全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2014)06 － 2402 － 03 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2014． 06． 028
收稿日期:2014 － 01 － 13
基金项目:国家自然科学基金(31160377);国家科技支撑计划
(2012BAK01B05)
作者简介:柳志强(1980 －)，男，副教授，博士，主要从事微生物
学研究，E-mail:liuzhiqiang@ hainu． edu． cn，* 为通讯作者。
阴香内生细菌 YX6 的鉴定及对香蕉炭疽病的防效
柳志强，郑 媛，吴亚腾，李晓宇*
(海南大学环境与植物保护学院，海南 海口 570228)
摘 要:香蕉炭疽病是我国香蕉采后贮藏、运输、销售过程中发生的主要病害之一，为筛选出对其有较好防治效果的生防菌，本文
以香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)为靶标菌，利用平板对峙生长法从阴香体内分离到一株对香蕉炭疽菌拮抗作用较强的菌株
YX6，利用常规方法结合 16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定，并测定了其对感病香蕉的防病效果。结果表明:菌株 YX6 的皿
内拮抗活性达 53 %，菌株鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，经测定该菌株发酵液及其滤液对感病香蕉果实均有显著的防病效
果，防效分别为 51． 35 %和 45． 95 %。
关键词:阴香;内生细菌;香蕉炭疽菌;防治效果
中图分类号:Q939． 95 文献标识码:A
Study on Identification of Cinnamomum burmannii Endophytic Bacterial
Strain YX6 and Its Control Effect on Colletotrichum musae
LIU Zhi-qiang，ZHENG Yuan，WU Ya-teng，LI Xiao-yu*
(College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Hainan Haikou 570228，China)
Abstract:Calletotrichum musae is one of the main disease within postharvest storage，transportation and sale of banana． To screen a bio-con-
trol bacteria with better control effect against this disease，strain YX6，screened from Cinnamomum burmannii using confrontation growth，
had higher antagonistic effect against Colletotrichum musae． The strain was identified by conventional method and 16S rDNA sequence analy-
sis，and its control effects to infected banana were also determined． The results showed that:the antagonistic activity of YX6 was 53 % in
plate，and the strain was identified as Bacillus cereus． Its fermentation broth and fermentation filtrate had marked control effects on infected
banana fruits，and the control effects were up to 51． 35 % and 45． 95 %，respectively．
Key words:Cinnamomum burmannii;Endophytic bacteria;Colletotrichum musae;Control effect
阴香(Cinnamomum burmannii)属樟科、樟属，多
年生常绿乔木，长势旺，抗逆性强，在我国主要分布
于福建、广东、广西、海南等地，是华南地区的优良行
道树种与良好的生态树种［1］。目前有关阴香的研
究多集中在阴香体内活性物质提取及应用方面［1］，
对其内生菌及其活性物质的研究较少。谢颖等从阴
香体内分离出内生细菌、内生放线菌和内生真菌，通
过筛选发现内生菌 YXG2-3 对香蕉枯萎病菌具有较
好的抑制效果，盆栽实验防效达到 63． 8 %［2］。
香蕉炭疽病是由香蕉炭疽菌(Colletotrichum
musae)侵染引起的，是我国香蕉采后贮藏、运输、销
售过程中发生的主要病害之一，严重影响我国香蕉
的北运和出口。目前，防治香蕉炭疽病仍以化学杀
菌剂为主，但长期使用化学杀菌剂不仅使香蕉炭疽
菌产生抗药性，而且农药残留也会导致环境污染及
威胁人类健康等问题，因此研究安全有效的防治措
施势在必行，其中生物防治是最有应用前景的措施
之一［3］。本研究从阴香体内分离出一株内生细菌
YX6，发现其对香蕉炭疽菌具有较好的拮抗效果，利
用常规方法结合 16S rDNA 序列分析对该菌株进行
了鉴定，并测定了其对感病香蕉的防病效果，为其今
后应用奠定了一定的基础。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
阴香采自海南大学儋州校区，香蕉炭疽菌(C．
2042
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2014 年 27 卷 6 期
Vol. 27 No. 6
musae)由海南大学环境与植物保护学院提供，内生
细菌 YX6 从阴香中经组织表面消毒分离获得。
1． 2 培养基
LB培养基:胰蛋白胨 10 g、酵母粉 5 g、NaCl 10
g、蒸馏水 1 L;PDA培养基:马铃薯 200 g、葡萄糖 20
g、琼脂 20 g、蒸馏水 1 L。
1． 3 菌株培养
菌株 YX6 经活化后接入 LB 培养基，30 ℃，180
r /min 振荡培养 2 d，收集发酵液，5000 r /min 离心 5
min，将上清液利用 0． 22 μm 的滤膜除菌过滤，得到
发酵滤液。
1． 4 菌株 YX6 皿内拮抗活性测定
在直径 9 cm的 PDA平板中央接种 1 块直径为
5 mm香蕉炭疽菌的菌饼，菌丝面朝下，同时在菌饼
两侧 2 cm处各接入一环内生细菌 YX6，以不接内生
细菌为对照，每处理 3 次重复，28 ℃培养 3 ～ 4 d，十
字交叉法计算皿内拮抗活性。
1． 5 菌株 WYG5 的鉴定。
常规鉴定参照文献［4］的方法进行。
菌株基因组 DNA 提取利用 OMEGA D3350-
01Bacterial DNA Kit(50)试剂盒，利用 16S rDNA 通
用引物 (Primer1:5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-
3，Primer2:5-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3)进
行基因扩增，由上海英骏生物技术有限公司进行序
列测定，将所测序列在 GenBank 中(http:/ /www．
ncbi． nlm． nih． gov)进行 Blast 分析，根据 Blast 结果
利用 MEGA5． 0 软件以邻近相接法(Neighbor-join-
ing，NJ)构建系统进化树。
1． 6 菌株 YX6 发酵液对感病香蕉果实防效测定。
选用七、八成熟的香蕉果实用自来水清洗干净，
室内阴干，75 %的乙醇擦拭表面，用束针刺伤果皮，
每根香蕉刺 3 个点。然后在刺伤处接种直径为 5
mm的香蕉炭疽菌菌饼，室温保湿培养至香蕉针刺
处感病，备用。将 3 片直径为 5 mm的浸有菌株
图 1 菌株 YX6 对香蕉炭疽菌的拮抗作用
Fig． 1 Antagonism of strain YX6 to C． musae
YX6 发酵液或滤液的滤纸片覆盖于发病处，以浸有
发酵培养液和无菌水的滤纸处理作为对照 1 和对照
2，每处理 3 根香蕉，室温保湿培养 7 ～ 8 d，按下列公
式统计病情指数及病情控制效果。
病情指数 =［Σ(病级斑点数 ×该病级值)］/(
接种点数 ×最高级值 ) × 100;
病情控制效果 =(对照组病情指数-处理组病情
指数)/对照组病情指数 × 100 %。
病斑分级标准:0 级:刺伤点感病，未连成片;1
级:病斑连成片，病斑直径在 5 mm 以下;2 级:病斑
直径在 5 ～ 7 mm;3 级:病斑直径在 7 ～ 10 mm;4 级:
病斑直径在 10 ～ 15 mm;5 级:病斑直径在 15 mm以
上。
2 结果与分析
2． 1 菌株 YX6 皿内拮抗活性的测定
采用对峙划线法测定菌株 YX6 对香蕉炭疽菌
的皿内拮抗活性(图 1)。内生细菌 YX6 对香蕉炭
疽菌有明显的拮抗作用，能够有效抑制病原菌菌丝
在 PDA培养基中的扩展，抑制率达到 53 %。
2． 2 菌株 YX6 的鉴定
菌株 YX6 在平板上菌落近圆形，边缘波状，表
面有疣状突起，菌体杆状，菌体大小约为 1． 0 ～ 3． 1
μm，革兰氏染色阳性，中生芽孢，周生鞭毛。参照参
考文献［4］对菌株 YX6 部分生理生化测定了测定(表
1)。菌株 YX6 的形态和生理生化特征与东秀珠
等［4］描述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)特征相
同。
对菌株 YX6 的 16S rDNA 序列进行 PCＲ 扩增，
产物经纯化后测序，得到 1578 bp 的碱基序列。将
16S rDNA 序列进行 BLAST 分析，发现其与多株蜡
状芽 孢 杆 菌 菌 株 (GenBank 登 录 号 分 别 为
JF833090、GU982920、GQ381280、KF150385、
表 1 内生细菌 YX6 部分生理生化特征
Table 1 The partial physiological and biochemical characteristics of
strain YX6
测试项目
Test items
结果
Ｒesults
测试项目
Test items
结果
Ｒesults
接触酶 + 葡萄糖发酵 产酸不产气
淀粉水解 + V-P测定 +
柠檬酸盐利用 + 甲基红试验 +
苯丙氨酸脱氨酶 － 吲哚试验 +
明胶液化 + 硝酸盐还原 +
厌氧生长 + 2 ～ 7% NaCl +
注:“ +”阳性，“ －”阴性。
30426 期 柳志强等:阴香内生细菌 YX6 的鉴定及对香蕉炭疽病的防效
0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000
Bacillus megaterium
Bacillus aryabhattai
Bacillus licheniformis
Bacillus thuringiensis
YX6
Bacillus cereus
Bacillus pumilus
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus subtilis
图 2 基于 16S rDNA序列构建的菌株 YX6 的系统发育树
Fig． 2 Phylogenetic tree of strain YX6 based on 16S rDNA sequences
KF150388 等)的同源性均为 99 %以上。选取 Gen-
Bank中的 8 株芽孢杆菌属的细菌与菌株 YX6 一起，
利用软件 MEGA 5． 0 构建出基于 16S rDNA 序列的
系统发育树(图 2)。菌株 YX6 与蜡状芽孢杆菌(B．
cereus)在进化树的同一支上，同源性最高，结合形态
观察和生理生化特征分析，确定菌株 YX6 为蜡状
芽孢杆菌。
2． 3 菌株 YX6 对感病香蕉果实的防效
在香蕉果实上接种香蕉炭疽菌，使其感染病原
菌后，用菌株 YX6 发酵液及滤液处理果实，室温保
湿培养 7 ～ 8 d，统计病情指数，计算防治效果(表
2)。与对照相比，该菌株发酵液及滤液均能较好的
控制感病香蕉的病情扩展，病情控制效果均达极显
著水平，发酵液相对无菌水的病情控制率达到 51．
35 %，相对发酵培养液达到 43． 75 %;滤液相对无
菌水和发酵培养液的病情控制率分别为 45． 95 %
与 37． 50 %，略低于菌株发酵液的病情控制效果，差
异不显著。
3 讨 论
利用植物内生细菌防治香蕉炭疽病已有报道，
如何红等从辣椒体内分离出 2 株枯草芽孢杆菌(Ba-
cillus subtilis)BS-2 和 BS-1，发现 2 株细菌对香蕉炭
疽菌菌丝生长、分生孢子形成及萌发等有较强的抑
制作用，对香蕉炭疽病防治效果分别达到 90． 0 %和
34． 0 %［5］;陈旭玉等从药用植物蛇足石
表 2 YX6 发酵液和滤液对感病香蕉果实的防效
Table 2 The control effects on infected banana fruits of strain
YX6’s fermentation broth and fermentation filtrate
项目
Items
病情指数
Disease index
防效 1(%)
Control
effects 1
防效 2(%)
Control
effects 2
YX6 发酵液 40． 00 bB 43． 75 aA 51． 35 aA
YX6 发酵液滤液 44． 44 bB 37． 50 aA 45． 95 aA
培养液对照 71． 11 aA 13． 51 bB
无菌水对照 82． 22 aA
杉中筛选出两株对香蕉炭疽病有拮抗作用的内生细
菌 JXS1-6 和 AHL1-1，抑菌带宽分别达到 9 及 4
mm，经初步鉴定发现 2 株细菌均属于伯克霍尔德属
(Burkholderia)［6］;骆焱平等从变叶木中分离出一株
内生细菌 BYG2-5，发现其对香蕉炭疽菌具有较强的
抑制作用，菌株发酵液的病情控制率达到 80． 60
%，经鉴定发现该菌属于岸滨芽孢杆菌(Bacillus
litoralis)［7］。
然而，国内外关于蜡状芽孢杆菌用于香蕉炭疽
病的防治却鲜有报道。蜡状芽孢杆菌是一种在自然
界中广泛分布的好气、中温、产芽孢的杆菌，研究发
现其对水稻稻瘟病菌［8］、黄瓜枯萎病菌［9］、棉花黄
萎病菌［10］、茶轮斑病菌、立枯丝核菌、烟草赤星病菌
和茶云纹叶枯病菌［11］病原真菌的生长有抑制作用。
本研究从阴香体内分离到一株对香蕉炭疽菌拮抗作
用较强的菌株 YX6，通过形态观察、生理生化测定
及 16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为蜡状芽孢
杆菌，该菌株发酵液及发酵滤液对香蕉炭疽病具有
明显防治效果，分别达到 51． 35 %和 45． 95 %，本研
究为进一步研究该菌抑菌活性物质奠定了一定的基
础。
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(责任编辑 李 洁)
4042 西 南 农 业 学 报 27 卷