全 文 ：书西北植物学报!
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#$
!$%#&!$%
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!!
文章编号$
#"""()"!*
"
!"#$
#
!(!$%#("
收稿日期$
!"#$("+($#
%修改稿收到日期$
!"#$(#"(",
基金项目$教育部春晖计划"
-!"#""+%
#%国家科技支撑计划课题"
!"#!./0".")
#
作者简介$乔
!
枫"
#,+$&
#!女!博士!教授!主要从事植物生理和分子生物学研究&
1(2345
$
6
437892
!
#%$:;72
"
通信作者$陈
!
志!教授!博士生导师!主要从事植物资源研究&
1(2345
$
;<4*
!
#%$:;72
独一味苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析
乔
!
枫#!罗桂花#!耿贵工!!金
!
兰#!陈
!
志#"
"
#
青海师范大学 青藏高原资源与环境教育部重点实验室!西宁
#"""
%
!
青海省农林科学院农业部农产品质量安全风险评估实
验室!西宁
#""#%
#
摘
!
要$以独一味叶片为材料!采用
=>(?0=
和
=/01
方法克隆了独一味苯丙氨酸解氨酶基因"
!"#
#的全长
;@A/
!命名为
#$!"#
基因&测序结果表明!
#$!"#
基因全长
!!,B
C
!含有
#
个
!#)*B
C
的完整开放阅读框
"
D=E
#!编码
+#)
个氨基酸&蛋白序列分析表明!其包含典型的
?/F
活性中心序列"
G>H>/IG@FJ?FIKH/
#!与
其他植物的
?/F
蛋白有很高的同源性&系统进化树分析表明!独一味
FL?/F
与唇形科植物的
?/F
蛋白聚为一
类!说明两者的亲缘关系较近&用
=M35(>42M?0=
方法检测发现!
#$!"#
基因在独一味的叶中表达量最高!茎中
表达量最少&研究结果推测!从独一味中克隆获得的苯丙氨酸解氨酶基因"
#$!"#
#是典型的
?/F
家族成员!在独
一味各组织发育过程中具有重要功能&
关键词$独一味%苯丙氨酸解氨酶"
?/F
#%基因克隆%表达分析
中图分类号$
N+*
文献标志码$
/
!"#$%&#()#"*+*
,
*-./
0
($11+"*233$(*1"4
1(2!14("51$3-&
4
5*&3-6(&#$#$
NH/DEM9
O
#
!
FPDGQ4RQ3
#
!
G1AGGQ4
O
79
O
!
!
SHAF39
#
!
0T1A-R4
#
"
"
#1UQ;3V47935W494XVL
Y
F3B7819Z4L792M9V39U=MX7QL;M49N49
O
R34(>4BMV?53VM39
!
N49
O
R34A7L235P94ZMLX4V
Y
!
[4949
O
#"""
!
0R493
%
!F3B7L3V7L
Y
78NQ354V
Y
\I38MV
Y
=4X]/XXMXX2M9V87L/
O
L7(
C
L7UQ;VX
!
W494XVL
Y
78/
O
L4;Q5VQLM
!
[4949
O
#""#%
!
0R493
#
6713(%3
$
H9VR4XXVQU
Y
!
3
C
RM9
Y
5353949M3227943(5
Y
3XM
"
?/F
#
O
M9M 3^X;579MU8L72#%&(
)
*+(&,$(-%-%
B
Y
VRM2MVR7UX78=MZMLXM(>L39X;L4
C
V479?0=39U=/01:>RM8Q5(5M9
O
VR;@A/78#.$(-%-%!"#
"
UMX4
O
(
93VMU3X#$!"#
#
3^X!!,B
C
!
39U;79V349MU3;72
C
5MVM7
C
M9LM3U49
O
8L32M
"
D=E
#
78!#)*B
C
!
R^4;RM9(
;7UMU+#)324973;4ULMX4UQMX:IM
6
QM9;M3935
Y
X4XXR7^ MUVR3V4V;79V349XVRMV
YC
4;35?/F3;V4ZMX4VMXM(
6
QM9;M
"
G>H>/IG@FJ?FIKH/
#
:T72757
OY
3935
Y
X4X49U4;3VMUVR3VVRMUMUQ;MUFL?/F
C
L7VM49 3^XR4
O
R(
5
Y
R72757
O
7QXV77VRML?/F
C
L7VM49X8L72U488MLM9V
C
539VX
C
M;4MX:?R
Y
57
O
M9MV4;VLMM3935
Y
X4XLMZM35MUVR3V
FL?/FR3U;57XMLLM53V479XR4
C
4^VR?/FX8L72#%/%-%0
C
539VXVR39VR3V8L727VRML
C
539VX:>RMLMXQ5VX
8L72=M35(>42M?0=49U4;3VMUVR3VVRMM_
C
LMXX47978#$!"#
O
M9M 3^XVRMXVL79
O
MXV49VRM5M3ZMX78#.$(1
-%-%
!
39UVRM5M3XV49XR77VX:/X3LMXQ5V
!
VRM
O
M9M#$!"# R^4;R 3^X;579MU39U;R3L3;VML4-%4X3V
YC
4;352M2BML78?/F83245
Y
:>RMLMXQ5V49U4;3VMUVR3V#$!"#
O
M9M
C
53
Y
MU342
C
7LV39VL75M49VRM
UMZM57
C
2M9V78#.$(-%-%
C
539V:
8$
9
:"(-1
$
#%&(
)
*+(&,$(-%-%
%
C
RM9
Y
5353949M3227943(5
Y
3XM
"
?/F
#%
O
M9M;57949
O
%
M_
C
LMXX4793935
Y
X4X
!!
独一味"
#%&(
)
*+(&,$(-%-%
#属于唇形科独
一味属植物!该属仅
#
种!是青藏高原特有的重要药
用植物之一!广泛分布于西藏!在青海甘肃四川和
云南只有零星分布!常生于海拔
$,""
"
*#""2
的
石质高山草甸河滩地或强度风化的碎石滩上&独
一味的化学药用成分主要有黄酮环烯醚萜苯乙醇
苷等化合物(#(!)&
植物苯丙烷类代谢途径是植物体内次生物质代
谢的一条重要途径!一切含苯丙烷骨架的物质都是
该途径直接或间接的产物!这些化合物在植物体内
各具多种生理功能!在植物形成如类黄酮木质素
生物碱等次级代谢物中起重要作用($(%)!这些次生产
物对植物生长发育抗病抗逆等方面具有重要意
义()!+)!并且在医药保健和食品工业等领域具有广
阔的应用前景&苯丙氨酸解氨酶"
C
RM9
Y
5353949M
3227943(5
Y
3XM
!
?/F
!
10):$:#:*
#是催化苯丙烷代
谢途径第一步反应的酶!也是这个途径的关键酶之
一((,)!也是黄酮合成代谢途径中的关键酶($)&另
外!
!"#
基因在初生代谢和苯丙烷类代谢中的调控
受发育紫外光胁迫等因素的影响(#"(#$)!因而!开展
独一味苯丙氨酸解氨酶
!"#
基因及其相应蛋白质
的研究具有重要的意义&
目前!已对拟南芥"
"$%/2(
)
,,-*%+%3%
#西
红柿 "
4(+%35&+
6
7(
)
0$,75&
#烟 草 "
87(-%3%
-%/%75&
#朝鲜当归"
"3
9
0+7%
9

9
%,
#丹参"
4%+:%
&+-($$*;%
#麻 疯 树 "
<%-$(
)
*%75$7%,
#毛 竹
"
!*
6
++(,-%7*
6
,025+,
#西瓜"
=-$5++5,+%3%-5,
#等
多种植物的
!"#
基因进行了
;@A/
克隆序列分
析以及蛋白质的功能研究(#)(!$)&但有关独一味
?/F
的相关研究尚未见报道&本研究通过设计简
并引物!利用
=>(?0=
方法及
=/01
技术!克隆独
一味
!"#
基因的
;@A/
全长序列!并用生物信息
学分析该基因的序列特征!利用
=M35(>42M?0=
方
法检测
!"#
基因在独一味各组织中的表达特性!
以期揭示该基因在独一味不同器官中的调控作用!
为独一味抗逆性以及药学的研究奠定分子理论
基础&
#
!
材料和方法
;:;
!
试验材料
选择生长在青海玉树草原站的多年生中藏药植
物独一味"
#%&(
)
*+(&,$(-%-%
#!取其新鲜无病
虫害的叶茎叶柄根材料立即置于液氮中!后置于
&"`
保存备用!用于
=A/
的提取&
;<=
!
植物总
>?6
的提取与
%@?6
的合成
根据唇形科植物彩叶草"
4(+03(,-0&(3,75-0+1
+%$(20,
!
/E-,)*,:#
#紫苏"
!0$++%
>
$5-0,703,
!
/1-%+)*+:#
#藿香"
"
9
%,-%7*0$5
9
(,%
!
//a#*%)":#
#
丹参"
4%+:%&+-($$*;%
!
/.@+$!!:#
#黄芩"
475-01
++%$%/%7%+03,,
!
/@A$!+%+:#
#
!"#
基因的保守序
列设计引物!试验所用引物"北京三博远志生物公司
合成#及其序列见表
#
&
独一味总
=A/
采用
>L4<75LM3
O
M9V
提取试剂
盒"
H9Z4VL7
O
M9
#进行提取!通过琼脂糖凝胶电泳和紫
外分光光度计"
G1
#检测
=A/
浓度和完整性&利
用
/WJE4LXVIVL39U;@A/I
Y
9VRMX4Xa4V
"
>3a3(
=3
#进行
;@A/
第一链的合成!
&!"`
保存备用&
以上述合成的第一链
;@A/
为模板!进行
?0=
扩
增!扩增体系
*"
#
F
!包括$
;@A/!:"
#
F
!上下游
引物"
#"
#
275
*
F
#各
#:"
#
F
!
#"b?0=BQ88ML*
#
F
!
UA>?
"
#"2275
*
F
#
#:"
#
F
!
F/?%
@
聚合酶"
*P
*
#
F
!
>3a3=3
#
":)
#
F
!
UUT
!
D
补足至
*"
#
F
&
?0=
表
;
!
实验分析所用引物
>3B5M#
!
?L42MLXQXMU49VR4XVMXV
引物
?L42ML
核苷酸序列"
*c
#
$c
#
AQ;5M7V4UMXM
6
QM9;M
"
*c
#
$c
#
所在基因及位点
GM9M39U
C
7X4V479
用途
?QL
C
7XM
!"#NE#
!"#N=#
!"#NE$
!"#E)
!"#$=
>G/0
"
>
*
0
*
G
#
0/
"
0
*
>
#"
G
*
/
#
/G0>G//G0/00/
>>0>00>00/
"
0
*
G
*
/
#"
/
*
G
#
>G00
G//G0>/>0G/0/>>0>G///0
0/>0G/G///G/0GG>0G//G0>/
0>/
"
/
*
G
#
0/
"
G
*
/
#
/>
"
/
*
>
*
G
#
GG
"
0
*
/
#
/
"
>
*
G
#"
>
*
/
#
GG
#$!"#
%
,"*(,!%
#$!"#
%
#*+#(#*%
#$!"#
%
#*"#(#*!!
#$!"#
%
#))(#*"+
#$!"#
%
!#!(!#)*
;@A/
片段克隆
E7L;57949
O
VRM8L3
O
2M9V78;@A/
*(!"#=#
*(!"#=!
GG0/>//0GG>00>G>>>0GG>>>
G/G0>>>>GGG0GG0>>>//0G>/
#$!"#
%
#"!+(#"*"
#$!"#
%
,!(#""*
*c(=/01
扩增
*c(=/0132
C
5484;3V479
!"#(*=#
!"#(*=!
0G/>G>/GG/>/GGGGG/0G/G
GGG>G/0G>>G>>G>>G/GG/G
#$!"#
%
",(%$"
#$!"#
%
*)+(*%
*c(=/01
扩增
*c(=/0132
C
5484;3V479
!"#KE#
!"#K=#
000>G>0/0>//00/>G>G0/G/G
>0G/>/G0>>0G/00G>0>>>0>0
#$!"#
%
#)#%(#)$,
#$!"#
%
#)(#*##
=>(
6
?0=
表达
=>(
6
?0=M_
C
LMXX479
!"# dE#
!"# d=#
/G>G/>0//>>>G0///>GG0>G
0>/G0/G/>GGG0/G/GG0>00
#$!"#
%
&#%(e+
#$!"#
%
!#!*(!#)*
;@A/
全长序列克隆
E7L;57949
O
VRM8Q55M9
O
VR;@A/
"7-3E#
"7-3=#
G>
"
G
*
0
#
G0>00
"
>
*
/
#
G//G/G0/
0>0
"
/
*
G
#
G0/G>
"
G
*
>
#
G>GG>
"
G
*
/
#
//
#$"=?A8
%
#(#+
#$"=?A8
%
$#$($$"
参考基因
E7LLM8MLM9;M
O
M9M
"7-3KE#
"7-3K=#
/0G>G00/G00/>G>/>G>>G
00/>0/00/G//>00/GG/0/
#$"=?A8
%
,(##
#$"=?A8
%
#%,(#,
=>(
6
?0=
表达
=>(
6
?0=M_
C
LMXX479
!%$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
反应条件为$
,)`
预变性
$249
%
,)`
变性
#249
!
**`
"
*`
退火
#249
%
+!`
延伸
!249
!
$*
个循
环%
+!`
延伸
#"249
&
?0=
产物经琼脂糖凝胶回
收试剂盒"北京三博远志生物公司#纯化后连接至
C
W@#(>
载体"
>3a3=3
#!转化
SW#",
感受态细胞
"北京三博远志生物公司#&蓝白斑筛选阳性克隆!
经酶切和
?0=
鉴定后选用
!
"
)
个阳性克隆送北京
三博远志生物公司测序&
采用
*c(=/01
方法扩增独一味
?/F
的
;@A/
*c
末端序列!根据上述
?0=
获得的独一味
!"#
基
因片段序列!在
*c
端设计特异性巢式引物"表
#
#!并
利用
*c(EQ5=/01a4V!:"
"
>3a3=3
#扩增
*c
末端
序列!实验操作按照试剂盒说明书进行&
?0=
产物
经纯化克隆后测序&
;:A
!
基因序列的生物信息学分析
用
@A/XV3L
软件对所克隆的基因片段进行拼
接!获得了完整的独一味
!"#
全长
;@A/
!然后在
A0.H
"
RVV
C
$**
^^ ^:9;B4:952:94R:
O
7Z
*#网站进行
.53XV
分析!并通过软件
D=EE49UML
"
RVV
C
$**
^^ ^:
9;B4:952:94R:
O
7Z
*
O
7L8
*
O
7L8:RV25
#进行了
D=E
的
查找和核苷酸的翻译%应用
1_?/I
Y
"
RVV
C
$**
^^ ^:
M_
C
3X
Y
:7L
O
#提供的相关软件!综合预测分析了编码
蛋白的基本性质结构特点和亚细胞定位%利用
WM
O
3$:#
软件的
05QXV35[
"
#:$
#对不同
!"#
基
因编码氨基酸序列进行多重序列比对!再使用最小
进化法"
W4942Q21Z75QV479
#构建系统发育树&
;!
2!1
基因组织表达特异性检测
以
"7-3
基因为内参!根据植物唇形科
"7-3
基
因的保守序列!设计保守引物
"7-3E#
和
"7-3=#
"表
#
#!预期扩增片段长度为
$$"B
C
&以此序列设计
"7-3
基因荧光定量分析的特异引物
"7-3KE#
和
"7-3K=#
"表
#
#!预期扩增片段长度为
,%B
C
&
根据
#$!"#
基因序列设计荧光定量分析引物
!"#KE#
和
!"#K=#
"表
#
#!预期扩增片段长度
为
,%B
C
&采用
>3a3=3
公司
IK.=
$
?LM24_1_
?%
@
>W
"
>54=A3XMT?5QX
#试剂盒程序进行荧光定
量
?0=
反应&反应在
4N*
"
.HD(=/@
#荧光定量
?0=
仪上进行!反应体系"
!"
#
F
#为$
!bIK.=
?LM24_1_?%
@
>W
"
>3a3=3
#
"
#
F
!
;@A/VM2
C
53VM
!:"
#
F
!上下游引物"
#"
#
275
*
F
#各
":)
#
F
!
*"b
=D[=M8MLM9;M@
Y
M":)
#
F
!
UUT
!
D%:
#
F
!每个
反应做
$
个重复&
?0=
扩增程序为$
,*`
预变性
$"X
%
,*`*X
!
%"`$#X
!
)"
个循环!反应结束后确
认
=M35(>42M?0=
扩增曲线和融解曲线&利用
!
&
$$
0V方法计算基因的相对表达量(!))&
!
!
结果与分析
=<;
!
2!1
基因全长
%@?6
克隆与序列分析
以独一味叶片总
=A/
反转录得到的
;@A/
为
模板!采用
=>(?0=
方法和
*c(=/01
方法扩增独
一味苯丙氨酸解氨酶基因的全长
;@A/
&首先以引
物组合
!"#NE#
*
!"#N=#
"表
#
#进行扩增!
=>(
?0=
结果经测序获得
%!B
C
的片段"图
#
!
/
#%以引
物组合
!"#NE$
*
!"#$=
和引物组合
!"#E)
*
!"#$=
"表
#
#分别进行扩增!获得
%)*B
C
和
%%!B
C
的片段"图
#
!
.
#&
图
#
!
独一味叶片
#$!"#
的
;@A/
序列的克隆
W:@F!"""
%
/:
引物
!"#NE#
*
!"#N=#
结果%
.
$
#:
引物
!"#E)
*
!"#$=
结果%
!:
引物
!"#NE$
*
!"#$=
结果%
0:
第一次
*c(=/01
引物
*(!"#=!
*
499ML
C
L42ML
结果%
@:
第二次
*c(=/01
引物
!"#(*=!
*
499ML
C
L42ML
结果%
1:
引物
!"#dE#
*
!"#d=#
扩增
D=E
E4
O
:#
!
057949
O
78#$!"#;@A/8L72#.$(-%-%
W:@F!"""
%
/:=MXQ5V 4^VR
C
L42MLX!"#NE#
*
!"#N=#
%
.
$
#:=MXQ5V 4^VR
C
L42MLX!"#E)
*
!"#$=
%
!:=MXQ5V 4^VR
C
L42MLX!"#NE$
*
!"#$=
%
0:=MXQ5V78*c(=/01 4^VR
C
L42MLX*(!"#=!
*
499ML
C
L42ML
%
@:=MXQ5V78*c(=/01 4^VR
C
L42MLX!"#(*=!
*
499ML
C
L42ML
%
1:D=E32
C
5484;3V479 4^VR
C
L42MLX!"#dE#
*
!"#d=#
$%$!
#!
期
!!!!!!!!!!!
乔
!
枫!等$独一味苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析
!!
根据测序结果!设计
*c(=/01
特异巢式引物第
一次扩增外引物
*(!"#=#
和内引物
*(!"#=!
"表
#
#!
?0=
扩增结果"图
#
!
0
#经测序获得
))B
C
条
带&第二次
*c(=/01
扩增外引物
!"#(*=#
和内引
物
!"#(*=!
"表
#
#
?0=
扩增结果"图
#
!
@
#经测序
获得
+!*B
C
条带&
使用
@A/XX4XV
软件进行序列拼接获得独一味
!"#
基因全长
;@A/
序列
!!,B
C
!利用引物组合
!"#dE#
*
!"#d=#
扩增独一味苯丙氨酸解氨酶
基因的全长编码序列
&#%
"
!#)*B
C
!包括
#
"
!#)*B
C
完整的开放读码框"图
#
!
1
#!编码
+#)
个
氨基酸&通过
.53XV
比对!根据同源性将其代表的基
因命名为
#$!"#
!其核苷酸和氨基酸序列见图
!
&
=<=
!
1(2!1
基因的生物信息学分析
@A/XV3L
软件对预测的
FL?/F
氨基酸序列分
析表明!该蛋白分子量为
++:!*]@
!等电点
C
H
为
%:)%$
!其中碱性氨基酸
+#
个!酸性氨基酸
+,
个!疏
水性氨基酸
!%*
个!极性氨基酸
#++
个&使用频率
较高的氨基酸有
FMQ

/53

G5
Y

G5Q
!分别占总氨基
酸的
##:"%f

#":!!f

:!%f

+:#*f
!频率较低
的氨基酸有
>L
C

0
Y
X

>
Y
L
分别占总氨基酸的
":*%f

#:*)f

#:,%f
&经在
A0.H
网站上进行结
构预测分析!
FL?/F
含有苯丙氨酸*组氨酸解氨酶
蛋白激活位点和保守结构域&同时
.53XV
C
氨基酸
序列比对也表明!
FL?/F
含有保守的脱氨基位点
"
UM32493V479X4VM
#即
F()!

J()!,

F()+"
和
/(
)+#
%保守的催化激活位点"
;3V35
Y
V4;3;V4ZMX4VMX
#即
A()$*

G()$%

T()++
和
TAN@J
"
))
"
)33
#&
这些激活位点与拟南芥"
"$%/2(
)
,,-*%+%3%
#和
烟草"
87(-%3%
#的
?/F
的催化和脱氨基位点相一
致&
?DID=>
和
W7V48I;39
软 件 分 析 表 明!在
FL?/F
氨基酸序列
0(
端有
!
个双亮氨酸基元
FF
图
!
!
#$!"#
基因
;@A/
序列及推定氨基酸序列
下划线的斜体字表示起始密码子
/>G
和终止密码子
>/G
%灰色背景部分为苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构标签
E4
O
:!
!
;@A/XM
6
QM9;M39U
C
QV3V4ZM324973;4UXM
6
QM9;MX78#$!"#
O
M9M
>RMXV3LV;7U79
"
/>G
#
39UXV7
C
;7U79
"
>/G
#
3LM494V354;39UQ9UML549MU
%
>RM53BM5;7U49
O
78
C
RM9
Y
5353949M39UR4XV4U49M3227943(5
Y
3XMX4XXR3UMUB
YO
LM
Y
B3;]
O
L7Q9U
)%$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
"%!+
"
%!33
和
%,,
"
+""33
#!同时该蛋白
A(
端没
有蛋白定位信号肽!是一个可溶性蛋白&蛋白质功
能结构域预测结果显示该基因含有苯丙氨酸和组氨
酸解氨酶的标志性模式"
#)
"
!""
#!序列为
G>H>/I(
G@FJ?FIKH/G
!包埋在酶的活性中心"图
!
#&
图
$
!
#"
种植物
?/F
氨基酸序列多重比对
%
:
独一味%
&
:
彩叶草"
/E-,)*,:#
#%

:
紫苏"
/1-%+)*+:#
#%
(
:
藿香"
//a#*%)":#
#%
)
:
马铃薯"
/G>%$"%$:#
#%
*
:
紫草"
/.1"$++!:#
#%
+
朝鲜当归"
/1/+!!":#
#%
,
:
黄芪"
//[)$,:#
#%
-
:
红景天"
//d+,$!:#
#%
.
:
油菜"
/.0%,,#+:#
#%玫红色代表氨基酸相同!深绿色代表有
!
种以上氨基酸
E4
O
:$
!
WQ5V4
C
5MXM
6
QM9;M354
O
92M9V78324973;4UX78VRM?/F
C
L7VM49X4X753VMU8L72VM9
C
539VX
%
:#%&(
)
*+(&,$(-%-%
%
&
:4(+03(,-0&(3,75-0++%$(20,
"
/E-,)*,:#
#%

:!0$++%
>
$5-0,703,
"
/1-%+)*+:#
#%
(
:"
9
%,-%7*0$5
9
(,%
"
//a#*%)":#
#%
)
:4(+%35&-5/0$(,5&
"
/G>%$"%$:#
#%
*
:"$30/%057*$(&%
"
/.1"$++!:#
#%
+
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9
0+7%
9

9
%,
"
/1/+!!":#
#%
,
:",-$%
9
%+5,&(3
9
*(+75,
"
//[)$,:#
#%
-
:B*(2(+%,%7*%+303,,
"
//d+,$!:#
#%
.
:C$%,,7%3%
)
5,
"
/.0%,,#+:#
#%
=7XM(LMU;757L
C
LMXM9VMUVRMX32M324973;4U
%
@MM
C
(
O
LMM9;757L
C
LMXM9VMUV^ 77L27LM]49UX78324973;4UX
*%$!
#!
期
!!!!!!!!!!!
乔
!
枫!等$独一味苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析
图
)
!
FL?/F
与其他植物
?/F
蛋白系统进化树
图中标记各节点处数值表示
.77VXVL3
C
值"重复
#"""
次#%比例尺表示碱基替代率
E4
O
:)
!
?R
Y
57
O
M9MV4;VLMM78FL?/F39U2M2BMLXR4
C
78?/F
C
L7VM49X497VRML
C
539VX
>RM9Q2BMLX9M_VV7VRM97UMX
O
4ZMB77VXVL3
C
Z35QMX78#"""LM
C
54;3VMX
%
>RMX;35MB3L49U4;3VMXVRMX4VMXQBXV4VQV479X
图
*
!
独一味
"7-3
基因片段扩增结果
W:@F!"""
%
#

!:"7-3
基因片段扩增结果
E4
O
:*
!
=MXQ5V78#$"7-3
O
M9M8L3
O
2M9V
W:@F!"""
%
#
!
:#$"7-3
O
M9M8L3
O
2M9V
=!
C(26C
编码蛋白与其他植物同源性比较
独一味
#$!"#
基因推导氨基酸序列与其他作
物
?/F
编码的氨基酸序列多重比对分析"图
$
#发
现!它们之间有较高的同源性!
FL?/F
氨基酸序列
与彩叶草"
/E-,)*,:#
#的一致性达到了
,f
!与
紫苏 "
/1-%+)*+:#
#藿香 "
//a#*%)":#
#达到
+f
&这进一步证实克隆获得的是独一味的
!"#
基因&表明不同植物
?/F
蛋白序列存在高度保守
序列!但也有较明显的长度和组成上的变异性&可
见苯丙氨酸解氨酶作为植物苯丙烷类化合物生物合
成途径中的第一个关键酶!在进化的过程中保持了
足够的遗传稳定性和演化趋同性&
为了研究独一味
FL?/F
与其他植物
?/F
的进
图
%
!
#$!"#
基因在各器官中的相对表达量
E4
O
:%
!
>RMLM53V4ZMM_
C
LMXX47978#$!"#
O
M9M49XMZML357L
O
39X
化关系!用
053XV35_#:$
软件对氨基酸序列比对
后!通过
W1
法构建氨基酸序列的进化树!结果"图
)
#显示!独一味
?/F
与彩叶草藿香丹参紫苏
黄芩
?/F
聚为一类!其与彩叶草亲缘关系最近&从
进化树上看!相同科或类群的植物聚为一类!如唇形
科"
F3B43V3M
#豆科"
FM
O
Q2497X3M
#伞形科"
P2BM5(
548ML3M
#茄科"
I75393;M3M
#蔷薇科"
=7X3;M3M
#十
字花科"
.L3XX4;3;M3M
#禾本科"
GL3249M3M
#&但不
同植物间
?/F
也有很高的一致性!这也可推测其在
进化过程中是相当保守的&独一味与水稻小麦问
荆"
D
@
5,0-5&%$:03,0
#的亲缘关系较远&
=!
1(2!1
基因的组织特异性表达
根据唇形科植物
"7-3
基因保守序列设计的特
异引物
"7-3E#
和
"7-3=#
!扩增独一味
"7-3
基
%%$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
因片段!
=>(?0=
结果"图
*
#显示独一味
"7-3
基因
片段为
$$"B
C
&根据获得的独一味
"7-3
基因的编
码序列!设计荧光定量引物
"7-3KE#
和
"7-3
K=#
作为进行荧光定量的内参基因&
以独一味肌动蛋白基因
"7-3
为参照!运用
=M35(>42M?0=
分析
+
月中旬独一味的根茎叶
片叶柄
)
个不同组织中
!"#
基因的表达特性&
结果"图
%
#显示!独一味
!"#
基因在叶片中表达量
最高!其次在根部!在茎中表达量最低&根叶柄茎
!"#
表达量分别是叶片的
++f

#*f
和
":f
&
说明
!"#
基因在不同组织中的表达有差异&
$
!
讨
!
论
苯丙氨酸解氨酶能够催化莽草酸途径产生的
F(
苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸!是苯丙氨酸代谢
途径的限速酶和关键酶(!*)&莽草酸进入苯丙烷代
谢途径可以生成香豆酸芥子酸和阿魏酸等中间产
物!进一步可转化为绿原酸香豆素和
07/
酯等!这
些是形成木质素类黄酮和生物碱等次生代谢产物
的前体物质($)!这些物质在植物的生长发育色素形
成抗病抗虫和抗逆等具有重要的作用&
!"#
基
因在多种植物中已被克隆和鉴定!本研究以唇形科
植物的
!"#
基因保守序列设计特异性引物!采用
=>(?0=
和
=/01
技术从独一味叶中克隆了
#
个
!"#
基因全长的
;@A/
序列!命名为
#$!"#
&预
测获得基因的理化性质参数和二级结构等!分析了
其在不同物种间的进化关系及在不同组织中的表达
特性&
经在
A0.H
网站上进行结构预测分析!
FL?/F
含有苯丙氨酸*组氨酸解氨酶蛋白激活位点和保守
结构域&同时
.53XV
C
氨基酸序列比对也表明!
FL(
?/F
含有保守的脱氨基位点即
F()!

J()!,

F(
)+"
和
/()+#
%保守的催化激活位点即
A()$*

G(
)$%

T()++
和
TAN@J
"
))
"
)33
#&这些激活
位点与拟南芥和烟草的
?/F
的催化和脱氨基位点
相一致(#)!%)&分析表明在
FL?/F
氨基酸序列
0(
端
有
!
个双亮氨酸基元
FF
"
%!+
"
%!33
和
%,,
"
+""
33
#!同时该蛋白
A(
端没有蛋白定位信号肽!是一个
可溶性蛋白&蛋白质功能结构域预测结果显示该基
因含有苯丙氨酸和组氨酸解氨酶的标志性模式"
#)
"
!""
#!序列为
G>H>/IG@FJ?FIKH/G
!包埋在
酶的活性中心&可见独一味
#$!"#
是典型的苯丙
氨酸解氨酶!是
?/F
蛋白质家族的一员&同源性分
析显示独一味
#$!"#
编码的氨基酸序列与其他物
种
?/F
具有很高的一致性!进化树分析发现相同科
或类群的植物聚为一类!独一味
#$!"#
与彩叶草
藿香等唇形科植物亲缘关系最近!同时发现不同植
物间
!"#
间也有很高的一致性!推测
?/F
作为苯
丙烷代谢途径的第一个关键酶在进化过程中保持了
足够的遗传稳定性和演化趋同性!这与前人的研究
结果吻合(!+)&这里利用分子生物学分析结果可以
为生物进化研究提供一定的科学参考&
组织特异性表达的荧光定量分析发现克隆的独
一味
#$!"#
在叶中表达量最高!其次在根部!在茎
中表达量最低!为组成型表达!这与前人研究的国
槐(!)黄芪(!,)等植物
!"#
表达模式相同&
?/F
是
由一个基因家族控制的!不同组织有多种同工酶!不
同成员表达特性不同!定位组织不同!参与的代谢途
径不同($"($!)&本研究中
!"#
基因在独一味不同组
织中的表达有差异!可能行使不同的功能&说明该
基因对植物正常生长发育有重要功能&
苯丙氨酸解氨酶催化
F(
苯丙氨酸解氨生成反
式肉桂酸!是苯丙氨酸代谢途径的关键酶和限速酶!
?/F
影响植物次生代谢产物如黄酮的合成!独一味
是青藏高原特有的一种中藏药!独一味类黄酮具有
一定的生物或药用效能!因此独一味次生代谢过程
中相关基因的克隆和鉴定对其生物工程改良黄酮含
量具有很大的推动作用&希望本研究结果对于深人
研究独一味类黄酮物质代谢的分子调控!以及利用
基因工程技术提高独一味的抗性或药用价值产生积
极影响&
参考文献!
(
#
)
!
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"王瑞冬#!
IPAFA
"孙连娜#!
>/D0TK
"陶朝阳#!
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(
S
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:"7%20&7<(5$1
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"第二军医大学学报#!
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#"
#$
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:
(
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)
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王文芳
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独一味有效部位提取纯化及化学成分研究(
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)
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天津$天津大学!
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"程水源#!
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"陈昆松#!
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"刘卫红#!
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