全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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,/001,#"""*&"!$,!"#$,"%,"&!
收稿日期$
!"#&*")*")
&修改稿收到日期$
!"#&*##*!+
基金项目$国家十二五(支撑项目"
!"#!234!#2"!"#*"+
#
作者简介$齐凤慧"
#)-(
#!女!博士!副教授!主要从事植物基因工程及植物细胞工程的研究)
5*67/8
$
9
/:;1
<
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!
#!-,?@6
"
通信作者$詹亚光!博士!教授!博士生导师!主要从事植物基因工程*林木育种等方面的研究)
5*67/8
$
A
7
<
>71
<
B=71
!
#!-,?@6
$%&%%(
标记在水曲柳雌雄鉴定中的应用
齐凤慧#!孙宏冉#!詹亚光#!"
"
#
东北林业大学 生命科学学院!哈尔滨
#$""&"
&
!
东北林业大学 林木遗传育种国家重点实验室!哈尔滨
#$""&"
#
摘
!
要$选用黑龙江省青山林木种子园成年水曲柳
!""
棵树为实验材料!在来自
CD2E
中的
$&!%
条白蜡属
5FG
序
列和该实验室测得的水曲柳转录组的
#)$"!
条序列中查找
FFH
位点并设计引物!通过
IDH
扩增筛选有效扩增和
有差异片段的引物!用于水曲柳雌雄的鉴别)结果显示$"
#
#白蜡属
5FG
和水曲柳转录组中的
$&!%
条和
#)$"!
条序列中!分别查找到
)&++
个和
%$$
个
FFH
位点!
FFH
出现的频率分别是
#&,)-J
和
#,)+J
!
FFH
的类型都是
以二核苷酸为主)"
!
#
!%!
对引物中有
!"+
对引物获得有效扩增!
&
对引物在雌雄
4C3
中有差异!

对扩增片段
符合预定大小片段)"
%
#经过
%
轮筛选!选出
#)
号和
$-
号引物用于
!""
棵水曲柳中!雌雄差异率分别是
-&,$J
和
+),$J
)研究表明!利用
5FG*FFH
分子标记对水曲柳性别进行鉴定是一种有效可行的方法)
关键词$水曲柳&表达序列标签&简单重复序列&重复基元&雌雄鉴别
中图分类号$
K+)
文献标志码$
3
)
**
+#,-.#"/"0$%&%%(1-23425#/.64%47
8!4/.#0#,-.#"/"01($2-/345$/.463(-"$(9
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A
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A
@:GO;;W;1;S/?071X
2O;;X/1
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A
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A
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IO@T/1?;S@0?O;;1
Z
O/6;O0Y=/?=?71O;0>8S/1X/::;O;1SIDH
Z
O@X>?S0U;SY;;1678;71X:;678;70=,IDH
Z
O/6;O0Y;O;X;0/
<
1;XU70;X@1S=;FFH0/S;0@:$&!%5FG0@:LO7[/1>0:O@6CD2E71X#)$"!0;
9
>;1?;0
@:!-)#&*(+"%,#SO710?O/
Z
S@6;:O@6@>O87U,G=;O;0>8S00=@Y;XS=7S
$"
#
#
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"
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9
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A
!
O;
Z
;?S/T;8
A
#
Y;O;:@>1X/15FG0:O@6CD2E71XSO710?O/
Z
S@6;
:O@6@>O87U
!
O;0
Z
;?S/T;8
A
!
Y/S=7X@6/171?
A
@:X/1>?8;@S/X;O;
Z
;7S/1FFHS
AZ
;
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#
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Z
7/O0@:
Z
O/6;O
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Z
O@X>?S0
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Z
O@X>?S0U;SY;;1678;71X:;678;71X!@:Y=/?=
<
@S
Z
O@X>?S0Y/S=;[
Z
;?S;X0/B;
&"
%
#
3:S;O%O@>1X0@:IDH0
!
Z
O/6;O#)71X$-
<
@SX/::;O;1S
Z
O@X>?S0U;SY;;1
SY@0;[;0/1-&J71X+),$JSO;;0
!
O;0
Z
;?S/T;8
A
,G=;0;O;0>8S0/1X/?7S;XS=7S5FG*FFH/07:;70/U8;6;S=@X
S@/X;1S/S
A
S=;0;[@:!-)#&*(+"%,#,
<4
=
>"2!5
$
!"#$%&()#&*(+"%,#H>
Z
O,
&
5FG
&
FFH
&
O;
Z
;7S6@S/:
&
0;[/X;1S/:/?7S/@1
!!
随着
4C3
测序技术的快速发展和公共数据库
开放!为
FFH
"
0/6
Z
8;0;
9
>;1?;O;
Z
;7S
!
FFH
#标记开
发提供了新途径)在公共数据库中可快速获得各种
动植物*不同组织*不同发育阶段的基因表达序列标
签"
;[
Z
O;00;X0;
9
>;1?;S7
<
0
!
5FG
#!这些
5FG
序列
不仅在新基因挖掘中发挥了重要作用!而且为
FFH
标记的开发提供了一个巨大*有价值的来源+#*!,)
FFH
是微卫星标记!又称简单重复序列!是由
#
"
-
个核苷酸为重复单位组成串联重复序列!
FFH
含量丰富且遍布整个基因组)而
5FG*FFH
标记是
建立在表达序列标签上的一种新型的分子标记技
术!并与功能基因直接相关+%,)
5FG*FFH
除了具有
基因组
FFH
的优点外!它反映的是转录区的差异!
其多态性可能与基因功能直接相关+&,)而且由于
5FG*FFH
来源于表达的基因组区域+$,!可直接反映
相关基因的多样性!同时它在不同物种间有良好的
通用性+-,!从一种物种开发的
FFH
标记可用于其他
物种的研究)目前!
5FG*FFH
除了在农作物小麦
"
."%/%,)#0(/%1)
#
+

,
*苜蓿"
20*%,#
3
4(#/%1#
#
+,
*
葡萄"
5%/%(1%&%
6
0"#
#
+
)
,
*水稻"
7"
8
9#(#/%1#
#
+
#"
,等
中应用外!在树木中也得到广泛应用!如杏"
:"&(
#")0&%#,#
#
+
##
,
*猕猴桃"
;,/%&%*%#,+%&0&(%(
#
+
#!
,
*云
杉"
:%,0##(
<
0"#/#
#
+
#%
,
*火炬松"
:%&(/#0*#
#
+
#&
,
*
白桦"
=0/>#
<
>#/
8<
+
8
>>#
#
+
#$
,
*杨树"
:4
<
>(
#
+
#-
,
*
茶树"
?#)0>>%#(%&0&(%(
#
+
#
,
*桉树"
@,#>
8<
/(
#
+
#+
,
*
橡胶树"
A010#B"#(%>%0&(%(
#
+
#)
,等物种)
水曲柳"
!"#$%&()#&*(+"%,#H>
Z
O,
#以材质
优良而著称!是珍贵的用材树种!可制各种家具*乐
器*体育器具*车船*机械及特种建筑材料)其稀有
珍贵的特性不仅在物种多样性*生态多样性的研究
上具有重要意义!而且在维持生态功能上以及生产
实践中所表现的经济价值也是不可替代的)国务院
于
#)))
年
+
月
&
日批准的-国家重点保护野生植物
名录."第一批#将水曲柳列为二级保护植物+!"*!#,)
水曲柳雌雄异株!幼苗期无法辨别雌雄!只有生
长到
#"
"
#!
年开花后才能辨别雌雄+!!,!这给育苗*
造林以及种子园的建立带来极大不便)目前对于水
曲柳雌雄差异的研究比较少!而在其它植物中的研
究表明雌雄株之间的基因表达存在一定差异!因此!
为从基因方面揭示水曲柳雌雄差异!我们利用
5FG*
FFH
技术对水曲柳雌雄株进行分析!初步建立水曲
柳雌雄株的鉴别方法!为水曲柳育种及种子园的建
立提供技术支持)
#
!
材料和方法
?,?
!
材
!
料
?,?,?
!
实验材料
!
研究材料主要来自黑龙江省尚
志市苇河林业局青山林木种子园"
#)+)
建成#!选择
雌雄株各
#""
棵!取其叶片!
(+"保存)
?:?:@
!
$%&
序列来源
!
实验中水曲柳
5FG
序列来
源$"
#
#来自
CD2E
"
=SS
Z
$%%
YYY,1?U/,186,1/=,
<
@T
%#
XU5FG
数据库"
=SS
Z
$%%
YYY,1?U/,1/=,
<
@T
%
UX5FG
%
/1X;[,=;68
#中白腊属"
!"#$%&(
#的
5FG
序列&"
!
#本
实验室在华大基因测得的水曲柳转录组)
?,@
!
方
!
法
?:@:?
!
水曲柳
%%(5
位点的搜索
!
将获得的
5FG
序列进行冗余性查找"
=SS
Z
$%%
YYY,1?U/,186,1/=,
<
@T
%
T;?F?O;;1
#!去除
5FG
序列中的载体序列)然后
对于
CD2E
数据库中的
5FG
序列利用在线软件
FF*
HEG
"
F/6
Z
8;F;
9
>;1?;H;
Z
;7SEX;1S/:/?7S/@1G@@8
#"
=S*
S
Z
$%%
YYY,
<
O76;1;,@O
<
%
XU
%
67O];O0
%
00OS@@8
#进行搜
索!搜索条件为
%
次重复以上!选取二*三*四*五*六
核苷酸
$
种类型的
FFH0
&对于转录组序列!搜索条
件是
$
次重复以上!选取二*三*四*五*六核苷酸
$
种类型的
FFH0
进行分析)根据公式$
FFH
频率
^
FFH
数量
_
序列总数计算
FFH
频率)
?:@:@
!
%%(5
引物的设计
!
利用
Z
O/6;O$,"
软件设
计引物)来自
CD2E
数据库中的
5FG
序列!共得到
#"$
对
5FG*FFH
引物&来自水曲柳转录组中的序
列!共设计
#-+
对引物!随机合成
#!
对)引物由
上海生工生物工程有限公司合成!共合成
!%!
对)
?:@:A
!
水曲柳
BC)
的提取*检测及
BC)
样品池建
立
!
用改良的
DG32
法分别提取成年水曲柳雌雄
各
#""
株叶片
4C3
)分别用琼脂糖凝胶电泳和紫
外分光光度计检测
4C3
质量及浓度!根据检测结
果!用
XXN
!
`
将
4C3
浓度调整为同一浓度)随机
选择雌雄
4C3
各
$"
个!各取
#
#
R
分别混合成水
曲柳雌雄
4C3
样品池)
?:@:D
!
水曲柳
%%(
扩增及引物筛选
!
以水曲柳雌
雄
4C3
样品池为模板!对合成的
!%!
对
FFH
引物
进行筛选)参考不同引物的
G6
值!采用梯度
IDH
仪进行扩增!退火温度筛选时在"
G6($#
"
"
G6
(%#之间设置
%
个温度梯度!
FFH
扩增体系"
!"
#
R
#为$
#"aU>::;O!,"
#
R
&
XCGI0#,-
#
R
&
4C3
模
板"
!"
#
<
%
#
R
#
!,"
#
R
&
O.#
C
",!
#
R
&引物
#
"
#"
#
6@8
%
R
#
#
#
R
&引物
!
"
#"
#
6@8
%
R
#
#
#
R
&
XXN
!
`
#!,!
#
R
+
!%
,
)扩增产物用
#!J
的聚丙烯酰胺凝胶检
测!参照韩永亮+!&,的电泳和银染方法)
!
!
结果与分析
@:?
!
水曲柳
%%(5
出现频率*类型及分布比例
从来自白蜡属
5FG
和水曲柳转录组中的
$&!%
%&
%
期
!!!!!!!!!!!!!!
齐凤慧!等$
5FG*FFH
标记在水曲柳雌雄鉴定中的应用
条和
#)$"!
条序列中!分别查找到
)&++
个和
%$$
个
FFH
位点!共
#%"&$
个)
FFH
出现的频率
分别是
#&,)-J
和
#,)+J
!平均
",%!]U
和
#%,+
]U
出现一个
FFH
!长度
#
#"U
Z
的
FFH
出现频率分
别是
%,&#J
和
#,)+J
)白蜡属
5FG
中
FFH
出现
频率比水曲柳转录组序列中出现的频率高"表
#
#)
表
!
显示!全部的
5FG*FFH
包括
!
"
-
个核苷
酸重复单元!其中二核苷酸重复所占比例最大约
-+,+%J
"
+))
次#&其次是三核苷酸占总
FFH
的
!+,-)J
"
%&%
次#&五核苷酸的重复出现的比较少
只有
&-
个!占总
FFH
的
",%$J
&通过对两个数据库
FFH
位点的比较发现白蜡属
5FG
数据库
FFH
中二
核苷酸和四核苷酸所占的比例比水曲柳转录组的
高!分别多
#&,+!J
和
",!$J
&而水曲柳转录组
FFH
的三*五和六核苷酸所占的比例比白蜡属
5FG
数据
库的高!分别多
#%,J
*
",!)J
和
#,"J
"表
!
#)
@:@
!
水曲柳
$%&%%(
中重复基元的分布特征
@:@:?
!
白蜡属中
$%&%%(
的特性
!
在来源于白蜡
属
5FG*FFH
序列中!共观察到
#%#
种重复基元"考
虑碱基互补的前提下#)其中二核苷酸重复基元有
&
种!三*四*五和六核苷酸重复基元分别有
#+
*
&&
*
表
?
!
%%(
出现频率
G7U8;#
!
LO;
9
>;1?
A
@:FFH
项目
ES;6
白蜡属
5FG
5FG@:
!"#$%&(
水曲柳转录组
GO710?O/
Z
S@6;@:
!-)#&*(+"%,#
FFH
总数
G@S781>6U;O@:FFH )&++ %$$
FFH
的相对频率
H;87S/T;:O;
9
>;1?
A
@:FFH
%
J
#&,)- #,)+
长度
#
#"U
Z
FFH
数
C@,@:FFHY/S=8;1
<
S=
#
#"U
Z
%
J
#+$ %$$
长度
#
#"U
Z
FFH
相对频率
H;87S/T;:O;
9
>;1?
A
@:FFHY/S=8;1
<
S=
#
#"U
Z
%
J
%,&# #,)+
!"
和
&$
种)二核苷酸基元"
3W
%
DG
#
1
出现的最多
"
%&$+
次#!占二核苷酸重复的
$","#J
!其次分别
是"
3D
%
WG
#
1
"
!&,&J
#和"
3G
%
3G
#
1
"
!&,!%J
#!
"
DW
%
DW
#
1
出现的较少"
+)
次#"
#,!)J
#)三核苷
酸基元中"
33W
%
GGD
#
1
出现最多"
&)#
次#!占三核
苷酸重复的
!",%J
!"
3DD
%
WWG
#
1
和"
3WW
%
DDG
#
1
出现的频率也较高!分别占三核苷酸重复的
),!)J
"
!!"
次#和
-,&-J
"
#$%
次#)四核苷酸基元
中"
333G
%
GGG3
#
1
出现的最多!占四核苷酸基元
的
#-,#$J
"
!#
次#!其次是"
333W
%
GGGD
#
1
和
"
33G3
%
G3GG
#
1
!分别占四核苷酸重复的
#!,%#J
"
#-
次#和
,-)J
"
#"
次#)五核苷酸重复基元出现
的频率比较低只有
!-
个)搜索结果得到
$"
个六核
苷酸基元!出现最多的是"
33333G
%
3GGGGG
#
1
"
&
次#)
总之!白蜡属
5FG*FFH
以二核苷酸为主导!
"
3W
%
DG
#
1
出现的最多!占总
FFH
的
%-,&$J
&其
次分别是 "
3D
%
WG
#
1
"
#,+%J
#和 "
3G
%
3G
#
1
"
#,-$J
#!而三*四*五和六核苷酸在总
FFH
中所
占比例都很小)
@:@:@
!
水曲柳转录组中
$%&%%(
的特性
!
在来源
于水曲柳转录组的
FFH
序列中!共观察到
#"!
种重
复基元"考虑碱基互补的前提下#"图
#
#)其中二核
苷酸重复基元有
&
种!三*四*五和六核苷酸重复基
元分别有
#"
*
#%
*
#+
和
$
种)二核苷酸基元"
3W
%
DG
#
1
出现最多"
#$$&
次#!占二核苷酸重复的
$,!$J
!其次分别是"
3D
%
WG
#
1
"
#-,#J
#和"
3G
%
3G
#
1
"
,$#J
#!"
DW
%
DW
#
1
出现较少"
##
次#
"
,$%J
#)三核苷酸基元中"
33W
%
DGG
#
1
出现最
多"
&#!
次#!占三核苷酸重复的
!),)-J
!"
3DD
%
WWG
#
1
和"
3WD
%
DGW
#
1
出现的频率也较高!分别
表
@
!
水曲柳
%%(5
类型及分布比例
G7U8;!
!
H;
Z
;7SS
AZ
;071X
Z
;O?;1S7
<
;@:FFH0@:!-)#&*(+"%,#
重复类型
H;
Z
;7SS
AZ
;
来源
F@>O?;
数量
D@>1S
占各自数据库
FFH
的比例
IO@
Z
@OS/@1U
A
;7?=0@>O?;
%
J
重复类型总数
G@S78C@,
占总
FFH
比例
IO@
Z
@OS/@1U
A
S@S78FFH
%
J
二核苷酸
GY@1S0
5FG0:O@6CD2E
GO710?O/
Z
S@6;@:!-)#&*(+"%,#
-)#&
!"-$
!,+
$+,"$
+)) -+,+%
三核苷酸
G=O;;1S0
5FG0:O@6CD2E
GO710?O/
Z
S@6;@:!-)#&*(+"%,#
!%-+
#%$
!&,)-
%+,--
%&% !+,-)
四核苷酸
L@>O1S0
5FG0:O@6CD2E
GO710?O/
Z
S@6;@:!-)#&*(+"%,#
#%"
&"
#,%
#,#!
#" #,%"
五核苷酸
L/T;1S0
5FG0:O@6CD2E
GO710?O/
Z
S@6;@:!-)#&*(+"%,#
!-
!"
",!
",$-
&- ",%$
六核苷酸
F/[1S0
5FG0:O@6CD2E
GO710?O/
Z
S@6;@:!-)#&*(+"%,#
$"
$
",$%
#,-"
#" ",+!
总数
G@S78 #%"&$
&&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
占三核苷酸重复的
#),#J
"
!#
次#和
##,-&J
"
#-"
次#)四*五和六核苷酸出现的都比较少!但是
六核苷酸类型丰富)
通过以上分析可知!两种序列来源中
5FG*FFH
的特性相同!出现的
FFH
位点较多*类型丰富!都是
以二核苷酸为主导!三*四*五和六核苷酸在总
FFH
中所占比例都很小)二核苷酸基元"
3W
%
DG
#
1
出
现的最多"
$"#!
次#!占总
FFH
的
%+,&!J
!其次分
别是"
3D
%
WG
#
1
"
!"%
次#和"
3G
%
3G
#
1
"
#+%"
次#)三核苷酸基元中!"
33W
%
DGG
#
1
出现最多
"
)"%
次#!占 总
FFH
的
-,)!J
)四 核 苷 酸 中
"
333G
%
3GGG
#
1
出现的最多!占总
FFH
的
",!%J
)
五核苷酸"
3333W
%
GGGGD
#
1
出现的最多!占总
FFH
的
",")J
)六核苷酸出现的次数不多!但类型
丰富"图
#
#)
@:A
!
水曲柳
$%&%%(
引物筛选及应用
@:A:?
!
水曲柳
BC)
提取与检测
!
采用
DG32
法
提取水曲柳叶片中的
4C3
!用
H170;3
消化后在
#,"J
琼脂糖凝胶中电泳检测其完整性!从图
!
中可
看出
4C3
条带清晰!点样孔也较干净!没有大分子
物质的干扰)之后用紫外分光光度计检测其浓度!
各样品
3
!-"
%
3
!+"
均约等于
#,+
!符合实验要求)
@:A:@
!
$%&%%(
引物第一轮筛选
!
分别以水曲柳
雌*雄
4C3
样品池为模板!对设计的
!%!
对
FFH
引
物进行
IDH
扩增!结果显示
!"+
"
+),--J
#对引物
获得有效扩增!其中
#$+
对"
-+,#"J
#引物在雌雄
4C3
中无差异!有
!"
对引物扩增的片段不在目的
片段范围内&
&
对"
%#,)"J
#引物在雌雄
4C3
中有
差异!有
!
对引物扩增的片段符合预定大小的目的
条带)在
!
种来源的引物中!来自白蜡属的引物有
&
对在水曲柳雌雄
4C3
中有差异!其中有
!%
对的
雌雄差异片段符合预定大小的目的条带!有
!"
对雌
雄 差异片段小于目的片段长度"表
%
#&来自水曲柳
转录组的
#!
对引物中!有
!
对在水曲柳雌雄
4C3
中有差异!其中有
&
对引物的雌雄差异片段符
合预定大小的目的条带!有

对引物的雌雄差异条
带小于目的片段!有
#-
对引物的雌雄差异片段大于
目的条带"表
&
#)在雌雄有差异片段的
&
对引物
中有
%"
对引物能在雌树的
4C3
中扩增出片段!不
能在雄树
4C3
中扩增出段&有
&&
对引物在雌树的
4C3
中不能扩增出片段!在雄树
4C3
中能扩增出
片段)在图
%
!
3
中箭头所示!
#
号引物"
%
*
&
泳道#
和
!"
号引物"
)
*
#"
泳道#在雌雄
4C3
中均能扩增
出预定大小的目的条带!
%
号引物"

*
+
泳道#在雌
雄中扩增出条带小于目的片段)在图
%
!
2
中箭头
图
#
!
水曲柳
FFH
分布特性
图注上方的数据表示各类核苷酸基元出现的次数
图
#
!
4/0SO/U>S/@1?=7O7?S;O/0S/?0@:FFH/1!-)#&*(+"%,#
4/
<
/S07U@T;S=;?@8>610O;
Z
O;0;1SS=;:O;
9
>;1?/;0
图
!
!
4C3
提取结果
L/
<
,!
!
4C3;8;?SO@
Z
=@0/0
表
A
!
白蜡属
$%&%%(5
引物筛选结果
G7U8;%
!
H;0>8S0@:5FG*FFH0
Z
O/6;O0?O;;1/1
<
/1!"#$%&(
IDH
片段类型
IDH
Z
O@X>?SS
AZ
;
引物编号
IO/6;O
数量
D@>1S
百分比
IO@
Z
@OS/@1
%
J
雌雄无差异
b/S=1@X/::;O;1?;
U;SY;;1678;
71X:;678;
有片段且在预定范围
b/S=
Z
O@X>?S0
!
0/B;Y/S=/1;[
Z
;?S;X8;1
<
S=
+
!
##
!
#
!
#+
!
#)
!
"
!
#
!
!
!
%&
!
%$
!
))
!
#""
!
#"!
!
#"% #& #%,%%
有片段但不在预定范围
b/S=
Z
O@X>?S0
!
0/B;U;
A
@1X;[
Z
;?S;X8;1
<
S=
)
!
#!
!
%
!
%!
!
%
!
&$
!
&)
!
-!
!
-&
!
-
!

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+"
!
+#
!
+!
!
)&
!
)-
!
)
!
)+
!
#"#
!
#"&
!" #),"$
无片段
C@
Z
O@X>?S0
#
!
%
!
$
!
-
!

!
#&
!
#-
!
%%
!
%)
!
&#
!
&!
!
&%
!
$!
!
$+
!
-%
!
-$
!
-
!
"
!
+&
!
+$
!
+-
!
+
!
++
!
+)
!& !!,+-
雌雄有差异
b/S=X/::;O;1?;
U;SY;;1678;
71X:;678;
差异片段在预定范围
F/B;@:X/::;O;1S
Z
O@X>?S0Y/S=/1;[
Z
;?S;X8;1
<
S=0
$
$
#"
!
#%
!
$
!
)
!
%"
!
%-
!
&-
!
&
!
$"
!
$%
%
$
)
!
-+
!
-)
!
#
!
!
!
%
!
&
!
+
!
)#
!
)!
!
)%
!
)$
!
#"$
!% !#,)"
差异片段不在预定范围
F/B;0@:X/::;O;1S
Z
O@X>?S0U;
A
@1X;[
Z
;?S;X8;1
<
S=0
$
$
!
!
&
!
#$
!
&
!
-
!

!
+
!
%#
!
%+
!
&"
!
&&
%
$
&+
!
$#
!
$&
!
$$
!
$-
!
$
!
-"
!
-#
!
--
!
$
!
)
!
+%
!
)"
!& !!,+-
$&
%
期
!!!!!!!!!!!!!!
齐凤慧!等$
5FG*FFH
标记在水曲柳雌雄鉴定中的应用
所示!
%
号引物"
#
*
!
*
%
*
&
泳道#和
&
号引物"

*
+
泳道#在雌树
4C3
中扩增出符合预定大小的目的
条带!而在雄树
4C3
中没有扩增出条带&
$
号引物
"
)
*
#"
*
##
*
#!
泳道#在雌树
4C3
中扩增出比目的片
段长度小的条带!而在雄树中没有扩增出条带)
@:A:A
!
$%&%%(
引物第二轮筛选
!
将第一轮筛选
中雌雄有差异的所有引物都用于第二轮筛选!每个
引物分别以雌雄各
#$
个单株
4C3
为模板!扩增结
果显示来自水曲柳转录组中的
#)
和
$-
号引物在水
曲柳雌雄各
#$
个单株中均有差异)图
&
!
3
是来自
白蜡属
5FG
的
&&
和
!-
号引物!可以看出在雌雄间
没有明显差异!图
&
!
2
是来自转录组
$-
号引物部
分结果!在
&"
"
+"U
Z
处雄树
4C3
中均扩增出小于
目的条带的多态性片段!而雌树
4C3
中均没有这
样的多态性条带)图
&
!
D
是
#)
号引物部分扩增结
果!如箭头所示!在雌树
4C3
中扩增出符合预定大
小的目的条带!而雄树
4C3
中没有扩增出同样大
小的条带)
@:A:D
!
$%&%%(
在水曲柳中的应用
!
将第二轮筛
选得到的
#)
号和
$-
号引物应用于
!""
棵成年水曲
柳的雌雄差异分析中!
$-
号引物在
#""
株雌树中有
#+
株在
+"U
Z
处扩增出片段!
+!
株没有扩增出片段
"图
$
!
3
#!差异率是
+!,""J
&在
#""
株雄树中有
%
株在
+"U
Z
处没有片段!
)
株有片段!而且均出现
多态性扩增片段"图
$
!
2
#!差异率是
),""J
)因
此!
$-
号引物在
!""
株水曲柳成年雌雄树中雌雄差
异率是
+),$"J
)
#)
号引物在
#""
株雌树中有
%+
株在
%""
"
$""
U
Z
之间扩增出片段!如图
-
箭头所示!
-!
株没有扩
增出片段!差异率是
%+,""J
&在
#""
株雄树中有
)#
株在
%""
"
&""U
Z
之间没有扩增出片段!
)
株扩增
出片段!差异率是
)#,""J
!
#)
号引物在
!""
株水曲
柳成年树中雌雄差异率是
-&,$"J
)
表
D
!
转录组
$%&%%(5
引物筛选结果
G7U8;&
!
H;0>8S0@:5FG*FFH0
Z
O/6;O0?O;;1/1
<
/1SO710?O/
Z
S@6;
IDH
片段类型
IDH
Z
O@X>?SS
AZ
;
引物编号
IO/6;O
数量
D@>1S
百分比
IO@
Z
@OS/@1
%
J
雌雄无差异
b/S=1@X/::;O;1?;
U;SY;;1678;
71X:;678;
有片段且在目的片段范围
b/S=
Z
O@X>?S0
!
0/B;Y/S=/1
;[
Z
;?S;X8;1
<
S=
#*)
!
##*#&
!
#-
!
#+
!
!"*!)
!
%#
!
%%*%&
!
%-*
&"
!
&!*$$
!
$*-+
!
!*+!
!
+&
!
+-
!
++*)#
!
)%
!
)-*#"$
!
#"*##"
!
##!*##%
!
##$
!
##
!
##)
!
#!#
!
#!%
!
#!-*#!
#"" +,&
雌雄有差异
b/S=X/::;O;1?;
U;SY;;1678;
71X:;678;
差异片段在目的片段范围
F/B;@:X/::;O;1S
Z
O@X>?S0
Y/S=/1;[
Z
;?S;X8;1
<
S=0
%
#
!
%
#
!
$
)$
!
%
#!$ & %,#$
差异片段不在目的片段范
围
F/B;0@:X/::;O;1S
Z
O@X>?S0
U;
A
@1X;[
Z
;?S;X8;1
<
S=0
差异片段小于目的条带
F/B;0 @: X/::;O;1S
Z
O@X>?S0
8;00S=71;[
Z
;?S;X8;1
<
S=0
$
$
)!
%
$
%"
!
&#
!
$-
!
-)
!
+
!
)&
$,$#
差异片段大于目的条带
F/B;0@:X/::;O;1S
Z
O@X>?S0U/
<
*
<
;OS=71;[
Z
;?S;X8;1
<
S=0
$
$
#)
!
#$
!
%!
!
"
!
+%
!
+$
!
###
%
$
#"
!
%$
!
#"-
!
##&
!
##-
!
##+
!
#!"
!
#!!
!
#!&
#- #!,-"
图
%
!
部分引物筛选结果
3,
雌雄没有差异的结果&
2,
雌雄有差异的结果&
c,
分子量&
#
*
%
*
$
*

*
)
*
##
*
#%
泳道为雌树
4C3
扩增结果!*
&
*
-
*
+
*
#"
*
#!
*
#&
泳道为雄树
4C3
扩增结果
L/
<
,%
!
IO/6;O00?O;;1/1
<
:@O5FG*FFH7178
A
0/0
3Y70S=;76
Z
8/:/?7S/@10Y/S=1@X/::;O;1?;0U;SY;;1678;71X:;678;
&
2Y70S=;76
Z
8/:/?7S/@10Y/S=X/::;O;1?;0U;SY;;1678;071X
:;678;0
&
c,c7O];O
&
R71X#
!
%
!
$
!

!
)
!
##
!
#%Y/S=S=;4C3:O@6:;678;0
&
R71;!
!
&
!
-
!
+
!
#"
!
#!
!
#&Y/S=S=;4C3:O@6678;0
-&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
&
!
第二轮部分引物筛选结果
$
,
雌&
%
,
雄&下同
L/
<
,&
!
H;0>8S0@:
Z
O/6;O0?O;;1/1
<
/1S=;0;?@1XO@>1X
$
,L;678;
&
%
,c78;
&
G=;076;70U;8@Y
%
!
讨
!
论
FFH
不仅分布于整个基因组中!包括编码区和
非编码区!也广泛存在于
5FG
序列中)
5FG
序列
开发的
5FG*FFH
标记与传统的基因组
FFH
标记相
比有很多优点!如$
5FG*FFH
标记在物种间具有高
通用性!通常都代表着某种基因功能!还可反映出转
录区的差异!而且开发过程简单*成本低+!$,)目前!
5FG*FFH
已在农作物和木本植物中广泛应用)
F/8*
:T;OU;O
<
*4/8Y@OS=
等+!-,利用
#&+
个苹果
FFH
引物
"包含
%#
个
5FG*FFH
#和
+
个已知的苹果*梨和欧
图
$
!
$-
号引物雌雄鉴别部分图
L/
<
,$
!
H;0>8S0@:
Z
O/6;O$-
图
-
!
#)
号引物雌雄鉴别部分图
L/
<
,-
!
H;0>8S0@:
Z
O/6;O#)
洲花楸
FFH
标记构建了复合遗传图谱!这些
FFH
标记给原参考图谱新增了
#-+
个位点)通常
5FG*
FFH
侧翼序列在物种之间高度保守!因此可以在一
个物种中开发
5FG*FFH
应用于与它亲缘的物种
中)
d;1XO76/1
等+!,从桃"
:-
<
0"(%,#
#的中果皮中
开发了
!#
对
5FG*FFH
引物!用
!!
个桃
4C3
筛选
出
#+
对引物均能有效扩增出条带!同时用这
#+
对
引物在李属"
:"&(
#的
-
个其它植物中均扩增出
了预期条带!说明
5FG*FFH
在李属近缘种植物之
间具有高效的通用性)本研究在
#"$
对白蜡属
5FG*FFH
引物和
#!
对水曲柳转录组
FFH
引物
中!分别有
+#
和
#!
对引物能有效扩增!说明
5FG*
&
%
期
!!!!!!!!!!!!!!
齐凤慧!等$
5FG*FFH
标记在水曲柳雌雄鉴定中的应用
FFH
在近缘或远缘物种之间均有较好的通用性)
要将
5FG*FFH
应用于植物中!关键的第一步
就是要进行对
5FG
序列中
FFH
位点的分析及引物
设计)刘泽涛等+!+,用
FFHFD3C
软件对小麦穗部
的
%!-&
条
5FG
序列进行
FFH
位点查找!得到
#"+
条含有
FFH
标记的序列!设计
-&
对引物筛选得到
&#
对能在小麦品种中扩增出条带!
%-
对引物能扩增
出多态性条带)
D=7U71;
等+!),设计了
&+
对大麦的
5FG*FFH
引物!并从中筛选出
#$
对引物在大麦中
能有效扩增)在
5FG*FFH
研究中!李响等+%",对腊
梅转录组进行
FFH
位点分析并设计了
#""
对
5FG*
FFH
引物!筛选出
#
对引物在腊梅中能有效扩增)
本研究共合成了
!%!
对引物!筛选到
!"+
对引物在
水曲柳中能有效扩增!其中有
&
对引物在水曲柳雌
雄
4C3
中存在差异!占所有引物的
%#,)"J
)
随着植物基因组学与功能基因组学的不断发展
和研究的深入!大规模植物基因的测序产生了大量
的
5FG
序列!并上传到核酸公共数据库中!因此!要
进一步利用
5FG
序列信息!其中之一就是要对
5FG*FFH
的引物进行开发)李德军等+%#,对来自
CD2E
和马来西亚橡胶树
5FG
数据库的
5FG
序列
进行分析!共鉴定到
$--
个
FFH
位点!平均
%,)-]U
出现一个
FFH
位点)在火炬松和云杉
5FG
序列中
平均
&),+]U
出现
#
个
FFH
位点!在杨树
5FG
序列
中平均每
%,++]U
出现
#
个
FFH
位点+#-,)在一些
物种中!二核苷酸和三核苷酸重复序列占主要类型!
如橡胶树中二核苷酸重复占主要类型!其次是三核
苷酸*四核苷酸*五核苷酸和六核苷酸重复!二核苷
酸中
W3
%
DG
的数目最多!其次是
GD
%
3W
*
3G
%
G3
*
DGG
%
W33
*
GGD
%
33W
和
GDG
%
3W3
+
%#
,
)甘
蔗
5FG
中三核苷酸重复占
)"J
+
%!
,
&蝴蝶兰
5FG
中
二核苷酸重复占
-,#"J
+
%%
,
&白桦
5FG
中二核苷酸
重复占
+#,#!J
+
#$
,
)本研究中水曲柳转录组中的
FFH
出现的频率较低为
#,)+J
!在白蜡属
5FG
中
每
",%!]U
出现一个
FFH
位点!出现的频率较高)
水曲柳中也是二核苷酸重复序列占主导!最高为
!,+J
!二核苷酸"
3W
%
DG
#
1
出现的频率最多为
%+,&!J
)水曲柳中的三核苷酸"
33W
%
DGG
#
1
与
杨树"
),%J
#*杏"
!+,-J
#
+
%&
,
*油菜"
%$,#
#
+
%$
,等报
道一致)
水曲柳雌雄叶片的
5FG*FFH
标记的开发及应
用对水曲柳育种及种子园建立具有重要的现实意
义!一方面!对两种来源的标记均具有较高的有效扩
增效率!表明利用近缘植物的分子标记对水曲柳进
行研究是一种有效可行的方法&另一方面!导致水曲
柳有性繁殖和种子园建立的难点关键是幼年水曲柳
很难分辨雌雄!而目前关于水曲柳雌雄鉴别的研究
基本空白)构建更加全面的水曲柳雌雄
5FH*FFH
标记并利用其来进行雌雄差异基因的定位!将是下
一步的工作重点)
参考文献!
+
#
,
!
25HM25Q
!
PNM3CWe
!
HMCWEF4
!
0/#>,D=7O7?S;O/B7S/@1@:5FG*FFH/18@U8@8
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""
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+
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