸乙酯萃取
$
次!合并萃取液!
"减压浓缩
至膏状(
ABEBC
!
杜仲内生真菌
!"#$
提取物抗菌活性测试
!
采用管碟法分别测定发酵滤液)乙醇沉淀)乙酸乙
酯萃取液及萃余液的抗菌活性(在
*00
的培养皿
中倾倒双层平皿!下层为水琼脂层!上层为含菌层(
在含菌层凝固后放入两个无菌牛津杯!在杯中加入
#""
#
H
样品液"不得使液体溢出#!测试细菌置于
$7
培养
#)
"
!M
!测试真菌置于
!)培养
7!M
!十
#%%!
#!
期
!!!!!!!!!!!
杨明琰!等$杜仲内生真菌
>?"%
的鉴定及抗菌生物活性研究
字交叉法测量抑菌圈直径(乙酸乙酯萃取液加
#""
#
H
乙酸乙酯作为对照(
A8E8D
!
杜仲内生真菌最低抑菌浓度"
G;,
#测定
!
将乙酸乙酯膏状提取物溶解后!配制成一定浓度!采
用常量肉汤稀释法!测定其
G;,
(
!
!
结果与分析
CBA
!
杜仲内生真菌菌株
!"#$
形态学特征
杜仲内生真菌菌株
>?"%
在
@>A
培养基上
!)
生长
$B
后!菌落淡紫色!隆起!菌丝长绒状!表面
粉质!无分泌物!基质无色(扫描电镜观察其菌丝及
分生孢子形态!结果如图
#
所示(其菌丝无色)细
长)分隔!分生孢子梗呈瓶状或近瓶形"瓶梗#!在菌
丝端或短枝上轮生帚状枝!分生孢子为单细胞!椭圆
形至纺锤形!呈链状(
CBC
!
杜仲内生真菌菌株
!"#$
的分子生物学鉴定
经
@,]
扩增后获得的杜仲内生真菌菌株
>?"%
的
;<=
序列全长为
%%%U
X
!应用
3`1TS
程序对所测
得的内生真菌
;<=
序列进行相似性比对(采用软
件
,3ITS13-#8)$
进行多序列的比较!比对结果采用
G/FA8"
软件进行系统进化树的构建(通过
GR
6
1U31TS
程序在
FR5`15b
核酸序列数据库中搜索
高度相似的序列!筛选与
>?"%
同源性高于
*[
的
菌株用于系统发育分析(基于邻接法"
ER2
6
MU:Q(
K
:2525
6
!
EJ
#构建系统进化树!结果见图
!
(由图
!
可知!
>?"%
与淡紫色拟青霉"
,*#&($%
-
#*+(&(#&8
."+
#同源性高达
**[
(结合形态学鉴定结果!将分
离自杜仲的内生真菌菌株
>?"%
鉴定为淡紫色拟
青霉(
CBD
!
杜仲内生真菌
!"#$
活性物质的提取及抑菌
活性测定
分别收集并测定杜仲内生真菌
>?"%
发酵液的
乙醇沉淀)乙酸乙酯萃取液及萃余液的抗菌生物活
图
#
!
菌株
>?"%
的孢子形态
d2
6
8#
!
=
X
:QR0:Q
X
M:3:
64
:O>?"%
图
!
!
内生真菌
>?"%;<=
序列的聚类分析
d2
6
8!
!
,3ITSRQ25
6
1513
4
T2T:O;<=TR
Z
IR59RT:O>?"%
表
A
!
杜仲内生真菌
!"#$
乙酸乙酯提取物抑菌活性及最低抑菌浓度
<1U3R#
!
A5S2U19SRQ21:ORSM
4
319RS1SRRWSQ1S2:5:O>?"%15B2ST02520I025M2U2S:Q
4
9:59R5SQ1S2:5
"
G;,
#
测试菌
6
152T0
抑菌圈直径
;5M2U2S2:5e:5R
,
00
最低抑菌浓度
G;,
,"
0
6
,
0H
#
图版
@31SR
细菌
1`9SRQ21
金黄色葡萄球菌
>0
9
6
-
($##$#"+"1*"+ !% .8# d2
6
8$
!
1
大肠杆菌
!+#6*1&#$(& !$ #$8! d2
6
8$
!
U
铜绿假单孢杆菌
,+*")$%$.+*1"
7
&.$+ #$ #$8! d2
6
8$
!
9
藤黄八叠球菌
>1#&.("0* $" $8"% d2
6
8$
!
B
蜡样芽孢杆菌
/#&(("+#*1*"+ #. .8# d2
6
8$
!
R
枯草芽孢杆菌
/#&(("++"=0&(&+ #) .8# d2
6
8$
!
O
植物病原菌
@315S
X
1SM:
6
R529
OI5
6
2
番茄灰霉病菌
/$01
-
0&+#&.*1* " .8# d2
6
8$
!
6
辣椒炭疽病菌
5$((*0$01"%#
9
+&#& !7 .8# d2
6
8$
!
M
烟草赤星病菌
?(0*1.1&(0*1.0 # .8# d2
6
8$
!
2
苹果炭疽病菌
5$((*0$01"%
7
($*$+
9
$1&$&)*+ ! .8# d2
6
8$
!
K
番茄早疫病菌
?(0*1.1&+$(.& $! $8"% d2
6
8$
!
b
苹果腐烂病菌
@(+%(&P1Q8%(& $! $8"% d2
6
8$
!
3
苹果轮纹病菌
/$01
-
$+
9
6*1&)$06&)* !7 $8"% d2
6
8$
!
0
梨炭疽病
A($%*1*((#&.
7
"(0 !) .8# d2
6
8$
!
5
番茄叶霉病菌
2"(3&
4
"(3 % #$8! d2
6
8$
!
:
!%%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
图
$
!
杜仲内生真菌
>?"%
乙酸乙酯提取物对测试菌的抑菌活性
18
金黄色葡萄球菌%
U8
大肠杆菌%
98
铜绿假单孢菌%
B8
藤黄八叠球菌%
R8
蜡样芽孢杆菌%
O8
枯草芽孢杆菌%
6
8
番茄灰霉病菌%
M8
辣椒炭疽病菌%
28
烟草赤星病菌%
K
8
苹果炭疽病菌%
b8
番茄早疫病菌%
38
苹果腐烂病菌%
08
苹果轮纹病菌%
58
梨炭疽病%
:8
番茄叶霉病菌
d2
6
8$
!
A5S2U19SRQ2119S2P2S
4
:ORSM
4
319RS1SRRWSQ19S2:5:O>?"%
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-
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58A($%*1*((#&.
7
"(0
%
:82"(3&
4
"(3
性(结果表明!乙醇沉淀)萃余液均无抑菌圈!表明
其无抑菌生物活性!而萃取相浓缩后活性较高!说明
抑菌活性物质不是蛋白质类物质!用乙酸乙酯能将
活性物质完全抽提出来( 取杜仲内生真菌
>?"%
乙
酸乙酯膏状萃取物!加适量乙酸乙酯溶解后!采用牛
津杯法测其活性(采用常量肉汤稀释法!测定其
G;,
浓度(结果见表
#
及图
$
(
由表
#
可知!杜仲内生真菌
>?"%
乙酸乙酯提
取物对测试细菌及测试植物病原菌均表现出明显的
抑菌活性!说明其具有广谱的抗菌活性!抑菌圈大小
在
#$
"
%00
之间(特别是对番茄灰霉病菌)番茄
叶霉病菌和苹果炭疽病菌抑菌圈达
"00
以上!说
明其在这几种病原菌的生物防治领域具有潜在的应
用价值(
$
!
讨
!
论
本研究采用菌株的形态学特征和
;<=
序列分
析结果!将
#
株分离自杜仲茎部的内生真菌菌株
>?"%
鉴定为淡紫拟青霉(其发酵液的乙酸乙酯提
取物对革兰氏阴性菌)阳性菌和多种植物病原菌具
$%%!
#!
期
!!!!!!!!!!!
杨明琰!等$杜仲内生真菌
>?"%
的鉴定及抗菌生物活性研究
有广谱抑菌活性!特别是对番茄灰霉病)番茄叶霉)
辣椒炭疽病等植物病原菌抑菌圈达
"00
以上!说
明淡紫拟青霉在这几种病的生物防治领域具有潜在
的应用价值(
淡紫拟青霉属于半知菌亚门)丝孢纲)丝孢目)
丛梗孢科)拟青霉属!是一种杀伤力强)寄生性好的
昆虫病原真菌(自
#*7*
年
@8J1S131
首次从南方根
结线虫的卵中分离出淡紫拟青霉后!引起了全球众
多研究者的高度关注!被认为是最有前途的防治根
结线虫等线虫的生物介体(#)(尽管有大量的关于
杜仲内生真菌的分离)鉴定及生物多样性的研究!但
还没有见到有淡紫色拟青霉的报道!表明内生真菌
的分布不仅和宿主的种类有关!也和宿主所处的不
同生境有关!因此从不同生境的杜仲分离内生真菌
有助于丰富内生真菌的多样性!分离更多的具有生
物活性的新颖化合物(
参考文献!
&
#

!
!
?NL f-8/5B:
X
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