全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(１): ７￣１３(２０１５)
收稿日期: ２０１３￣１１￣１７ꎻ 修回日期: ２０１４￣０９￣２５
基金项目: 国家自然科学基金项目 ( ３１２６０４２４)ꎻ公益性行业 (农业) 科研专项 ( ２０１１０３０１８)ꎻ “十二五”国家科技支撑计划项目
(２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０６￣０７)
通讯作者: 陈绵才ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｍｉａｎｃａｉｃｈｅｎ＠１６３.ｃｏｍ
第一作者: 练冬梅ꎬ女ꎬ福建永安人ꎬ在读硕士生ꎬ 主要从事植物病原线虫研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｗｏｓｈｉｌｄｍ１９８７＠１６３.ｃｏｍꎬ Ｔｅｌ:１８８７６１７８３５２ꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０１.００２
象耳豆根结线虫 Ｈｓｐ７０基因的克隆与原核表达
练冬梅１ꎬ２ꎬ 王会芳２ꎬ 赵志祥２ꎬ 陈绵才２∗
( １海南省农科院农业环境与植物保护研究所 /海南省植物病虫害防控重点实验室ꎬ海口 ５７１１００ꎻ
２ 海南大学环境与植物保护学院ꎬ海口 ５７１１０１)
摘要:采用 ＲＴ￣ＰＣＲ、ｃＤＮＡ 末端快速扩增法(ＲＡＣＥ)ꎬ克隆了象耳豆根结线虫 Ｈｓｐ７０ 基因的全长 ｃＤＮＡ(ＭｅＨｓｐ７０)序列ꎮ
ＭｅＨｓｐ７０ ｃＤＮＡ全长 ２ ２０３ ｂｐꎬ含有 １ ９５９ ｂｐ的开放阅读框ꎬ编码 ６５３个氨基酸ꎬ相对分子量为 ７１.０９ ｋＤａꎬ具有 ３段Ｈｓｐ７０家族
的签名序列ꎬＧｅｎＢａｎｋ 登录号 ＫＦ７３９４３４ꎮ 同源性分析表明ꎬ氨基酸序列与其他真核生物的 Ｈｓｐ７０序列具有很高的相似性ꎮ 该
Ｈｓｐ７０与其他物种中的 Ｈｓｐ７０进行系统进化分析ꎬ结果显示ꎬＨｓｐ７０的系统发育树不能体现物种间的亲缘关系ꎬ推测其反映的
是不同物种间 Ｈｓｐ７０ 生物学功能的相似性程度ꎮ 构建了一个原核表达载体 ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１￣ＭｅＨｓｐ７０ꎬ当 ＩＰＴＧ 终浓度为
０.４~１.０ ｍｍｏｌ / Ｌ时ꎬ能诱导表达融合蛋白ꎮ ＭｅＨｓｐ７０基因的克隆和表达ꎬ将为象耳豆根结线虫的生态适应性机理研究提供依据ꎮ
关键词:象耳豆根结线虫ꎻ Ｈｓｐ７０ꎻ 克隆ꎻ 表达
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｆｒｏｍ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 　 ＬＩＡＮ
Ｄｏｎｇ￣ｍｅｉ１ꎬ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｈｕｉ￣ｆａｎｇ２ꎬ ＺＨＡＯ Ｚｈｉ￣ｘｉａｎｇ２ꎬ ＣＨＥＮ Ｍｉａｎ￣ｃａｉ２ 　 ( １ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ＆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃ￣
ｔｉｏｎꎬ Ｈａｉｎａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈａｉｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓ ꎬ Ｈａｉｋｏｕ
５７１１００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ (ＭｅＨｓｐ７０) ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｆｒｏｍ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ
ＲＴ￣ＰＣＲꎬ ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ ( ＲＡＣＥ) . Ｔｈｅ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆ ＭｅＨｓｐ７０ ｗａｓ ２ ２０３ ｂｐ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ (ＯＲＦ) ｏｆ １ ９５９ ｂｐ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ６５３ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｅｄｉｃ￣
ｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ７１.０９ ｋＤａꎬ ｗｈｉｃｈ ｃａｒｒｉｅｄ ｔｈｒｅｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｎｄ ｉｎｔａｃｔ Ｈｓｐ７０ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ ｗｈｉｃｈ
ｗａｓ ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｗｉｔｈ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＫＦ７３９４３４. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ￣ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｏｔｈｅｒ ｅｕｋａｒｙａ. Ｔｈｅ Ｈｓｐ７０ｓ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｒｅｆｌｅｃｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｉｓｍｓꎬ ｍａｙｂｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｗａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ. Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＯＲＦ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＭｅＨｓｐ７０ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１ ａｎｄ ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１￣ＭｅＨｓｐ７０ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ. Ｔｈｅ ＭｅＨｓｐ７０ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｂｙ ０. ４￣１.０ ｍｍｏｌ / Ｌ
ＩＰＴＧ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉꎻ Ｈｓｐ７０ꎻ ｃｌｏｎｉｎｇꎻ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３２.４５　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０１￣０００７￣０７
　 　 象耳豆根结线虫(Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ)最
早于 １９８３年由杨宝君等在海南儋州的象耳豆树上
发现并鉴定和命名[１]ꎮ Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 在全球农作
物中已经成为一种经济上重要的寄生线虫[２ꎬ３]ꎮ
　
植物病理学报 ４５卷
该线虫在美洲、非洲、欧洲等均有分布ꎬ为世界上公
认的危害最大的根结线虫之一ꎮ 近年来ꎬＭ. ｅｎｔｅｒ￣
ｏｌｏｂｉｉ 的迅速传播也引起了学者的广泛关注ꎬ在国
内外ꎬＭ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 也陆续被报道ꎮ 据调查ꎬ在海
南岛主要栽培作物葫芦科蔬菜、茄果类蔬菜、南药
作物和热带果树均已发现有 Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 广泛寄
生[４]ꎬ同时 Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 还可寄生携带 Ｍｉ抗性基
因的番茄和辣椒[５]ꎮ 通过海南岛茄果类蔬菜根结
线虫种类鉴定ꎬ发现 Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 种群已进一步
扩散ꎬ正在显示出取代南方根结线虫ꎬ而成为我国
热带亚热带地区最重要根结线虫种类的趋势ꎮ
　 　 热激蛋白(Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ Ｈｓｐｓ)于 １９６２
年由遗传学家 Ｒｉｔｏｓｓａ 在研究果蝇唾液腺时被发
现ꎬ继而成为众多学者研究植物抗逆性机制的热
点ꎮ 热激蛋白家族中以 Ｈｓｐ７０ 的含量最丰富、结
构和功能最为保守ꎬ且充当分子伴侣ꎬ高温、干旱、
低温以及重金属离子等各胁迫因子均可诱导其合
成增加[６]ꎬ因而成为 Ｈｓｐｓ家族中最受关注的对象ꎮ
目前ꎬ国内外已从旋尾目、杆形目和垫刃目等线虫
中克隆了多个 Ｈｓｐ７０ 基因[７]ꎮ 克隆到 Ｈｓｐ７０ 基因
的全长序列ꎬ有助于揭示该基因的功能ꎬ并通过异
源表达分析蛋白的性质和功能ꎮ 本研究获得了 Ｍ.
ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ Ｈｓｐ７０ 基因的完整编码区序列ꎬ同时将
该蛋白原核融合表达到大肠杆菌中ꎬ为进一步揭示
Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ环境适应机制奠定基础ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 原始种群来源于海南省农业科
学院植物保护研究所植物线虫保存圃ꎬ在室内用改
进的贝尔曼漏斗法分离得到ꎮ
１.２　 方法
１.２.１ 第一链 ｃＤＮＡ 的合成 　 采用 Ｔｒｉｚｏｌ 法提取
Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 总 ＲＮＡꎬ其 ＲＮＡ 沉淀用 ２０ μＬ 无
ＲＮａｓｅ水溶解ꎮ 取 ５ μＬ 总 ＲＮＡ 为模板ꎬ以 ｏｌｉｇｏ￣
ｄｔ为引物ꎬ用反转录酶 (ＴａＫａＲａ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ
１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ)进行反转录ꎬ合成
ｃＤＮＡ第一链ꎮ
１.２.２　 Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ Ｈｓｐ７０基因片段的克隆　 Ｈｓｐ７０
的氨基酸序列含有多个签名序列及高度保守区域ꎬ
合成简并引物 ７０Ｆ 和 ７０Ｒ (表 １)ꎬ用于扩增
Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ Ｈｓｐ７０ 部分序列ꎮ 以第一链 ｃＤＮＡ
为模板进行扩增ꎬ反应参数为:９４℃预变性 ３ｍｉｎꎻ
然后 ９４℃变性 ３０ ｓꎬ４５℃退火 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 ５０ ｓꎬ
共 ３５个循环ꎻ最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ产物以
１.２％琼脂糖凝胶电泳检测和分离ꎬ用 ＤＮＡ 回收试
剂盒回收后连接到 ｐＥＡＳＹ￣Ｔ１ 克隆载体中ꎬ转化
Ｔｒａｎｓ１￣Ｔ１感受态细胞ꎬ挑取阳性单菌落放大培养ꎬ
ＰＣＲ 鉴定阳性转化子ꎬ挑选阳性克隆送上海生工
生物技术有限公司进行序列测定ꎮ
１.２.３　 ＲＡＣＥ 扩增　 根据已分离得到的目的片段
分别设计 ５′和 ３′ＲＡＣＥ 特异性引物 ５ＧＳＰ、５ＮＧＳＰ
和 ３ＧＳＰ(表 １)ꎬ用于 ＲＡＣＥ反应获得 Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏ￣
ｂｉｉ Ｈｓｐ７０基因的全长 ｃＤＮＡ序列ꎮ
　 　 以 Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 总 ＲＮＡ 为模板ꎬ利用 ＲＬＭ￣
ＲＡＣＥ ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ Ｋｉｔ( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)合成带 ３′接
头和 ５′接头的 ｃＤＮＡ 第一链ꎮ 以带 ３′接头的
ｃＤＮＡ第一链为模板ꎬ３ＧＳＰ和ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ３′Ｐｒｉｍｅｒ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ￣ｐｒｉｍｅｒｓ￣ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ( ５′→３′)
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉａｌ
Ｈｓｐ７０ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
７０Ｆ ＴＫＧＴＣＡＣＷＧＴＳＣＣＭＧＣＴＴＡＣ
７０Ｒ ＧＧＹＴＧＲＴＴＲＴＣＭＧＡＡＴＡＧＧＴ
５′ＲＡＣＥ
５ＧＳＰ ＣＡＡＡＡＴＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＧＴＧＴＣ
５ＮＧＳＰ ＴＣＣＡＧＣＡＴＣＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＴＧＡＣＧ
３′ＲＡＣＥ ３ＧＳＰ ＧＴＧＣＴＣＴＣＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣＧＴＡＣＴＧＣＴＴ
ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ Ｋｉｔ
ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ５′Ｐｒｉｍｅｒ ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ
ＧｅｎｅＲａｃｅＴＭ ５′Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ
ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ３′Ｐｒｉｍｅｒ ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧ
ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１￣ＭｅＨｓｐ７０
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ＭｅＦ ＧＡＴＧＴＣＴＡＡＡＧＣＴＡＡＣＧＣＴＧ
ＭｅＲ ＡＴＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴＴＧ
８
　
　 １期 练冬梅ꎬ等:象耳豆根结线虫 Ｈｓｐ７０基因的克隆与原核表达
为引物ꎬ进行 ３′端的 ｃＤＮＡ 扩增ꎻ以带 ５′接头 ｃＤ￣
ＮＡ第一链为模板ꎬ５ＧＳＰ 和 ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ５′Ｐｒｉｍｅｒ
进行 ５′端的 ｃＤＮＡ扩增ꎬ将扩增产物稀释 １００倍以
后ꎬ以 ５ＮＧＳＰ和 ＧｅｎｅＲａｃｅＴＭ ５′Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ 进行
巢式 ＰＣＲ扩增ꎮ 然后电泳检测ꎬ纯化 ３′和 ５′ＲＡＣＥ
ＰＣＲ 产物后再进行连接、转化和测序ꎮ 测序结果
与核心序列利用 ＤＮＡＭＡＮ ６. ０ 进行拼接ꎬ得到
Ｈｓｐ７０基因的全长 ｃＤＮＡ序列ꎮ
１.２.４　 序列比对和生物信息学分析　 序列同源性
比对和相似性搜索用在线生物学软件 ｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｂｌａｓｔ 进行ꎬ多序列比对
采用生物软件 ＤＮＡＭＡＮ ６.０ꎬ开放阅读框(ＯＲＦ)
预测和氨基酸序列分析采用 ＢｉｏＸＭ ２. ６ 生物软
件ꎬＨｓｐ７０ 进化树采用 ＭＥＧＡ４ꎬ以邻位相连法
(Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ＪｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ)构建ꎮ
１.２.５　 表达载体的构建及目的蛋白的诱导表达　 以
第一链 ｃＤＮＡ为模板ꎬ用引物ＭｅＦ和ＭｅＲ(表 １)扩
增 Ｈｓｐ７０基因的开放阅读框区域ꎮ ＰＣＲ 产物连入
ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１ꎬ连接产物 ４２℃热激转化到感受态细胞
Ｔｒａｎｓｌ￣Ｔ１ 中涂板培养 (含氨苄青霉素 １００μｇ /
ｍＬ)ꎬ挑取单克隆培养ꎬ以菌液为模板进行 ＰＣＲ 鉴
定ꎬ将阳性克隆送公司测序ꎬ并进行序列分析ꎮ 将
构建好的表达载体 ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１￣Ｈｓｐ７０ 转化到感受
态细胞 ＢＬ２１(ＤＥ３)中ꎬ涂板培养ꎮ 挑取转化子接
种于含氨苄青霉素的培养液中振荡培养至菌液 ＯＤ
值约为 ０.４~ ０.５ 时ꎬ加入 ＩＰＴＧ 使终浓度为０.４、０.８、
１.０ ｍｍｏｌ / Ｌ时ꎬ３７℃振荡培养 ３ ｈ后离心收集菌体ꎬ
向收集的菌体中加入 １００ μＬ １×蛋白上样缓冲液ꎬ
１００℃加热 ５ ｍｉｎꎬ将样品取出冷却至室温ꎬ离心后取
８ μＬ 上清于 ８％分离胶和 ５％浓缩胶中进行
ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳分析ꎮ 最后将所获得的电泳图片利
用 Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ４.６.６软件预测其分子量的大小ꎮ
２　 结果与分析
２.１ 　 Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｍｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ Ｈｓｐ７０ 基因全
长 ｃＤＮＡ序列的克隆
　 　 采用同源克隆的策略ꎬ以 Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ ｃＤＮＡ
为模板ꎬ用设计的简并引物进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ结果
获得８８０ ｂｐ 的片段(图 １)ꎮ 与 ＧｅｎＢａｎｋ 上已注册
的其他线虫 Ｈｓｐ７０部分序列进行对比ꎬ结果表明ꎬ
Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ Ｈｓｐ７０ 部分序列与大豆孢囊线虫
(Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ)、马铃薯腐烂茎线虫(Ｄｉｔｙｌｅｎ￣
ｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ )、 松 材 线 虫 ( Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ
ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ)、拟松材线虫(Ｂ. ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ)Ｈｓｐ７０部分
序列的同源性分别为 ７７. ２７％、７８.０７％、７８. ９８％、
７９.５５％ꎬ说明具有较高的同源性ꎮ 进而通过 ＲＡＣＥ￣
ＰＣＲ技术分别获得 １ ３８５ ｂｐ 的３′端序列(图 ２)和
５４４ ｂｐ的 ５′端序列(图 ３)ꎮ 最后利用 ＤＮＡＭＡＮ ６.０
Ｆｉｇ. １　 ＲＴ￣ＰＣＲ ｏｆ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ Ｈｓｐ７０
Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ２０００ꎻ Ｌａｎｅ １ ａｎｄ ２: Ｐａｒｔｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｓｐ７０.
Ｆｉｇ. ２　 ３′ＲＡＣＥ ｏｆ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ Ｈｓｐ７０
Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ２０００ꎻ Ｌａｎｅ １ ａｎｄ ２: Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ３′ＲＡＣＥ.
Ｆｉｇ. ３　 ５′ＲＡＣＥ ｏｆ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ Ｈｓｐ７０
Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ２０００ꎻ Ｌａｎｅ １: Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ５′ＲＡＣＥ.
９
　
植物病理学报 ４５卷
软件将相互重叠的 ３ 段序列进行拼接ꎬ得到
２ ２０３ ｂｐ的全长 ｃＤＮＡ 序列ꎬ并命名为 ＭｅＨｓｐ７０
(ＧｅｎＢａｎｋ登录号为:ＫＦ７３９４３４ )ꎮ
２.２　 序列分析
　 　 经 ＢｉｏＸＭ ２.６ 生物软件分析ꎬＭｅＨｓｐ７０ 全长
ｃＤＮＡ为 ２ ２０３ ｂｐꎬ５′末端有 ４９ ｂｐ 的非翻译区ꎬ３′
末端有 １９５ ｂｐ 非翻译区并含有一个短的 ｐｏｌｙＡ 尾
巴ꎬ开放阅读框(ＯＲＦ) 长度为 １ ９５９ ｂｐꎬ编码 ６５３
个氨基酸ꎬ预测编码蛋白质的分子量为 ７１.０９ ｋＤａꎬ
等电点为 ５.２９ꎮ ＭｅＨｓｐ７０ 氨基酸序列中含有真核
生物 Ｈｓｐ７０ 家族蛋白的三个标签序列(９ ~ １６ 位的
ＩＤＬＧＴＴＹＳꎬ １９８ ~ ２１１ 位的 ＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬꎬ
３３５~３４８位的 ＩＶＬＶＧＧＳＴＲＩＰＫＶＱ)和胞质型 Ｈｓｐ７０
所特有的末端高度保守序列ＥＥＶＤ[８ꎬ９] (图４) ꎮ与
Ｆｉｇ. ４　 Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ Ｈｓｐ７０ ｃＤＮＡ
Ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ５′ ａｎｄ ３′ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎꎻ Ｃａｐｉｔａｌ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎꎬ ａｂｏｖｅ: ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ
ｂｅｌｏｗ: ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎻ Ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ ａｒｅ ｏｖｅｒｌｉｎｅｄꎻ Ａｓｔｅｒｉｓｋｓ ｍａｒｋ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎꎻ
Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙｂｏｌｄꎻ Ｔｈｅ ＥＥＶＤ ｍｏｔｉｆ ａｒｅ ｆｒａｍｅｄ.
０１
　
　 １期 练冬梅ꎬ等:象耳豆根结线虫 Ｈｓｐ７０基因的克隆与原核表达
ＧｅｎＢａｎｋ中注册的全序列植物寄生线虫 Ｈｓｐ７０ 以
及其他代表性真核生物的 Ｈｓｐ７０ 基因所推导的氨
基酸序列进行对比ꎬ结果表明ꎬＭｅＨｓｐ７０ 与大豆孢
囊线虫(Ｈ. ｇｌｙｃｉｎｅｓ)、马铃薯腐烂茎线虫(Ｄ. ｄｅ￣
ｓｔｒｕｃｔｏｒ)、松材线虫 (Ｂ. ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ)、拟松材线虫
(Ｂ. ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ)、秀丽隐杆线虫 (Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ
ｅｌｅｇａｎｓ)、果蝇 (Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ)和酵母
( Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ) 的 同 源 性 分 别 为
９２.０７％、９０.０６％、８８.２１％、８８.５１％、８６.３７％、７７.９５％
和 ７５.０４％ꎮ
２.３　 进化分析
　 　 将本研究所获得的 ＭｅＨｓｐ７０ 氨基酸全长序列
与 ＧｅｎＢａｎｋ中注册的大豆孢囊线虫(Ｈ. ｇｌｙｃｉｎｅｓ)、
马铃薯腐烂茎线虫(Ｄ. ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ)、马来丝虫(Ｂｒｕ￣
ｇｉａ ｍａｌａｙｉ)、班氏吴策丝虫 (Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆ￣
ｔｉ)、和指状腹腔丝虫(Ｓｅｔａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ)等真核生物
的 Ｈｓｐ７０ꎬ弗氏志贺菌(Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ)、鼠疫杆菌
(Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ)、大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)等原
核生物ꎬ采用 ＭＥＧＡ４ꎬ以邻位相连法(Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣
ＪｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ)构建进化树ꎬ多序列比对等参数的设
置采用默认设置值(图 ５)ꎮ 结果表明ꎬ来自真核生
物的 Ｈｓｐ７０ 聚为一支ꎬ来自原核生物的 Ｈｓｐ７０ 形
成另一支ꎻ在真核生物中ꎬ动物寄生线虫 Ｈｓｐ７０ 聚
为一支ꎬ而同属于植物寄生线虫的松材线虫
(Ｂ. ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ)、拟松材线虫(Ｂ. ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ)未与
马铃薯腐烂茎线虫(Ｄ. ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ)、Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ、
大豆孢囊线虫(Ｈ. ｇｌｙｃｉｎｅｓ)形成一支ꎮ
２.４　 目的融合蛋白的表达
　 　 重组表达载体质粒的 ＰＣＲ 产物约为 ２ ｋＢ(图
６)ꎬ进一步通过测序证实 ＭｅＨｓｐ７０ 基因已定向插
入 ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１的多克隆位点ꎬ且读码框正确无误ꎮ
将构建好的重组质粒转化 ＢＬ２１(ＤＥ３) 工程菌ꎬ进
行工程菌诱导表达 ＭｅＨｓｐ７０ꎮ 经 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 分析
(图 ７)ꎬ与空载体相比ꎬ ＩＰＴＧ 终浓度为 ０. ４、０. ８、
１.０ ｍｍｏｌ / Ｌ时ꎬ能显著诱导重组质粒表达出约 ７１
ｋＤａ左右的融合蛋白ꎬ其分子量经 Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ
４.６.６软件预测ꎬ结果为 ７１.００ ｋＤａꎬ说明 ＭｅＨｓｐ７０
融合蛋白表达成功ꎮ
Ｆｉｇ. ５　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ′ｎａｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｓｐ７０ｓ: Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ(ＡＡＮ７８３００)ꎬ Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ
ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ(ＡＥＰ１９２１４)ꎬ Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ(ＡＢＧ７４３４９)ꎬ Ｂ. ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ(ＡＣＵ００６８５)ꎬ Ｂ. ｍａｌａｙｉ(ＸＰ＿００１９００１９７)ꎬ
Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ(ＡＡＦ３２２５４)ꎬ Ｓ. ｄｉｇｉｔａｔａ(ＡＡＤ１３１５４)ꎬ Ｃａｅｎｏｒｐｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ(ＡＡＡ２８０７８)ꎬ Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ(ＮＰ＿６７１００３)ꎬ
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ(ＮＰ＿７０５９７３)ꎬ Ｃ. ｋｏｓｅｒｉ(ＹＰ＿００１４５４８９２)ꎬ Ｅ. ｃｏｌｉ(ＹＰ＿００１４５６７９９)ꎬ Ｃ. ｂｒｉｇｇｓａｅ(ＸＰ＿００２６３２４２９)ꎬ
　 　 Ｄ. ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ(ＡＤＩ５４９４２)ꎬ Ｃ. ｃｕｒｖａｔｕｓ(ＣＡＡ７２７９７) . Ｔｈｅ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｓｔａｎｃｅ.
１１
　
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ６ 　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１￣ＭｅＨｓｐ７０
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ｂｙ ＰＣＲ
Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ２０００ꎻ Ｌａｎｅ １￣３: Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ.
Ｆｉｇ. ７ 　 Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１￣ＭｅＨｓｐ７０
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｂｙ
ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ
Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒꎻ ０: ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ３ ｈ ｗｉｔｈ
１.０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＩＰＴＧꎻ １ꎬ ２ ａｎｄ ３: ｐＥＡＳＹ￣Ｅ１￣ＭｅＨｓｐ７０ ｉｎｄｕｃｅｄ
ｆｏｒ ３ ｈ ｗｉｔｈ ０.４ꎬ ０.８ ａｎｄ １.０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＩＰＴＧꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
３　 讨论
　 　 Ｈｓｐ７０ 是所有原核生物和真核生物在发育过
程中为了适应不同环境而合成起关键作用的蛋白
质家族ꎮ 试验首次克隆了 Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 的 Ｈｓｐ７０
基因ꎬ其在氨基酸水平上与其他线虫的同源性均在
８０％以上ꎬ具有较高的同源性ꎬ这证实了 Ｈｓｐ７０ 基
因在不同的生物中具有很强的保守性ꎮ 研究发现ꎬ
在 Ｃ. ｅｌｅｇａｎｓ 中ꎬ当温度从 ２５℃ 升到 ３３℃ 后ꎬ
Ｈｓｐ７０能够迅速增加 ２倍多[１０]ꎮ 在 Ｂ. ｍａｌａｙｉ的三
龄幼虫中ꎬ当温度从 ２８℃升到 ４２℃后ꎬ４５ ｍｉｎ 内
Ｈｓｐ７０增加了 ２倍多ꎬ与 ３７℃高温诱导上调程度一
样ꎬ而且随着高温处理时间的延长继续增加[１１]ꎮ
因此ꎬＭｅＨｓｐ７０的克隆将为我们进一步研究Ｍ. ｅｎ￣
ｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 适应温度逆境的机制开辟了一条途径ꎮ
该研究还将克隆得到的 ＭｅＨｓｐ７０ 基因转化到表达
载体中ꎬ发现浓度为 ０.４ ~ １.０ ｍｍｏｌ / Ｌ 的 ＩＰＴＧ 均
能显著诱导目的蛋白的融合表达ꎬ重组蛋白的表达
将更有利于有关 ＭｅＨｓｐ７０基因及其产生蛋白的相
关性质和功能研究ꎮ 同时ꎬＭｅＨｓｐ７０ 基因的克隆
也有利于线虫与寄主植物的互作机制的研究ꎮ
　 　 以不同物种间的 Ｈｓｐ７０ｓ 为研究对象ꎬ分析了
Ｈｓｐ７０系统进化关系ꎮ 结果显示ꎬ以 Ｈｓｐ７０ 为对象
构建的物种系统进化树不能很好的反映物种间的
亲缘关系:虽然 Ｈｓｐ７０ 能够将真核生物、原核生
物、动物寄生线虫具为一支ꎬ但同属于植物寄生线
虫的 Ｂ. ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ. ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ 未与 Ｄ. ｄｅｓｔｒｕｃ￣
ｔｏｒ、Ｍ. ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ、Ｈ. ｇｌｙｃｉｎｅｓ形成一支ꎬ而是另成
一支(图 ４)ꎬ这与以核糖体 ＩＴＳ序列建立的植物寄
生线虫系统进化分析结果不符[１２]ꎮ 由于 Ｈｓｐ７０ 是
多基因家族ꎬ且具有生物学功能的多样性ꎬ可以推
测以 Ｈｓｐ７０构建系统进化树的分析结果并非反映
了物种间的亲缘关系ꎬ而是 Ｈｓｐ７０ 功能相似性的
分析ꎮ
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ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｔ￣ｓｈｏｃｋ ｃｏｇｎａｔｅ ７０ (Ｈｓｃ７０) ｇｅｎｅ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｗｏ￣ｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅꎬ Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅꎬ
ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ａｎｄ
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责任编辑:曾晓葳
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