全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#$+"(+!#
&修改稿收到日期$
!"#$+")+#1
!!
基金项目$中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金"
2344!"#$56#$
#&国家现代农业产业体系项目"
789:+%!
#
!!
作者简介$李健平"
#&&"*
#!男!在读硕士研究生!从事植物分子生物学研究
;+<=.>
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A
?@B"
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通信作者$金志强!研究员!从事植物分子生物学研究!
;+<=.>
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G
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A-
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=FDD,CD<,C0
香蕉类甜蛋白基因
1$234$
的克隆与表达分析
李健平#!王
!
卓!!徐碧玉!!金志强!!%"
"
#
海南大学!海口
$##"#
&
!
中国热带农业科学院热带生物技术研究所!海口
$##"#
&
%
中国热带农业科学院海口实验站!海口
$"#"!
#
摘
!
要$在香蕉
;:3
文库中!通过
987;
技术克隆到
#
个香蕉类甜蛋白基因的全长序列该序列最大开放阅读框
&(!I
J
!编码
%#%
个氨基酸
4>=/B
分析发现!它与其他类甜蛋白相似度为
$),#"K
!含有类甜蛋白"
3LM/
#特有的保
守结构域!命名为
!"#$%#
系统进化树表明!
!"#$%#
基因编码蛋白与海枣的亲缘关系较近!与香蕉的进化模
式相似组织特异性分析表明!
!"#$%#
在根(球茎(假茎中的表达量高!叶中较弱!花和果实中微量表达实时荧
光定量
M79
分析显示!在抗病香蕉品种中!接种尖孢镰刀菌古巴专化型"
&(")*+,-
.
(
/
,)+N,/
J
,0123(2
!
ODC
#
枯萎病菌后
!"#$%#
基因上调表达!在感病香蕉品种接菌
!P
后
!"#$%#
基因受到抑制!虽然在接菌
(P
后上调
表达!但是相对于抗病品种上调较小研究表明!
!"#$%#
基因可能在香蕉抗枯萎病的过程中起作用
关键词$类甜蛋白&香蕉&克隆&表达
中图分类号$
Q1)
&
Q1&
!!!
文献标志码$
8
%&"#
(
)!*+
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1
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J
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V
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#
05/6-)76
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J
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J
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V@0C@F=/=F.
A
F.P@0B.B
H
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J
?DB@.0/
"
3LM/
#
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/
J
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H
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"
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#
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J
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!
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J
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A
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.
(
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J
,0123(2
"
ODC
#
=0P]=/N>VCBV=B@P0DBDIZ.DV/>
H
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J
B.I>@I=0=0=CV>B.Z=?/?@>=B@PBD?@/./B=0BCV>B.+
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J
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A
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J
=BFD
A
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J
,0123(2,
8.
1
9"-!/
$
BF=V<=B.0+>.[@
J
?DB@.0
&
I=0=0=
&
C>D0@
&
@J
?@//.D0
!!
香蕉在很多发展中国家中是主食!同时也是重
要的经济来源在许多农业发达的拉丁美洲(非洲
和亚洲的国家!香蕉是一种重要出口产品在世界
贸易中!香蕉在重要农作物中排第五位)#*但全球
香蕉产量却受到病害制约!其中严重的就有香蕉枯
萎病!它是由尖孢镰刀菌古巴专化型"
&(")*+,-:
.
(
/
,)+N,/
J
,0123(2
!
ODC
#引起的)!*
当植物遭受病原菌侵染时!会激活很多基因!其
中就包括病程相关"
J
=BFD
A
@0@/./+?@>=B@P
!
%;
#基
因
%;
基因编码蛋白根据氨基酸序列的相似度!
血清学交叉关系和生物学功能分为
#
个家族)%!(*
其中
M9$
蛋白!又称类甜蛋白"
3LM/
#!包含一段类
似甜蛋白的保守结构域
3LM/
具有抵抗病原菌的
作用!通过使真菌细胞膜透化!进行一系列酶反应破
坏病原菌细胞壁来达到抵抗病原菌的效果)$!)*有
许多报道称
3LM/
能抵抗生物胁迫在许多转基因
的农作物中表达的
3LM/
对不同的真菌都具有抗
性)!1*智利草莓中
!
个
3LM
在对抗葡萄孢菌
<,4)
.
4*(0*32)2"
的侵染中可能起到了作用!而且它
们是组织特异性)&*棉花
=1#$%#
转到烟草后对
黄萎病菌"
>97"65*"2
#和 尖孢镰刀菌"
&9,-
.
(
/
,:
)+
#有着显著的抗性)#"*在引起稻瘟病的水稻中!
植物特异的整体抗性"
]FD>@
J
>=0B+/
J
@C.N.C?@/./B+
=0C@
!
SM:9
#对稻瘟病菌"
!"
?
3"
/
,)462,)
.
@"2
#起
到了抵抗的作用!
3LM/
可能参与其中!它可能与
SM:9
表达有关)##*除了抵抗生物胁迫外!
3LM/
还能抵抗非生物胁迫)#!*
本研究以巴西蕉"
!(""0+*3"4"/VI/
J
,+":
5"0023(*(
#为材料!通过
987;
技术克隆得到香蕉
!"#$%#
基因!利用生物信息学的方法分析该基因
的序列特征!采用实时荧光定量
M79
技术!研究在
香蕉枯萎病胁迫下该基因的表达情况!为今后深入
研究香蕉类甜蛋白在香蕉抵抗枯萎病过程中的功能
及香蕉抗枯萎病育种的分子机理提供一定的依据
#
!
材料和方法
$,$
!
实验材料及处理
本研究所用实验材料为感病品种巴西蕉"
!("
"0+*3"4"L,888
A
?DV
J
!
CZ,7=Z@0P./F
#和抗病品
种+农科
#
号,香蕉枯萎病生理
(
号小种 "
ODC
39(
#为本实验室保存香蕉小苗在
YD=
A
>=0P
溶
液 "
J
Y),"
#中生长!生长条件为温室中
!$
"
%!a
!
光周期为
#)F
光%
1F
暗用
ODC39(
孢子悬浮液
"
#,"b#"
)
CD0.P.=
%
#侵染五叶一心的感病与抗
病香蕉苗
!F
后!分别移栽在花盆中选
ODC39(
侵染
"
(
!
( 和
)P
的香蕉根作为实验材料!液氮速
冻后于
*"a
冰箱保存待用每个点取
#"
株苗的
根系冻存
"P
选取未受
ODC39(
侵染的香蕉苗
$,:
!
方
!
法
$;:;$
!
香蕉根系总
<=0
提取
!
采用
S=0
等)#%*的
方法提取总
9T8
再用
T^=/@
#
"
3=c=9=
#处理总
9T8
!除去
9T8
中可能含有的
T^8
污染!然后再
用
M?.<@:C?.
J
B
$
#/B:B?=0PC^ T8:
H
0BF@/./c.B
"
3=c=9=
#以
",1
%
A
总
9T8
为模板!以
>`.
A
D
"
P3
#
#)
为引物合成第一链
C^ T8

$;:;:
!
>?@<0%*
克隆
!
按照
987;
克隆试剂盒
"美国
4^
公司#说明书!进行
%d+987;
克隆利用
试剂盒合成
%d+9@=P
H
C^ T8
!并根据获得的已知序
列设计
!
条反向嵌套
M79
引物
M#
和
M!
"表
#
#!正
向引物
X_M
为试剂盒所带!用
X_M
和
M#
引物对
%d+987;
进行第
#
轮
M79
反应取
#
%
L
做模板!
用
X_M
和
M!
引物进行第
!
轮
M79
反应
$;:;>
!
A?@<0%*
克隆
!
用试剂盒合成
$d+9@=P
H
C^ T8
!并根据香蕉根转录组获得的已知序列!设计
!
条反向嵌套
M79
引物
M%
和
M(
"表
#
#正向引物
X_M
为试剂盒自带!用
X_M
和
M%
引物对
$d+
987;
进行第
#
轮
M79
反应取
#
%
L
做模板!用
X_M
和
M(
引物进行第
!
轮
M79
反应
$;:;B
!
全长
7C=0
扩增
!
将
%d+987;
和
$d+987;
扩增获得的
%d
端和
$d
端
C^ T8
序列在
e@CBD?T32
1,"
上进行拼接!获得全长
C^ T8
序列!并根据该序
列设计全长克隆的两端引物
M$
和
M)
"表
#
#扩增全
长
C^ T8

M79
反应体系包含
!
%
LC^ T8
!
$
%
L#"
bM79IVNN@?
!
(
%
LPT3M/
"
!,$<
%
L
#!
(
%
L
_
A
7>
!
!
",$
%
L3=
G
酶!
%
LM$
!
%
LM)
!加水至
$"
%
L

M79
反应程序为
&(a
预变性
#"<.0
&
(a
变
性
("/
!
$a
退火
("/
!
!a
延伸
!<.0
!
%$
个循环&
!a
延伸
#"<.0

$,:,A
!
克隆与测序
!
M79
产物用低熔点琼脂糖凝
胶电泳纯化和回收目的扩增片段在
3( T^8
连
接酶作用下!将回收的
T^8
片段插入
J
_ #^1+3
载
体!构建重组质粒!转化到大肠杆菌
Y^$
&
!取阳性
菌落送上海生工公司测序
表
$
!
香蕉
1$234$
克隆引物
3=I>@#
!
7>D0.0
AJ
?.<@?/DNI=0=0=
A
@0@!"#$%#
引物名称
M?.<@?
引物序列
M?.<@?/@
G
V@0C@
"
$d
#
%d
#
用途
MV?
J
D/@
M#
M!
7737U3UU87UU7387887
773777U83U73UU3UU3
%d+987;
M%
M(
3873UUUU7U8377U888
778U7837UUU8UU33U3
$d+987;
M$
M)
883U873U8U88373UU7783
78338783783UU733U38U
全长扩增
OV>C^ T8C>D0@
(#
&
期 李健平!等$香蕉类甜蛋白基因
!"#$%#
的克隆与表达分析
$,:,D
!
基因编码蛋白的生物信息分析
!
根据
_=3LM#
的蛋白序列!利用
;\M8:
H
M?DM=?=
软件对其进行分析运用
T742
的
7D0/@?Z@P D^+
<=.0:@=?CF:@?Z.C@
"
7^ :@=?CF
#软件分析其保守
区域使用
T742
上的
4>=/B比对寻找与其相似的
序列!构建系统进化树
$;:;E
!
1$234$
组织特异性分析
!
采用
S=0
等)#$*
的方法分别提取根(球茎(假茎(叶(花和果实的
9T8
!再用不含
9T=/@
的
T^=/@
#
"
3=c=9=
#处理
各器官的总
9T8
!除去
9T8
中可能含有的
T^8
污染!然后再用
M?.<@:C?.
J
B
$
#/B:B?=0PC^ T8
:
H
0BF@/./c.B
"
3=c=9=
#分别以各个器官
",1
%
A
总
9T8
为模板!以
>`.
A
D
"
P3
#
#)
为引物合成第一链
C^ T8
以
C^ T8
为模板!用基因特异引物进行基
因特异性
M79
基因特异引物为
M&
"
$d+8U77+
U37U37738737778+%d
#和
M#"
"
$d+7U88U8+
33373UU733U3UU3+%d
#!采用
8CB.0#
作为内
参!特异引物为
M##
"
$d+7U8UU7378837888+
U8+%d
#和
M#!
"
$d+8778U788UU3778887+%d
#
$;:;F
!
实时荧光定量
G%<
!
实时荧光定量
M79
使用
3=9=c=
公司的试剂盒!染料为
:649U?@@0
!
在吉泰生物科技公司
_\%""$M
荧光定量
M79
仪
上进行以香蕉
8CB.0#
片段为内参!以前文方法
#,!,#
提取出的
C^ T8
第一链为模板所用的
!"#$%#
引物为
M&
"
$d+8U77U37U37738737+
778+%d
#和
M#"
"
$d+7U88U833373UU733U3+
UU3+%d
#!
8CB.0#
引物
M##
"
$d+7U8UU737883+
7888U8+%d
#和
M#!
"
$d+8778U788UU3778+
887+%d
#!荧光定量
M79
反应程序为
&$a
预变性
%
<.0
&
$a
变性
/
!
$a
退火
#"/
!
!a
延伸
%"/
!循
环
("
次使用
:B?=B=
A
@0@_\%"""M<=CF.0@
"
L=
RD>=
!
78
!
X:8
#进行
QM79
反应!每一个样品设
%
个重复扩增检测完后得到的数据使用
_\M?D3_
QM79/DNB]=?@
"
:B?=B=
A
@0@
#进行分析
!
!
结果与分析
:;$
!
1$234$
基因全长扩增和序列分析
以香蕉
;:3
文库中获得的序列设计特异引物
"表
#
#分别进行
%d+987;
和
$d+987;
!对得到的序
列进行拼接!获得
_=3LM#
全长序列"图
#
#序列
分析表明该基因全长
#"#&I
J
"图
!
#!包含
&(!I
J
完 整开放阅读框!编码
%#%
个氨基酸!分子量是
图
#
!
!"#$%#
全长序列
M79
扩增结果
_,^L!"""
&
#,!"#$%#
O.
A
,#
!
M79?@/V>B/DNNV>>@0
A
BF/@
G
V@0C@DN!"#$%#
图
!
!
香蕉
!"#$%#
基因序列及编码氨基酸序列
O.
A
,!
!
TVC>@DB.P@=C.P=0PP@PVC@P=<.0D=C.P/@
G
V@0C@/DN!"#$%#N?D1(#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
%
!
_=3LM#
的氨基酸序列与其他
3LM
氨基酸序列比较
黑框内为保守结构域!灰色区域为部分
3LM
共有氨基酸残基!黑色区域为全部
3LM
共有氨基酸残基&
OZ3LM,
野草莓"
WM
-
""(!&#%$%,#
#&
T03LM,
荷花"
WM
-
"#"!#$$),#
#&
MP3LM,
海枣"
WM
-
""11#""(,#
#&
5<3LM,
玉米"
8OS1)&!1,#
#&
:.3LM,
粟"
WM
-
""(&1$"!1,#
#&
:I3LM,
高粱"
WM
-
""!(%1$)%,#
#&
MZ3LM,
菜豆"
WM
-
""#)")(1,#
#&
/`3LM,
水稻"
TM
-
""#"(&$%%,#
#
O.
A
,%
!
8<.0D=C.P/@
G
V@0C@=>.
A
0<@0BDN_=3LM#].BF3LMFDD
A
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J
>=0B/
4>=C[N?=<@/FD]/CD0/@?Z@PPD<=.0,U?@
H
=?@=/FD]//F=?@P=<.0D=C.P?@/.PV@/DN
J
=?B.=>3LM/,4>=C[=?@=/FD]//F=?@P=0.DN=>3LM/
&
OZ3LM,&)"
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")*"A2(0"
"
WM
-
""(!&#%$%,#
#&
T03LM,B25+1,30*
8
2)"
"
WM
-
"#"!#$$),#
#&
MP3LM,%6,23*-7"04
.
5*
8
2)"
"
WM
-
""11#""(,#
#&
5<3LM,C2"+"
.
(
"
8OS1)&!1,#
#&
:.3LM,D24")*"*4"5*0"
"
WM
-
""(&1$"!1,#
#&
:I3LM,D,)
?
6+1*0,5,)
"
WM
-
""!(%1$)%,#
#&
MZ3LM,%6"(2,5(A5
?
")*(
"
WM
-
""#)")(1,#
#&
/`3LM,E)
.
@"("4*A"
"
TM
-
""#"(&$%%,#
#
,
图
(
!
_=3LM#
与其他植物
3LM
的遗传进化树
节点上的数值表示
IDDB/B?=
J
重复
#"""
次的置信度
O.
A
,(
!
MF
H
>D
A
@0@B.CB?@@DN_=3LM#=0PDBF@?3LM/
e=>V@/=B0DP@//FD]BF@CD0N.P@0C@>@Z@>DNIDDB/B?=
J
?@
J
>.C=B.D0#"""
&(#
&
期 李健平!等$香蕉类甜蛋白基因
!"#$%#
的克隆与表达分析
%!"%,$ =^
!理论等电点
(,%1
用
T7427^ :@=?CF
工具发现它的保守区域包含
!%"
个氨基酸残基!属于
植物和动物同源的抗真菌类甜蛋白亚家族"
=0B.NV0
A
=>
BF=V<=B.0+>.[@
J
?DB@.0/
$
J
>=0B=0P=0.<=>FDD
A
/
#!
此保守结构域是该亚家族的特有特征"图
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#用
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软件进行序列比对发现与其他
3LM
氨基
酸序列相似度仅达
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氨基酸序列的进化分析
为研究
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氨基酸序列的进化情况!使用
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软件的
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A
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A
将
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条不同物
种的
3LM
氨基酸序列绘制成遗传进化树结果"图
(
#显示!进化树大致分为两个分支!上支是双子叶植
物!下支是单子叶植物在进化关系上!香蕉
_=3LM#
与海枣
MP3LM
最近!与其他单子叶植物
玉米
5<3LM
(高粱
:I3LM
(粟
:.3LM
和稻
/`3LM
亲缘关系较近!与双子叶植物毛果杨
MB3LM
(葡萄
eZ3LM
(野草莓
OZ3LM
等亲缘关系较远
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的组织特异性表达
为了确定
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在香蕉中的表达模式!在不
同组织中进行了半定量
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半定量
93+M79
检测
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在香蕉
不同部位中的表达情况
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$
#!但主要
集中在根(球茎和假茎中表达!叶中表达略低!花和
果实中只有微量表达
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!
实时荧光定量
G%<
实时荧光定量
M79
结果表明!
!"#$%#
在接
种枯萎病菌的巴西蕉"感病品种#中表达趋势先降低
后升高再降低!总体变化不大"图
)
#在+农科
#
号,"抗病品种#中表达趋势先升高后降低!表达量总
体增大!在
(P
达到最大!表达量与对照相比高
!(
倍"图
)
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%
!
讨
!
论
3LM/
在参与植物抵抗真菌的过程中发挥着重
要的作用)#(*
3LM
蛋白对不同的真菌具有抗
性)#$+#*在很多高等植物中!
3LM
基因在病原菌胁
迫下上调表达)#1*中国甘蓝中的
!"
个
3LM
基因
在接种死体营养型细菌后的
G
93+M79
中有
!
个
3LM
基因被抑制了!表明这
!
个
3LM
基因可能参
与了抗菌过程)#&*在转基因水稻中过表达水稻的
#
个
3LM
基因表现出对立枯丝核菌"
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5"3*
#的抗性)!"*&转入了
#
个
3LM
基因的烟草对烟
草赤星病菌"
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#表现出抗性)!#*
在转基因拟南芥中过表达
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表现出对甘蓝
链格孢菌"
F542)3")*"1)"((*0*0,5"
#的抗性)!!*这
些结果都表明
3LM
在植物抵抗许多病原菌过程中
起到了重要作用
本实验克隆得到的
!"#$%#
含有
3LM
特有的
保守结构域!在系统进化树上!与其他单子叶植物的
3LM
蛋白聚为一支!在进化关系上与海枣最近!与双
子叶植物亲缘关系较远!这些结果都与
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A
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G
V@
等
研究结果一致)!%*!表明克隆获得的
!"#$%#
确实是
香蕉的
3LM
基因
ODC39(
是一种侵染根的病原
菌!组织特异性表达结果表明!
_=3LM#
集中在根茎
中表达!可能与香蕉在被侵染部位抵抗病原菌有关
荧光定量分析结果发现在接种
ODC39(
的抗
ODC
39(
品种中!
!"#$%#
表达量明显增高!最高达对照
的
!$
倍!表明
!"#$%#
在
ODC39(
胁迫下激活而
在同样处理下的感病品种中!接菌
!P
后它的表达量
下调!虽然在接菌
(P
后的表达量上调!但相比抗病
品种上调较小!这说明在感病品种中接
ODC39(
后
!"#$%#
的表达量发生了变化!但变化幅度相较抗病
品种并不明显以上结果说明
!"#$%#
参与香蕉抵
抗
ODC39(
的过程!但是调控方式和作用机制还不清
楚!需要进一步的试验来探讨
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