全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(３): ２３９￣２４６(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０６￣０６ꎻ 修回日期: ２０１４￣０２￣１４
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１２６０４１８)
通讯作者: 何朝族ꎬ研究员ꎬ主要从事植物￣病原微生物相互作用研究ꎻＴｅｌ:０８９８￣６６１６０７２８ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｃｚｈｅ＠ｈａｉｎｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 韩秀秀ꎬ女ꎬ山东济宁人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病原真菌基因功能研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｈａｎｘｉｕｘｉｕ＿１９８７＠１２６.ｃｏｍꎮ
稻瘟病菌 ＭｏＣＯＳ１基因调控
ＭｏＣＭＲ１基因表达的研究
韩秀秀ꎬ 李晓宇ꎬ 何朝族∗
(海南大学农学院ꎬ海南省热带生物资源可持续利用重点实验室ꎬ 海口 ５７０２２８)
摘要:以往研究证明 ＭｏＣＯＳ１可能是一个新型的转录因子ꎬ其突变体不产生分生孢子ꎬ黑色素合成明显减少ꎮ 经过 ＲＮＡ￣
Ｓｅｑ分析ꎬ发现受 ＭｏＣＯＳ１调控的基因达到 ４４２个ꎬ其中 ＭｏＣＭＲ１的表达水平受到 ＭｏＣＯＳ１的下调ꎮ 本研究中通过实时定
量 ＰＣＲ进一步证实 ＭｏＣＯＳ１基因突变导致 ＭｏＣＭＲ１基因表达水平下降ꎮ 基因 ＭｏＣＭＲ１突变后ꎬ黑色素产量略有减少ꎬ但
分生孢子形态及产量和 ＭｏＣＯＳ１的表达量没有发生变化ꎮ
关键词:稻瘟病菌ꎻ ＭｏＣＯＳ１ꎻ 转录调控ꎻ ＭｏＣＭＲ１
ＭｏＣＯＳ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭｏＣＭＲ１ ｉｎ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｇｎａ￣
ｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ＨＡＮ Ｘｉｕ￣ｘｉｕꎬＬＩ Ｘｉａｏ￣ｙｕꎬＨＥ Ｃｈａｏ￣ｚｕ (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｉｎａｎ
Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓꎬ Ｈａｉｋｏｕ ５７０２２８ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｓｔｕｄｙ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ＭｏＣＯＳ１ ｍｉｇｈｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ. Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＭｏＣＯＳ１
ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｎｏ ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ ａｎｄ ｌｅｓｓ ｍｅｌａｎｉｎ ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ Ｙ３４. ＲＮＡ￣Ｓｅｑ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ
ｔｈａｔ ４４２ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＭｏＣＯＳ１. Ｏｆ ｔｈｅｍꎬ ＭｏＣＭＲ１ ｗａｓ ｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｏＣＯＳ１ ｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ
ＭｏＣＭＲ１. Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＭｏＣＭＲ１ ｈａｄ ｎｏ ｏｂｖｉｏｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｓｈａｐｅ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉｕｍ. Ｉｔ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＭｏＣＭＲ１ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｌｅｓｓ ｍｅｌａｎｉｎ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ＭｏＣＯＳ１ ｉｎ ＭｏＣＭＲ１Δ
ｒｅｍａｉｎｅｄ ｓｉｍｉｌａｒ ｌｅｖｅｌ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ Ｙ３４.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅꎻ ＭｏＣＯＳ１ꎻ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎꎻ ＭｏＣＭＲ１
中图分类号: Ｓ４３２.４４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０３￣０２３９￣０８
稻瘟病菌属子囊菌属[１]真菌ꎬ可引起水稻产量
减少ꎬ严重时多达 ３０％[２]ꎬ严重威胁水稻产量和粮食
安全ꎮ 稻瘟病菌是研究真菌病原菌与植物互作的模
式真菌之一[３]ꎬ目前其基因组已经测序完成ꎬ将大大
地促进稻瘟病菌致病机理的研究[４]ꎮ
附着胞是稻瘟病菌的典型侵染结构ꎬ其内部会
产生甘油ꎬ沉积大量的黑色素ꎬ且黑色素的分布不均
匀ꎬ在细胞壁内表面形成黑色素层ꎬ使甘油等较大的
分子不能穿过ꎬ而像水等小分子可以通过ꎬ这就使附
着胞内积累很大的膨胀压ꎬ为附着胞穿透植物细胞
壁提供了压力基础[５￣６]ꎮ 因此附着胞的成熟和侵染
功能的完成离不开黑色素的合成ꎮ 黑色素合成缺陷
的突变体ꎬ其产生的附着胞缺少足够的膨压穿透寄
主植物的表皮细胞ꎬ也就失去了致病能力[７]ꎬ黑色素
是病原菌致病性和侵入寄主的前提条件ꎮ
炭疽病菌(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ)的 ＣＭＲ１
是一种Ｃ２Ｈ２ 型锌指结构的转录因子ꎬ调控黑色素的
合成ꎮ ＣＭＲ１基因突变后导致菌丝黑色素积累的缺
植物病理学报 ４４卷
陷ꎬ但附着胞中的黑色素积累不受影响ꎮ ＣＭＲ１ 突
变体中ꎬ菌丝体黑色素化过程中黑色素合成基因
ＳＣＤ１和 ＴＨＲ１不表达ꎬ但在附着胞黑色素化过程中
其表达没有变化[８]ꎮ
前期研究鉴定了一个分生孢子发生相关基因
ＭｏＣＯＳ１( ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ ｓｔａｌｋ￣ｌｅｓｓ１) [９]ꎮ 通过 ＲＮＡ￣
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (ＲＮＡ￣Ｓｅｑ) 技术分析显示ꎬ受ＭｏＣＯＳ１调控
的基因有 ４４２ 个 [１０]ꎬ其中 ＭｏＣＭＲ１(ＭＧＧ＿０７２１５.６)
受到ＭｏＣＯＳ１的下调ꎬ说明 ＭｏＣＯＳ１调控ＭｏＣＭＲ１
的表达ꎮ 经生物信息学分析发现ꎬＭｏＣＯＳ１是一种
新型的调控因子ꎬ Ｇｅｌ Ｓｈｉｆｔ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ 证明
ＭｏＣＯＳ１与 ＡＡＡＡＧＡＡＡ(Ａ４ＧＡ３)保守序列可以
直接结合ꎬ调控着一条新的分生孢子发生途径[１０]ꎮ
ＭｏＣＯＳ１突变体(Ｍ２９４２)的黑色素产量明显减少[９]ꎬ
而ＭｏＣＭＲ１调控着黑色素的表达ꎮ 本文旨在探究
ＭｏＣＯＳ１ 与 ＭｏＣＭＲ１ 的遗传关系ꎬ进一步了解
ＭｏＣＯＳ１对分生孢子发生和黑色素合成途径的调控ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
１.１.１ 植物材料 水稻品种日本晴(Ｏｒａｚｙ ｓａｔｉｖａ
Ｌ.ｃｖ.Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ)ꎮ
１.１.２ 质粒和菌株 ｐＧＥＭ￣Ｔ ＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ 为 Ｐｒｏ￣
ｍｅｇａ产品ꎮ 大肠杆菌菌株为 ＤＨ５α购自北京艾德
莱生物科技有限公司ꎮ 稻瘟病菌野生型菌株 Ｙ３４、
Ｍ２９４２ꎬ基因敲除载体 ｐＣＢ￣１５３２ꎬ基因过表达载体
ｐＳｉｌｅｎｔ￣１均由本实验室保存ꎮ
１.１.３ 试剂盒、工具酶及生化试剂 真菌总 ＲＮＡ
提取试剂盒购自 ＯＭＥＧＡ 公司ꎮ 反转录试剂盒、
ＤＮＡ回收试剂盒ꎬＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 以及各种
限制性内切酶和 ＰＣＲ 相关试剂均购自 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ
公司ꎮ 引物合成均由上海英俊生物技术有限公司
合成ꎮ 测序由深圳华大基因科技有限公司完成ꎮ
其他试剂均为国产分析纯ꎮ
１.１.４ 培养基 稻瘟病菌培养用燕麦培养基、ＣＭ
培养基(蛋白胨 ６ ｇ / Ｌ、酵母粉 ６ ｇ / Ｌ、蔗糖 １０ ｇ / Ｌ、
琼脂粉 １５ ｇ / Ｌ)和 ＳＹＭ培养基(酵母粉 ３ ｇ / Ｌ、蔗
糖 ３ ｇ / Ｌ、淀粉 １０ ｇ / Ｌ、琼脂粉 １５ ｇ / Ｌ)培养ꎻ菌丝
用 ＣＭ 液体培养基ꎬ２８℃、１８０ ｒｐｍ 振荡培养ꎮ 原
生质体转化培养基为 ＤＣＭ培养基(不含氨基酸的
酵母粉 １.７ ｇ / Ｌ、天冬酰胺 ２ ｇ / Ｌ、蔗糖 ２００ ｇ / Ｌ、琼
脂粉 １５ ｇ / Ｌ)ꎻＳＴＣ 溶液[山梨醇 １.２ ｍｏｌ / Ｌ、Ｔｒｉｓ￣
ＨＣｌ(ｐＨ ７.５)１０ ｍｍｏｌ / Ｌ、ＣａＣｌ２ ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ]ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ ＭｏＣＭＲ１ 敲除载体的构建 根据数据库提
供的基因组序列ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ５.０ 设计引物ꎬ上游片
段引物 ＣＭＲ￣ＵＰ￣Ｆ 和 ＣＭＲ￣ＵＰ￣Ｒꎬ下游片段引物
ＣＭＲ￣ＤＯＷＮ￣Ｆ 和 ＣＭＲ￣ＤＯＷＮ￣Ｒꎮ ＰＣＲ 反应条
件:９４℃ ５ ｍｉｎꎬ９４℃ ３０ ｓꎬ５３℃ １ ｍｉｎꎬ３０ 个循环ꎻ
７２℃ １０ ｍｉｎꎬ克隆得到 ＭｏＣＭＲ１ 基因的上、下游片
段ꎮ 以 ｐＧＥＭ￣Ｔ Ｅａｓｙ载体作为初始载体ꎬ分两步连
接到基因敲除载体 ｐＣＢ￣１５３２上ꎬ经酶切验证得到稻
瘟病菌 ＭｏＣＭＲ１ 基因的敲除载体 (ＣＭＲＵ￣ｐＣＢ￣
ＣＭＲＤ)ꎮ
１.２.２ 稻瘟病菌ＭｏＣＭＲ１过表达载体的构建 从稻
瘟病菌基因组数据库中获得基因ＭｏＣＭＲ１的全长序
列ꎬ根据引物设计原则、载体上的酶切位点和基因序
列ꎬ设计引物 ＣＭＲ１￣Ｆ 和 ＣＭＲ１￣Ｒꎮ ＰＣＲ 反应条件:
９５℃ ５ ｍｉｎꎬ９５℃ ３０ ｓꎬ５４℃ ３ ｍｉｎꎬ３０个循环ꎻ７２℃ １０
ｍｉｎꎬ克隆得到 ＭｏＣＭＲ１的全长片段ꎮ 经 Ｔ 克隆ꎬ测
序正确后ꎬ用 Ｘｈｏ Ｉ / Ｋｐｎ Ｉ将 ＭｏＣＭＲ１片段切下ꎬ连
接到基因过表达载体 ｐＳｉｌｅｎｔ￣１上ꎬ经酶切验证得到
ＭｏＣＭＲ１基因的过表达载体(ｐＳｉｌｅｎｔ￣ＣＭＲ１)ꎮ
１.２.３ 原生质体的制备及其转化 将幼嫩菌丝接
种于 ５０ ｍＬ ＣＭ 液体培养基上振荡培养 ２ ｄꎬ然后
再扩大培养 １ ｄꎬ用 Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ过滤收集菌丝并尽可
能地挤掉多余液体ꎬ将菌丝体挑至溶壁酶溶液中ꎬ
裂解 ２~３ ｈ [溶壁酶(Ｓｉｇｍａ)溶液:１０ ｍｇ / ｍＬꎬ用 １
ｍｏｌ / Ｌ ｓｏｒｂｉｔｏｌ 配制ꎬ过滤除菌] ꎮ 然后用 Ｍｉｒａ￣
ｃｌｏｔｈ 过滤除去杂质ꎬ离心得到原生质体沉淀ꎬ用
ＳＴＣ溶液洗涤沉淀 ２ 次ꎬ再用适量的 ＳＴＣ 溶液溶
解ꎬ原生质体浓度 １０８ ~１０９ / ｍＬ[１１]ꎮ
将 ２００ μＬ原生质体与 １ ~ ２ μｇ 质粒混匀ꎬ静
置 ２０ ｍｉｎꎬ然后加入 １. ５ ｍＬ 的 ＰＴＣ 溶液 (４０％
ＰＥＧ３３５０ꎬＳＴＣ溶液)ꎬ混匀静置 ２０ ｍｉｎꎬ加入 ５ ｍＬ
ＤＣＭ液体培养基ꎬ室温振荡(１２０ ｒｐｍ)１２ ｈꎮ 将
培养物与 ＤＣＭ 下层培养基混匀ꎬ倒板ꎬ放置
１２ ｈꎬ然后再倒入上层培养基ꎮ 待菌丝长出上层
培养基时转移到新的筛选培养基上ꎬ进行复筛ꎬ
得到转化子ꎮ
０４２
３期 韩秀秀ꎬ等:稻瘟病菌 ＭｏＣＯＳ１基因调控 ＭｏＣＭＲ１基因表达的研究
１.２.４ 转化株的鉴定(ＰＣＲ检测) 将转化子用 ＣＭ
液体培养基进行培养ꎬ收集菌丝ꎬ提取转化子的基因
组 ＤＮＡ[１２]ꎮ 用于 ３对引物 Ｆ＋Ｒ、ＵＵ＋ＰＩ、ＰＩ１＋ＤＤ进
行 ＰＣＲ检测(图 １)ꎮ ＰＣＲ的反应条件:９５℃ ５ ｍｉｎꎬ
９５℃ ３０ ｓꎬ５４℃ ３ ｍｉｎꎬ３０个循环ꎻ７２℃ １０ ｍｉｎꎮ
１.２.５ 突变体表型鉴定
(１) 菌落形态及生长速率 用打孔器取 ０.６
ｍｍ的菌碟接种到燕麦培养基、ＣＭ培养基和 ＳＹＭ
培养基上ꎬ２８℃暗培养 ７ ｄꎬ观察菌落形态并拍照ꎬ
测量菌落直径ꎮ 重复 ３次ꎮ
(２) 分生孢子产量及形态 将稻瘟病菌接
种到燕麦培养基上ꎬ待菌丝铺满平板后ꎬ轻轻刮
去菌丝ꎬ然后持续光照 ３ ~ ４ ｄꎬ用打孔器从培养基
边缘到中央分别取 ３ 块培养基ꎬ置于 ３ ｍＬ 无菌
水中ꎬ充分振荡洗下分生孢子ꎬ过滤收集ꎬ拍照并
用细胞计数板计数ꎮ
(３) 致病力检测 取大小相等的菌碟倒置于
离体叶片上ꎬ２８℃、保湿、持续光照培养 ３ ~ ４ ｄꎬ观
察病斑状况ꎬ并拍照[１３]ꎮ
１.２.６ 过表达突变体的构建 将 ｐＳｉｌｅｎｔ￣ＣＭＲ１ 质
粒用 ＳｐｅⅠ单酶切后ꎬ用 ＰＥＧ 介导转入到 ＭｏＣ￣
ＭＲ１Δ的原生质体中ꎬ挑取转化子ꎬ用引物 ＣＭＲ１￣
１＋ＣＭＲ１￣２进行检测ꎬ并与 Ｙ３４和ＭｏＣＭＲ１Δ的表
型对比ꎬ观察其表型是否恢复ꎬ从而得到 ＭｏＣＭＲ１
过表达突变体(ＭｏＣＭＲ１￣ＯＥ)ꎮ
１.２.７ 实时定量 ＰＣＲ 提取稻瘟病菌 Ｙ３４、ＭｏＣ￣
ＭＲ１Δ和Ｍ２９４２的总 ＲＮＡ后ꎬ用 ｏｌｉｇｏ(ｄＴ) ｐｒｉｍｅｒ
ａｎｄＭ ￣ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ) ꎬ反
Ｆｉｇ. １ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭｏＣＭＲ１ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ
Ａ:Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｕｔａｎｔ ＭｏＣＭＲ１Δꎻ Ｂ: Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ ＵＵ＋ＰＩꎻ
Ｃ: Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｆ＋Ｒꎻ Ｄ: Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ ＤＤ＋ＰＩ１ꎻ
Ｍ: ＤＬ ２ ０００ ｂｐ ｍａｒｋｅｒꎻ ＣＫ: Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ.
１４２
植物病理学报 ４４卷
转录成 ｃＤＮＡꎮ 以野生型为对照ꎬβ￣Ｔｕｂｕｌｉｎ为内参
基因ꎬＣＯＳ１￣Ｆ＋ＣＯＳ１￣Ｒ、ＣＭＲ１Ｆｎ＋ＣＭＲ１Ｒｎ 为引
物ꎬｃＤＮＡ为模板ꎬ进行 ＲＴ￣ＰＣＲꎮ
以 Ｙ３４、ＭｏＣＭＲ１Δ 和 Ｍ２９４２ 的 ｃＤＮＡ 为模
板ꎬＴｕｂｕｌｉｎ为内参基因ꎬＣＯＳ１￣１＋ＣＯＳ１￣２、ＣＭＲ１￣１
＋ＣＭＲ１￣２ 为引物ꎬ用 ＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
ｓｙｓｔｅｍ进行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ[１４]ꎮ 反应程序为 ９５℃ ３０ ｓ
(１个循环)ꎻ９５℃ ５ ｓꎬ５８. ５℃ ３４ ｓ(４０ 个循环)ꎻ
９５℃ １５ ｓꎬ５８.５℃ ６０ ｓꎬ９５℃ １５ ｓ(１个循环)ꎮ 基因
的变化量计算公式 ２－ΔΔＣｔꎬ其中－ΔΔＣｔ ＝ (Ｃｔꎬ ｔａｒｇｅｔ
ｇｅｎｅ￣Ｃｔꎬ β￣ｔｕｂｕｌｉｎ)－(Ｃｔꎬ ＷＴ￣Ｃｔꎬ β￣ｔｕｂｕｌｉｎ) [１５]ꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＭｏＣＭＲ１基因的敲除突变体构建与验证
为了构建 ＭｏＣＭＲ１ 基因的敲除突变体ꎬ通过
同源重组ꎬ将含有该基因上游和下游 ＤＮＡ 片段的
载体(图 １￣Ａ)转入野生型稻瘟病菌ꎬ共获得 ２７８ 个
ＭｏＣＭＲ１基因候选突变体的转化子ꎬ分别提取基
因组 ＤＮＡꎬ以 Ｆ＋Ｒ 为引物进行初步筛选ꎬ可扩增
出 １ ０００ ｂｐ左右条带(图 １￣Ｃ Ｙ３４)的转化子为假
阳性ꎬ其余转化子再用另外 ２ 对引物(ＵＵ＋ＰＩ 引
物、ＤＤ ＋ ＰＩ１ 引物)进行鉴定ꎬ若分别能克隆出
１ ４００ ｂｐ和１ １００ ｂｐ左右的条带(如图 １￣Ｂ ＣＭＲ１、
图 １￣Ｄ ＣＭＲ１)ꎬ可确定其为阳性转化子ꎮ
２.２ 突变体表型鉴定
２.２.１ ＭｏＣＭＲ１突变影响稻瘟病菌黑色素含量 与
野生 型 Ｙ３４ 相 比ꎬ ＭｏＣＭＲ１ 敲 除 突 变 体
(ＭｏＣＭＲ１Δ)、Ｍ２９４２ 在燕麦培养基、完全培养基
和酵母淀粉培养基上的气生菌丝数量及形态基本
没有变化(图 ２￣Ａ)ꎬ且其菌落的生长速率也基本一
致(图 ２￣Ｂ)ꎬ但 ＭｏＣＭＲ１Δ 和 Ｍ２９４２ 的黑色素产
量有所减少(图 ２￣Ａ)ꎮ 可见 ＭｏＣＭＲ１ 基因与稻瘟
病菌的营养生长不相关ꎬ但参与黑色素的合成ꎮ
２.２.２ ＭｏＣＭＲ１ 突变不影响稻瘟病菌分生孢子形
态及数量 将稻瘟病菌菌株的菌丝置于显微镜下观
察(图 ３￣Ｃ)ꎬ结果显示:Ｙ３４、ＭｏＣＭＲ１Δ、ＭｏＣＭＲ１
过表达突变体(ＭｏＣＭＲ１￣ＯＥ)的菌丝顶端都产生分
生孢子ꎬ但Ｍ２９４２的菌丝不产生分生孢子(图 ３￣Ｃ)ꎮ
Ｍ２９４２能产生分生孢子梗ꎬ但不能产生分生孢子[９]ꎮ
将得到孢子悬浮液ꎬ于光学显微镜观察ꎮ ＭｏＣ￣
ＭＲ１Δ分生孢子的形状大小和数量与野生型相比较
并没有发生变化(图 ３￣Ａ)ꎮ 采用细胞计数板对菌株
的分生孢子进行计数ꎬ与野生型 Ｙ３４ 相比ꎬＭｏＣ￣
ＭＲ１Δ的分生孢子数目基本没有变化(图 ３￣Ｂ)ꎮ 可
见ＭｏＣＭＲ１基因不参与稻瘟病菌分生孢子发生ꎮ
２.２.３ ＭｏＣＭＲ１突变导致稻瘟病菌致病性丧失 将
用打孔器取培养 ７~８ ｄ的稻瘟病菌菌株ꎬ倒扣于水
稻叶片上 ꎬ２ ８℃保湿培养 ３ ~ ４ ｄ后 ꎬ与野生型
Ｆｉｇ. ２ Ｃｏｌｏｎｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ
Ａ: Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ＳＹＭ ｍｅｄｉｕｍꎻ Ｂ: Ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ＭｏＣＭＲ１Δꎬ Ｍ２９４２ ａｎｄ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ Ｙ３４ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｄｉａ.
２４２
３期 韩秀秀ꎬ等:稻瘟病菌 ＭｏＣＯＳ１基因调控 ＭｏＣＭＲ１基因表达的研究
Ｙ３４ 相比ꎬＭ２９４２ 的致病性相对增强ꎬ而接种
ＭｏＣＭＲ１Δꎬ不产生病斑(图 ４)ꎬ其致病性丧失ꎬ表
明 ＭｏＣＯＳ１ 对稻瘟病菌的致病性起到负调控作
用ꎬ而 ＭｏＣＭＲ１对致病性起到正调控作用ꎮ
Ｆｉｇ. ３ Ｃｏｎｉｄｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ Ｙ３４ ａｎｄ ＭｏＣＭＲ１Δ
Ａ: Ｃｏｎｉｄｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙꎻ Ｂ: Ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｑｕａｎｔｉｔｙꎻ Ｃ: Ｍｙｃｅｌｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ. Ｎｏ ｄｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ Ｙ３４ ａｎｄ ＭｏＣＭＲ１Δ.
Ｆｉｇ. ４ Ｍｙｃｅｌｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｒｉｃｅ ｌｅａｆ
Ｍｙｃｅｌｉａ ｏｆ Ｍ２９４２ ｃａｕｓｅｄ ｓｅｒｉｏｕｓ ｌｅｓｉｏｎｓꎻ Ｍｙｃｅｌｉａ ｏｆ Ｙ３４ ｃａｕｓｅｄ ｗｅａｋ ｌｅｓｉｏｎｓꎻ ｗｈｉｌｅ ｍｙｃｅｌｉａ ｏｆ
ＭｏＣＭＲ１Δ ｃａｕｓｅｄ ｎｏ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅａｆꎻ ＣＫ:Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ.
３４２
植物病理学报 ４４卷
２.２.４ ＭｏＣＯＳ１正调控 ＭｏＣＭＲ１的转录 本研究
提取稻瘟病菌 Ｙ３４、ＭｏＣＭＲ１Δ 和 Ｍ２９４２ 的总
ＲＮＡ后ꎬ反转录成 ｃＤＮＡꎬ以野生型为对照ꎬＴｕｂｕ￣
ｌｉｎ为内参基因ꎬ进行实时定量 ＰＣＲ 分析ꎮ 结果表
明ꎬ与野生型相比ꎬ在 Ｍ２９４２ 突变体中 ＭｏＣＭＲ１
的表达量明显减少(图 ５)ꎬ这与 ＲＮＡ￣Ｓｅｑ 的结果
基本一致ꎬ说明 ＭｏＣＯＳ１ 突变后 ＭｏＣＭＲ１ 的表达
量下降ꎮ 同时ꎬ与野生型比较ꎬ在 ＭｏＣＭＲ１ 敲除突
变体中 ＭｏＣＯＳ１ 的表达量基本没有发生变化(图
５)ꎬ说明 ＭｏＣＯＳ１单向调控着 ＭｏＣＭＲ１ 基因的表
达ꎮ 结合 ＭｏＣＭＲ１ 启动子序列中并不存在 Ｍｏ￣
ＣＯＳ１的保守结合序列 Ａ４ＧＡ３ꎬ推测ＭｏＣＯＳ１可能
不是直接与 ＭｏＣＭＲ１ 的启动子区结合ꎬ而是间接
调控 ＭｏＣＭＲ１的表达ꎮ
Ｆｉｇ. ５ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭｏＣＭＲ１ ａｎｄ ＭｏＣＯＳ１
Ｉｎ ＭｏＣＯＳ１ ｍｕｔａｎｔ (Ｍ２９４２)ꎬ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭｏＣ￣
ＭＲ１ ｗａｓ ｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ( ｌｏｇ２ ｒａｔｉｏ(Ｍ２９４２ / Ｙ３４)＝ －３.７８ꎬ
ｗｈｉｌｅ ｉｎ ＭｏＣＭＲ１Δ ꎬ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭｏＣＯＳ１ ｗａｓ
ｎｏｔ ｃｈａｎｇｅｄ( ｌｏｇ２ ｒａｔｉｏ(ＭｏＣＭＲ１Δ / Ｙ３４)＝ ０.２６０) .
２.２.５ ＭｏＣＭＲ１过表达突变体的获得 为了证实
突变体的表型是由于 ＭｏＣＭＲ１ 基因突变所致ꎬ在
ＭｏＣＭＲ１Δ转入过表达 ＭｏＣＭＲ１ 基因ꎬ获得阳性
转化子ꎮ ＭｏＣＭＲ１ 过表达转化子(ＭｏＣＭＲ１￣ＯＥ)
的菌丝形态(图 ３￣Ｃ ＭｏＣＭＲ１￣ＯＥ)、致病性(图 ４
ＭｏＣＭＲ１￣ＯＥ)、黑色素产量(图 ６)基本得到恢复ꎬ
证实了 ＭｏＣＭＲ１的敲除导致黑色素产量减少和致
病性的减弱ꎮ
Ｆｉｇ. ６ Ｍｅｌａｎｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ
Ｓｉｍｉｌａｒ ｍｅｌａｎｉｎ ｗａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｙ３４ ａｎｄ ＭｏＣＭＲ１￣ＯＥꎬ
ｗｈｉｌｅ ｌｅｓｓ ｍｅｌａｎｉｎ ｉｎ ＭｏＣＭＲ１Δ.
３ 讨论
稻瘟病菌黑色素的合成(图 ７)ꎮ ＡＬＢ１、ＲＳＹ１
和 ＢＵＦ１ ３个基因的克隆证明了黑色素对附着胞
功能的重要性[１６]ꎮ 基因 ＡＬＢ１ 编码一种多聚乙酞
合成酶ꎬ催化醋酸盐合成 ４ＨＮꎬ再通过 ＮＡＤＨ 催
化ꎬ生成 ｓｃｙｔａｌｏｎｅꎮ 基因 ＲＳＹ１ 编码 ｓｃｙｔａｌｏｎｅ 脱水
酶ꎬ催化 ｓｃｙｔａｌｏｎｅ 脱水生成 ３ＨＮꎮ 基因 ＢＵＦ１ 编
码一种 ＮＡＤＰＨ 脱氢酶ꎬ催化 ３ＨＮ 生成 ｖｅｒｍｅｌｏ
ｎｅ ꎮＶｅｒｍｅｌｏｎｅ经脱水生成２ＨＮ ꎬ最后合成黑色
Ｆｉｇ. ７ Ｆｕｎｇａｌ ｍｅｌａｎｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ [１８]
４４２
３期 韩秀秀ꎬ等:稻瘟病菌 ＭｏＣＯＳ１基因调控 ＭｏＣＭＲ１基因表达的研究
素[１７]ꎮ ＡＬＢ１、 ＲＳＹ１ 和 ＢＵＦ１ 任何一个基因突变
后ꎬ突变体都产生不含黑色素的附着胞ꎬ失去致病
性[１８]ꎮ
Ｍ２９４２ 在黑色素合成上具有明显的缺陷[７]ꎮ
而黑色素在很多病原性真菌的致病性方面都起到
重要作用ꎮ 在稻瘟病菌中ꎬ黑色素的形成需要
４ＨＮＲ、 ３ＨＮＲ 和 ＳＣＤ 共同的催化作用[１９￣２１]ꎮ
ＲＮＡ￣Ｓｅｑ数据显示 ＭｏＣＭＲ１(ＭＧＧ＿０７２１５.６)也受
到 ＭｏＣＯＳ１ 的下调 ( Ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏ (Ｍ２９４２ / Ｙ３４) ＝
－１.２) [１０]ꎮ 其中 ＭｏＣＭＲ１在黑色素产生过程中正
调控 ３ＨＮＲ 和 ＳＣＤ 的表达[２１]ꎮ 因此 Ｍ２９４２ 和
ＭｏＣＭＲ１Δ都存在黑色素合成缺陷ꎬ但 Ｍ２９４２ 较
明显ꎮ
本研究构建了 ＭｏＣＭＲ１ 敲除突变体ꎬ通过表
型观察ꎬ发现 ＭｏＣＭＲ１突变后ꎬ稻瘟病菌的营养生
长和分生孢子产生基本不受影响ꎬ但菌丝体失去致
病性ꎮ 通过实时定量 ｑＲＴ￣ＰＣＲꎬ证明了 ＭｏＣＯＳ１
正调控 ＭｏＣＭＲ１基因的转录表达ꎮ 但由于本实验
的转录表达分析中提取的 ＲＮＡ 来自稻瘟病菌的
气生菌丝ꎬＲＮＡ￣Ｓｅｑ 所用 ＲＮＡ 来自液体培养菌
丝ꎬ可能所采用菌丝种类不同ꎬ得到的 Ｍ２９４２ 中
ＭｏＣＭＲ１表达变化量也不同ꎮ
本研究证明稻瘟病菌基因 ＭｏＣＭＲ１ 也参与菌
丝黑色素的积累ꎬＭｏＣＯＳ１ 正调控 ＭｏＣＭＲ１ 的表
达ꎬ但两者之间的遗传关系还需要进一步的研究ꎮ
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５４２
植物病理学报 ４４卷
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责任编辑:于金枝
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