全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(5): 473鄄481(2011)
收稿日期: 2010鄄09鄄30; 修回日期: 2011鄄06鄄20
基金项目: 国家自然科学基金项目(30871628;31071666); 国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08009鄄045B); 国家公益性农
业科研专项资助(nyhyzx07鄄050鄄4)
通讯作者: 廖金铃,教授,博士生导师,主要从事植物线虫学研究; E鄄mail:jlliao@scau. edu. cn
共同第一作者: 卓 侃(1979 - ),男,福建福鼎人,助理研究员,博士,主要从事植物线虫学研究; E鄄mail:zhuokan@scau. edu. cn;
迟远丽(1982 - ),女,山东烟台人,硕士,主要从事植物线虫检疫研究; E鄄mail:cylvzdb@163. com。
象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因的克隆
及其 RNAi效应分析
卓 侃1# , 迟远丽1,2# , 扈丽丽1, 罗 梅1, 廖金铃1*
( 1华南农业大学资源环境学院植物线虫研究室, 广州 510642; 2珠海出入境检验检疫局, 珠海 519015)
摘要: 从象耳豆根结线虫中首次克隆了果胶酸裂解酶基因 Me鄄pel鄄1,该基因 cDNA 的开放阅读框(ORF)长 813 bp,编码
270 个氨基酸,具有果胶酸裂解酶第 3 家族的 4 个保守域特征。 ME鄄PEL鄄1 与南方根结线虫的果胶酸裂解酶MI鄄PEL鄄1 和爪
哇根结线虫的果胶酸裂解酶 MJ鄄PEL鄄1 相似性最高,且系统进化树显示 ME鄄PEL鄄1 也与它们最为接近。 利用 RNAi技术对
象耳豆根结线虫 2 龄幼虫的 Me鄄pel鄄1 进行沉默,结果发现 Me鄄pel鄄1 基因被干扰后,象耳豆根结线虫 2 龄幼虫对番茄的侵染
率显著降低。 该结果表明 Me鄄pel鄄1 基因在象耳豆根结线虫侵染寄主的过程中发挥重要作用。
关键词: 象耳豆根结线虫; 果胶酸裂解酶; 克隆; RNA干扰
Cloning and RNA interference analysis of a pectate lyase gene of Meloidogyne
enterolobii摇 ZHUO Kan1#, CHI Yuan鄄li1,2#, HU Li鄄li1, LUO Mei1, LIAO Jin鄄ling1 摇 ( 1Laboratory of Plant
Nematology, College of Natural Resource and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;
2Zhuhai Entry鄄Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhuhai 519015, China)
Abstract: Cloning and characterization of a cDNA encoding pectate lyase from the root鄄knot nematode
Meloidogyne enterolobii is described firstly. The full length cDNA (Me鄄pel鄄1) containing a 813 bp open read鄄
ing frame (ORF) that could be translated into a 270 amino acids polypeptide. The deduced protein including
four conserved regions possesed characteristic of the class 芋 pectate lyases and showed the highest identity
with MI鄄PEL鄄1 from M. incognita and MJ鄄PEL鄄1 from M. javanica. The phylogenetic tree based on the class
芋 pectate lyases also indicated ME鄄PEL鄄1 was the most closest to the two proteins mentioned above. Infection
tests of tomato with secondary juveniles (J2s) of M. enterolobii incubated in dsRNA against Me鄄pel鄄1 resulted
in lower infection efficiency, indicating the importance of the gene for plant penetration.
Key words: Meloidogyne enterolobii; pectate lyase; cloning; RNAi
中图分类号: S432. 45摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)05鄄0473鄄09
摇 摇 象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)寄
主范围广,繁殖率高,毒性大,可寄生携带 Mi 抗性
基因的番茄(Solanum lycopersicum)和辣椒(Capsi鄄
cum frutescens) [1 ~ 3]。 该线虫最早是在我国海南省
儋州市象耳豆(Enterolobium contortisiliquum)树上
发现的一个新种[1]。 近年来调查表明该线虫在我
国南方地区分布较广,且严重危害多种作物,目前
已在豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、葫芦科
(Cucurbitaceae)、竹芋科(Annonaceae)中的 20 多
种经济作物及番石榴 ( Psidium guajava)、莲雾
摇
植物病理学报 41 卷
(Syzygium samarangense)等热带水果上分离到该
线虫[4 ~ 7]。 在国外,象耳豆根结线虫也越来越受到
关注。 2008 年,欧洲首次报道象耳豆根结线虫[2]。
同年,EPPO 报道中国出口欧洲的玫瑰花上截获到
该线虫,EPPO 对该线虫进行风险性评估,认为对
中欧地区作物存在较大威胁[3]。 2009 年,该线虫
在越南首次发现[8]。 更令人关注的是,Xu 等[9]在
2004 年提出玛雅古根结线虫(M. mayaguensis)和
象耳豆根结线虫可能是同种异名。 玛雅古根结线
虫是国际上公认的危害最大的根结线虫之一,可寄
生超过 8 科的植物,在美洲、非洲、欧洲等均有分
布[10 ~ 12]。 近来,玛雅古根结线虫与象耳豆根结线
虫是同种异名已被国际大多数学者承认[13,14]。 可
见,象耳豆根结线虫已成为全球热带、亚热带地区
作物的一个重要病原物。
植物线虫的食道腺分泌蛋白在线虫侵染和寄
生寄主植物的过程中起到很重要的作用[15]。 近年
来,越来越多的植物线虫食道腺细胞表达基因得到
克隆与鉴定,包括果胶酸裂解酶基因在内的一些植
物细胞壁降解酶基因是研究热点之一[16,17]。 果胶
酸裂解酶基因的产物果胶酸裂解酶是许多植物病
原物的重要致病因子,病原物在该酶参与下降解植
物细胞壁以便侵入寄主和定殖[18]。 在植物线虫
中,果胶酸裂解酶基因最早从马铃薯金线虫(Glo鄄
bodera rostochiensis)中分离获得 Pel鄄1[19]。 随后,
果胶酸裂解酶基因先后在一些重要的植物病原线
虫中报道,包括大豆孢囊线虫 (Heterodera gly鄄
cines)的 Hg鄄pel鄄1[20]、爪哇根结线虫(M. javanica)
的 Mj鄄pel鄄1[21]、南方根结线虫 (M. incognita)的
Mi鄄pel鄄1 和 Mi鄄pel鄄2[22]、松材线虫 ( Bursaphelen鄄
chus xylophilus)的 Bx鄄pel鄄1 和 Bx鄄pel鄄2[23]、甜菜孢
囊线虫(H. schachtii)的 Hspel1 和 Hspel2[24]及马
铃薯金线虫的 Gr鄄pel2[25]等。 Doyle 等[21]提出如
果能找到线虫果胶酸裂解酶的抑制子并让其在植
物中表达,就可能使植物产生抗性,从而阻止线虫
入侵,达到防治线虫的目的。 象耳豆根结线虫的寄
生性相关基因尚未见报道。 本研究首次克隆了象
耳豆根结线虫的果胶酸裂解酶基因,并利用 RNAi
技术初步分析了该基因的功能,以期为深入研究象
耳豆根结线虫的分子机制及发展新的防治策略提
供初步信息。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
供试象耳豆根结线虫采自广东番禺辣椒上,经
单卵囊纯化后培养于本实验室的番茄上,番茄品种
为枝添金六号。
1. 2摇 方法
1. 2. 1摇 象耳豆根结线虫 2 龄幼虫的收集摇 将接种
象耳豆根结线虫 2 龄幼虫(J2) 35 d的番茄苗根部
冲洗干净,挑取卵囊室温孵化 3 d 后收集根结线虫
2 龄幼虫,M9 缓冲液清洗后备用。
1. 2. 2摇 象耳豆根结线虫 RNA 的提取及 cDNA 合
成摇 采用 TRIzol法提取象耳豆根结线虫 2 龄幼虫
的 RNA,参照 Invitrogen公司的 TRIzol 襆 Reagent
说明书进行操作。 RNA用 DNase I 37益下处理 30
min以去除残余的 DNA。 用 BD SMART RACE
cDNA Amplication Kit 合成第一链 cDNA,按试剂
盒说明书进行操作,合成的 cDNA 置于 - 80益待
用。
1. 2. 3摇 象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因 Me鄄
pel鄄1 cDNA全长的扩增摇 根据 GenBank 中南方根
结 线 虫 的 果 胶 酸 裂 解 酶 基 因 Mi鄄pel鄄1
(AY515702)和爪哇根结线虫的果胶酸裂解酶基
因 Mj鄄pel鄄1 (AF455757)及其他同源物种果胶酸裂
解酶基因的核苷酸序列,设计一对覆盖开放阅读框
(ORF)的简并引物扩增象耳豆根结线虫的果胶酸
裂解酶基因 cDNA 全长。 其中正向引物为 PelS:
5忆鄄ATGTTKWCAAGCAAAACTAGCTTC鄄3忆,反向
引物为 PelA: 5忆鄄TTARTTCTTTGCGCTCTTTTT鄄
GCT鄄3忆。
PCR反应体系(25 滋L):cDNA 模板 2 滋L;10
´PCR Buffer 2. 5 滋L;dNTP(2. 5 mmol / L)2 滋L;引
物 PelS(10 滋mol / L)和 PelA(10 滋mol / L)各 1 滋L;
Ex Taq (5U / 滋L) 0. 125 滋L;灭菌 ddH2 O 16. 375
滋L。 PCR程序:94益预变性 30 s,94益变性 30 s,
57益退火 30 s,72益延伸 2 min,35 个循环;72益延
伸 10 min。 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR产物切胶回收,连接到 pMD鄄18T 载体,最后
转化克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。
1. 2. 4 摇 序列分析 摇 通过 NCBI 进行同源序列检
索, 用 DNAStar6. 0 进 行 相 似 性 分 析, 采 用
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摇
摇 5 期 摇 摇 卓 侃,等:象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因的克隆及其 RNAi效应分析
DNAMAN进行多序列比对及利用 Mega4. 0 构建
系统发育树。 参考 Nielsen等[26]的方法,利用国际
互联网上的 ProtParam( http: / / www. expasy. org /
tools / )工具对氨基酸序列进行分析。
1. 2. 5摇 RNAi试验摇 象耳豆根结线虫果胶酸裂解
酶基因 Me鄄Pel鄄1 的 RNAi 采用 dsRNA 浸泡方法。
dsRNA 合成采用体外转录的方法,体外转录的模
板 DNA 用含有 T7 启动子的Me鄄Pel鄄1 基因的特异
引物扩增合成。 两对扩增引物分别为 MepeLST7:
5忆鄄GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGCT鄄
TGGAAACGGAAATCAGG鄄3忆和 MepeLA: 5忆鄄TT鄄
GCCACAGGAGCGACAGAA鄄3忆;MepeLS:5忆鄄GCT鄄
TGGAAACGGAAATCAGG鄄3忆 和 MepeLAT7: 5忆鄄
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTTGCCA鄄
CAGGAGCGACAGAA鄄3忆。 PCR反应体系与1. 2. 3
相同,PCR程序为:94益预变性 2 min;94益变性 30
s,58益退火 30 s,72益延伸 1. 5 min,32 个循环;
72益延伸 7 min。 以获得的 PCR产物为模板,利用
T7 转录酶合成单链 RNA后,再经过退火合成 dsR鄄
NA,按照 T7 RiboMAXTM Express RNAi System 说
明书进行操作。 dsRNA用 DNase I 37益下处理 15
min以去除残余的 DNA。
将收集的象耳豆根结线虫 2 龄幼虫置 DEPC
处理的离心管中,对照组、试验组各收集约 20 000
条虫,M9 缓冲液清洗 2 遍后,将水吸干,对照组加
入 45 滋L M9 缓冲液,试验组加入 45 滋L dsRNA(2
滋g / 滋L),25益浸泡 4 h,每隔一段时间轻微摇动离
心管。 浸泡结束后用 M9 缓冲液清洗 2 次。
1. 2. 6 摇 RT鄄PCR 检测分析 摇 分别提取经 dsRNA
浸泡和未经 dsRNA浸泡的象耳豆根结线虫 2 龄幼
虫的 RNA,然后反转录成 cDNA 并平衡两者 cD鄄
NA的浓度。 以平衡后的 cDNA 为模板,设计引物
扩增象耳豆根结线虫的 actin基因作为 RT鄄PCR的
内参,引物分别为 MeactinF1:5忆鄄GTCATGGTCGG鄄
TATGGGACAGA鄄3忆和 MeactinFR:5忆鄄CTTGCTTG鄄
GAGATCCACATCTGTTGGAAG鄄3忆。 以引物 Me鄄
peLS和 MepeLA扩增靶标基因 Me鄄pel鄄1。 PCR反
应体系与 1. 2. 3 相同。 PCR 程序为:94益预变性
30 s,94益变性 30 s,58益退火 30 s,72益延伸 1. 5
min,28 个循环;72益延伸 7 min。 反应结束后用
1%琼脂糖凝胶电泳检测,测定两者 Me鄄pel鄄1 的
mRNA表达量差异。
1. 2. 7摇 RNAi后线虫的表型观察及侵染力检测摇
将经 RNA 干扰和未经 RNA 干扰的象耳豆根结线
虫 2 龄幼虫用 M9 缓冲液清洗后置于清水中,在显
微镜下每隔 15 min观察线虫的形态行为变化及判
断死活。
挑取经 RNA干扰和未经 RNA 干扰的象耳豆
根结线虫 2 龄幼虫活虫 300 条,分别接种于生长
25 d的不含 Mi抗性基因及含 Mi抗性基因的番茄
苗根部,5、15 和 25 d 后取样,每个处理 3 次重复。
将番茄根部用自来水洗净后,采用次氯酸钠鄄酸性
品红染色法[27]在显微镜下观察线虫的侵染情况,
计算侵入番茄根部的虫数,并利用软件 DPS7. 05,
采用 Duncan新复极差法进行差异显著性分析。
2摇 结果
2. 1摇 Me鄄pel鄄1 cDNA 全长的扩增及其预测蛋白
的特征分析
以象耳豆根结线虫 cDNA 一链为模板,用简
并引物 PelS和 PelA扩增获得一约 800 bp 的特异
条带,经测序实际为 813 bp。 将该序列用 blastp 在
GenBank中进行比较,结果与该序列具有较高相似
性的为南方根结线虫和爪哇根结线虫的果胶酸裂
解酶基因,表明该序列是所需要的象耳豆根结线虫
的果胶酸裂解酶基因序列,命名为 Me鄄pel鄄1(Gen鄄
Bank登录号:HQ180169)。 在 NCBI的 ORF finder
进行 ORF识别,Me鄄pel鄄1 包含一个完整的 ORF,起
始密码子为 ATG,终止密码子为 TAA,编码 270 个
氨基酸。 根据 signal P 3. 0 Server 程序推测 ME鄄
PEL鄄1 的信号肽最可能的剪切位点位于第 22 - 23
个氨基酸之间,该氨基酸的理论分子量大小约为
29. 9 kDa,理论等电点(PI)是 6. 30。
2. 2摇 基因相似性比对
利用 DNAStar 进行序列相似性比对,结果表
明 ME鄄PEL鄄1 与南方根结线虫果胶酸裂解酶
MI鄄PEL鄄1 ( GenBank 登 录 号: AAS88579 和
AAQ09004)和爪哇根结线虫果胶酸裂解酶 MJ鄄
PEL鄄1(GenBank登录号:AAL66022)相似性最高,
相似性分别为 84. 1% 、83. 7%和 82. 6% ,而与南方
根结线虫另 2 个果胶酸裂解酶 MI鄄PEL鄄2 和 MI鄄
PEL鄄3 相似性只有 20. 7%和 21. 5% 。 ME鄄PEL鄄1
与其他植物线虫的果胶酸裂解酶相似性相对较低,
与孢囊属(Heterodera)线虫的果胶酸裂解酶相似
性在 16. 7% ~ 30. 6% ,与球孢囊属(Globodera)线
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摇
植物病理学报 41 卷
虫的果胶酸裂解酶相似性在 16. 1% ~ 35. 9% ,与
滑刃科线虫的果胶酸裂解酶相似性在 30. 6% ~
37. 3% 。 ME鄄PEL鄄1 与一些微生物,尤其是链霉菌
(Streptomyces)果胶酸裂解酶的相似性高于与一些
线虫果胶酸裂解酶的相似性,如与加纳链霉菌
(S. ghanaensis)、S. thermocarboxydus 和变铅青链
霉菌(S. lividans)的果胶酸裂解酶(GenBank 登录
号:ZP_04689686、BAH85845、ZP_05527732)相似
性分别为 41. 5% 、39. 0%和 38. 7% 。
ME鄄PEL鄄1 与其余 7 个植物线虫、1 个细菌及
1 个真菌的果胶酸裂解酶的多序列比对结果见图
1。 从图 1 可见,ME鄄PEL鄄1 具有 4 个保守特征区
域,14 个半胱氨酸残基,催化域含有 4 个带电荷
残基。
Fig. 1摇 Multiple sequence alignment of Meloidogyne enterolobii pectate lyase 1
(ME鄄PEL鄄1, HQ180169) protein sequences with the sequences of pectate lyases
from other plant鄄parasitic nematodes, a bacterium and a fungi
MI鄄PEL鄄1 (AAQ09004) and MI鄄PEL鄄2 (AAQ97032) from M. incognita; MJ鄄PEL鄄1 (AAL66022) from M. javanica; HS鄄
PEL鄄1 ( ABN14272 ) from Heterodera schachtii; GR鄄PEL鄄1 ( AAF80746 ) from Globodera rostochiensis; HG鄄PEL鄄1
(AAK08974) from H. glycines; BX鄄PEL鄄1 (BAE48371) from Bursaphelenchus xylophilus; SG鄄PEL (ZP_04689686) from
Streptomyces ghanaensis ; FO 鄄 PEL ( AAC 6 4 3 6 8 ) from Fusarium oxysporum . The putative signal sequence of M . enterolobii
ME鄄PEL鄄1 protein is boxed. Black bars (玉鄄郁) indicate the conserved regions characteristic of Class 芋 pectate lyases.
Identical residues are highlighted in black, highly conserved are in gray. Very highly conserved charged residues are
indicated by an asterisk (翌), while a triangular symbol (吟) indicates conserved cysteine residues.
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摇
摇 5 期 摇 摇 卓 侃,等:象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因的克隆及其 RNAi效应分析
2. 3摇 系统发育分析
从 GenBank 中选取来自植物线虫、真菌和细
菌且与 ME鄄PEL鄄1 有同源性的第 3 家族果胶酸裂
解酶基因的氨基酸序列,利用Mega 4. 0 软件,通过
UPGMA法计算 1 000 次获得分子进化树(图 2)。
该分子进化树表明来自植物线虫的第 3 家族果胶
酸裂解酶并没有位于同一个进化分支,而是形成了
4个进化分支(即图2中的NEM1 、NEM2 、NEM3
Fig. 2摇 Phylogenetic analysis of pectate lyases from nematode,
fungal or bacterial origin using UPGMA methods
NEM1, NEM2, NEM3 and NEM4 represent nematodes; BAC1, BAC2 and BAC3 represent bacteria;
FUN1 represent fungi. The numbers in each branch points represent the bootstrap support percentages.
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摇
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和 NEM4)。 NEM1 包括了 3 个滑刃科线虫种的果
胶酸裂解酶,该分支与一些来自细菌的果胶酸裂解
酶(BAC1)以 96%的置信度聚为一支。 NEM2 包
含了球孢囊和孢囊线虫的几个果胶酸裂解酶,该分
支以 83%的置信度和 NEM1 及 BAC1 聚为一支。
本研究所获得的 ME鄄PEL鄄1 与南方根结线虫的果
胶酸裂解酶 MI鄄PEL鄄1 及爪哇根结线虫的果胶酸
裂解酶 MJ鄄PEL鄄1 位于同一分支(NEM3),该分支
与 NEM1、BAC1、NEM2 及真菌的果胶酸裂解酶
(FUN1)聚为一支。 NEM4 包含了南方根结线虫
的 2 个果胶酸裂解酶 MI鄄PEL鄄2 和 MI鄄PEL鄄3 及几
个球孢囊和孢囊线虫的果胶酸裂解酶,该分支则与
另一些来自细菌的果胶酸裂解酶 (BAC2)更为
接近。
2. 4摇 RT鄄PCR对Me鄄pel鄄1 基因的沉默效率检测
利用引物 MepeLST7 / MepeLA、MepeLS / Me鄄
peLAT7 及 T7 转录酶分别合成正义链和反义链的
单链 RNA 后,再经过退火合成 342 bp 的 dsRNA
片段。 提取经 dsRNA浸泡及未经浸泡的象耳豆根
结线虫 2 龄幼虫的 RNA,反转录为 cDNA,以平衡
后的 cDNA为模板,用引物 MepeLA和 MepeLS进
行 Me鄄pel鄄1 基因的扩增,获得一约 350 bp的产物,
经测序后为 342 bp,与目的基因进行比对,相似性
为 100% ;同时用 MeactinF1 和 MeactinFR 进行内
参基因 actin 的扩增,获得一 955 bp 的 actin 基因
片段。
RT鄄PCR电泳结果显示,在最佳循环数和最佳
退火温度的相同条件下,actin 基因表达量一致,而
Me鄄pel鄄1 基因在对照组中条带清晰、明显,而在试
验组中条带亮度明显减弱(图 3),说明用 dsRNA
浸泡象耳豆根结线虫后,Me鄄pel鄄1 基因的表达量明
显下降,但没有完全抑制。
2. 5摇 Me鄄pel鄄1 的 RNAi效应分析
象耳豆根结线虫 2 龄幼虫 dsRNA 浸泡 4 h
后,用 M9 缓冲液清洗干净,然后浸泡在灭菌双蒸
水中,观察其表型变化情况。 浸泡结束后象耳豆根
结线虫呈现僵直状态,15 min 后,线虫出现抽搐现
象,30 min后全部恢复正常活动。
将经 dsRNA 浸泡和未经 dsRNA 浸泡的 2 龄
幼虫分别接种到生长 25 d 的不含 Mi 抗性基因和
含 Mi抗性基因的番茄苗根部。 结果显示:5 d 后
侵入不含 Mi 抗性基因番茄苗根部的试验组线虫
数平均比对照组减少了 78. 3% ,15 d 后减少了
28郾 0% ,25 d后减少了 22. 0% (表 1)。 而 5 d后侵
入含 Mi 抗性基因番茄苗根部的试验组线虫数平
均比对照组减少了 52. 1% ,15 d后减少了 55. 0% ,
25 d后减少了 41. 5% (表 2)。
Fig. 3 摇 RT鄄PCR assay for expression level of
Me鄄pel鄄1 gene in Meloidogyne ente鄄
rolobii after soaking in target dsRNA
solution
A: M. enterolobii with non鄄dsRNA treatment; B: B. xylo鄄
philus with target dsRNA treatment; Lane M: DL2000 DNA
marker; Lane 1: actin; Lane 2: Me鄄pel鄄1.
Table 1摇 Numbers of Meloidogyne enterolobii in root tissue of tomato without Mi after inoculation
with J2s soaked in dsRNA against Me鄄pel鄄1 and in M9 buffer at different times
Day after inoculation / d Number of treatment Number of untreatment
5 2. 8 依 0. 4 a 12. 8 依 0. 6 b
15 138. 3 依 3. 1 a 192. 0 依 1. 9 b
25 216. 3 依 2. 8 a 277. 1 依 3. 0 b
Data (mean 依 Se) are from three experiments. The data in the same row followed by different letters are significantly dif鄄
ferent at 0. 05 levels.
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摇
摇 5 期 摇 摇 卓 侃,等:象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因的克隆及其 RNAi效应分析
Table 2摇 Numbers of Meloidogyne enterolobii in root tissue of tomato with
Mi after inoculation with J2s soaked in dsRNA against Me鄄pel鄄1 and
in M9 buffer at different times
Day after inoculation / d Number of treatment Number of untreatment
5 11. 3 依 1. 8 a 23. 7 依 1. 2 b
15 22. 7 依 2. 2 a 50. 3 依 4. 9 b
25 45. 7 依 4. 8 a 78. 0 依 4. 6 b
Data (mean 依 Se) are from three experiments. The data in the same row followed by different letters are significantly
different at 0. 05 levels.
3摇 讨论
本研究克隆了象耳豆根结线虫的一个果胶酸
裂解酶基因,这是首次报道象耳豆根结线虫的寄
生性相关基因。 该基因的氨基酸序列具有 4 个
保守特征区域和 14 个半胱氨酸残基,符合第 3 家
族果胶酸裂解酶的特征[19,28] ,因此 ME鄄PEL鄄1 属
于第 3 家族果胶酸裂解酶。 将 ME鄄PEL鄄1 与来自
其他物种,包括植物线虫、细菌和真菌的第 3 家
族果胶酸裂解酶进行系统进化树构建,该进化树
显示来自植物线虫的果胶酸裂解酶并没有聚成
一个进化分支,它们彼此之间被一些细菌和真菌
的果胶酸裂解酶分开,形成了 4 个独立的进化分
支。 例如,滑刃科线虫的果胶酸裂解酶与链霉菌
等一些细菌的果胶酸裂解酶以很高的置信度聚
为一支。 一些研究认为植物线虫的果胶酸裂解
酶基因可能是通过水平基因转移从细菌或真菌
当中获得的[24,29] ,这一观点在本研究中得到验
证。
在根结线虫中,果胶酸裂解酶基因已经在爪
哇根结线虫和南方根结线虫中报道,其中在南方
根结线虫中报道了 3 个果胶酸裂解酶基因,通常
认为这些基因的产物果胶酸裂解酶在根结线虫
侵染植物的过程中被线虫分泌出来,参与降解植
物细胞壁的果胶基质以方便线虫在寄主细胞间
的迁移[21,22] 。 ME鄄PEL鄄1 与南方根结线虫的 MI鄄
PEL鄄1 和爪哇根结线虫的 MJ鄄PEL鄄1 相似性高达
82%以上,在进化树中也与这 2 个基因最为接
近,且该基因同样具有信号肽,表明该基因可能
与 MI鄄PEL鄄1 和 MJ鄄PEL鄄1 具有类似的功能,在象
耳豆根结线虫侵染植物的过程中可能起到降解
植物细胞壁果胶基质的作用。 本研究同时利用
RNAi技术对象耳豆根结线虫 2 龄幼虫的 Me鄄pel鄄
1 基因进行沉默,结果发现 Me鄄pel鄄1 基因被干扰
后,象耳豆根结线虫 2 龄幼虫对含 Mi 抗性基因
及不含 Mi 抗性基因的番茄的侵染率均显著降
低,该结果进一步表明 Me鄄pel鄄1 基因在象耳豆根
结线虫侵染植物的过程中发挥重要作用。 象耳
豆根结线虫可以侵染含 Mi 抗性基因的番茄和辣
椒[1 ~ 3] ,Me鄄pel鄄1 基因是否与象耳豆根结线虫克
服 Mi抗性基因相关或象耳豆根结线虫中是否存
在其他的果胶酸裂解酶基因有待进一步的研究。
参考文献
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n. sp. ( Meloidogynidae ), a root鄄knot nematode
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