全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(５): ４６１￣４６８(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣１２￣１１ꎻ 修回日期: ２０１４￣０６￣１５
基金项目: 国家甘薯产业技术体系建设项目资助(ＣＡＲＳ￣１１￣Ｂ￣０７)ꎻ 河南省农业科学院财政预算项目资助
通讯作者: 张振臣ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病毒病害研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｚｈａｎｇｚｈｅｎｃｈｅｎ＠１２６􀆰 ｃｏｍ
第一作者: 王 丽ꎬ女ꎬ吉林省抚松县人ꎬ在读博士ꎬ主要从事植物病毒病害研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗａｎｇｌｉ２０００２０００２０００＠１２６􀆰 ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.００３
甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量
ＰＣＲ检测方法的建立及应用
王 丽１ꎬ３ꎬ王振东１ꎬ乔 奇２ꎬ秦艳红２ꎬ张德胜２ꎬ田雨婷２ꎬ王 爽２ꎬ张立军１ꎬ张振臣２∗
( １沈阳农业大学农学院ꎬ沈阳 １１０１６１ꎻ ２河南省农业科学院植物保护研究所ꎬ河南省农作物病虫害防治重点实验室ꎬ
农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室ꎬ郑州 ４５０００２ꎻ ３南阳师范学院生命科学与技术学院ꎬ南阳 ４７３０６１)
摘要:依据 ＧｅｎＢａｎｋ中登录的甘薯褪绿矮化病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓꎬＳＰＣＳＶ)西非株系(ＷＡ)的核苷酸序列ꎬ
分别设计两对特异性引物和一条 ＴａｑＭａｎ探针ꎮ 以 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ外壳蛋白(ｃｐ)基因的重组质粒为阳性标准质粒绘制标准曲
线ꎬ通过优化反应体系和反应条件ꎬ建立了 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ的实时荧光定量 ＰＣＲ检测方法ꎮ 试验结果表明ꎬ该方法只能检测到
目的病毒ꎬ标准曲线的斜率和相关系数分别为－３􀆰 ２３９ 和 １ꎬ扩增效率为 １０３􀆰 ５６８％ꎮ 最低可检测到约 ３􀆰 ３１ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ 的阳
性质粒ꎬ灵敏度比常规 ＰＣＲ高 １ ０００倍ꎮ 本研究建立的 ＳＰＣＳＶ实时荧光定量 ＰＣＲ方法可用于田间样品的检测ꎬ为 ＳＰＣＳＶ
的早期预警和流行学研究提供了技术手段ꎮ
关键词:甘薯褪绿矮化病毒西非株系ꎻ 荧光探针ꎻ 实时荧光定量 ＰＣＲ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｗｅｓｔ Ａｆｒｉｃａｎ
ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ 　 ＷＡＮＧ Ｌｉ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎ￣ｄｏｎｇ１ꎬ ＱＩＡＯ Ｑｉ２ꎬ ＱＩＮ
Ｙａｎ￣ｈｏｎｇ２ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｄｅ￣ｓｈｅｎｇ２ꎬ ＴＩＡＮ Ｙｕ￣ｔｉｎｇ２ꎬＷＡＮＧ Ｓｈｕａｎｇ２ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｌｉ￣ｊｕｎ１ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎ￣ｃｈｅｎ２　 (１Ｃｏｌ￣
ｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙꎬ Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｈｅｎａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈｅｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｐｅｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌꎬ ＩＰＭ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｎ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｐａｒｔ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ ｆｏｒ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ
ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｎａｎｙａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｙａｎ ４７３０６１ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｗｅｓｔ Ａｆｒｉｃａｎ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ
ｃｈｌｏｒｏｔｉｃｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ (ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ) ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ
ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ􀆰 Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ ｗａｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ
ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ􀆰 Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ａｓ
ｔｅｍｐｌａｔｅꎬ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｔｉａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬ ｐｒｏｂｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｌｏｐｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｗｅｒｅ １ ａｎｄ －３􀆰 ２３９ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ􀆰 Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ
ＰＣＲ ｗａｓ １０３􀆰 ５６８％ 􀆰 Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ３􀆰 ３１ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ. Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ
ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲꎬ ｔｈｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｅｄ １ ０００ ｆｏｌｄ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ􀆰 Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ
ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ ｆｒｏｍ ｆｉｅｌｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏꎬ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ
ｕｓｅｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｗａｒｎｉｎｇ ｏｆ ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｗｅｓｔ Ａｆｒｉｃａｎ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ (ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ)ꎻ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅꎻ ｒｅａｌ￣
ｔｉｍｅ ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４３２􀆰 ４１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０４６１￣０８
　
植物病理学报 ４４卷
　 　 甘薯褪绿矮化病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ
ｖｉｒｕｓꎬＳＰＣＳＶ)为长线形病毒科(Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ)毛
形病毒属(Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ)病毒ꎬ是侵染甘薯的主要病毒
之一ꎮ ＳＰＣＳＶ与甘薯羽状斑驳病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ
ｆｅａｔｈｅｒｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓꎬＳＰＦＭＶ)共同侵染甘薯ꎬ可引起
甘薯病毒病害(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅꎬＳＰＶＤ)的
发生ꎮ ＳＰＶＤ对甘薯产量影响极大ꎬ严重时可造成
９０％以上的产量损失ꎬ甚至绝收ꎬ是甘薯上的毁灭性
病害[１]ꎮ ＳＰＣＳＶ最早报道于 ２０ 世纪 ７０ 年代ꎬ２０１０
年 Ｑｉａｏ等[２]首先报道了 ＳＰＣＳＶ在我国的发生ꎮ 广
东、江苏、四川、安徽等主要甘薯产区先后发现
ＳＰＣＳＶ和 ＳＰＶＤ的发生和危害[３]ꎬ该病毒在我国甘
薯产区有扩散蔓延的趋势ꎮ 对甘薯病毒病害目前尚
无特别有效的化学防治方法ꎬ建立 ＳＰＣＳＶ的早期诊
断技术ꎬ加强对 ＳＰＣＳＶ 和 ＳＰＶＤ 的预警与监测ꎬ尽
早发现病害并采取防控措施ꎬ对于防止该病的蔓延
为害具有重要意义ꎮ 当前用于甘薯病毒检测的常用
方法是酶联免疫吸附(ＥＬＩＳＡ)技术[３ꎬ４]和 ＰＣＲ[３~５]技
术ꎮ ＥＬＩＳＡ技术存在灵敏度低、特异性差等问题ꎬ而
普通的 ＰＣＲ方法不能对病毒进行定量分析ꎮ 实时荧
光定量 ＰＣＲ(ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ)技
术是近几年发展起来的一种新型的核酸定性、定量技
术ꎬ既有普通 ＰＣＲ灵敏、快速的特点ꎬ又可实时监测ꎬ
已应用于多种植物病毒的检测[６ꎬ７]ꎮ 我国尚无
ＳＰＣＳＶ实时荧光定量 ＰＣＲ检测方法的研究报道ꎮ
　 　 ＳＰＣＳＶ基因组为双组分单链正义 ＲＮＡꎬ大小
１７ ｋｂ 左右[８]ꎮ 根据血清学关系和核苷酸序列ꎬ
ＳＰＣＳＶ可划分为东非(ＥＡ)和西非(ＷＡ) ２ 个株
系[９]ꎮ 目前ꎬ侵染我国甘薯的主要是 ＷＡ 株
系[３ꎬ１０]ꎮ 本研究针对 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ的 ｃｐ 基因ꎬ设计
了用于实时荧光定量检测的引物和 ＴａｑＭａｎ 荧光
探针ꎬ建立了 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ的实时荧光定量 ＰＣＲ 检
测方法ꎬ以期为 ＳＰＣＳＶ在我国的流行情况调查、早
期的监测预警以及 ＳＰＣＳＶ与其他病毒互作关系研
究提供技术手段ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 质粒和甘薯病毒材料
　 　 含有 ＳＰＦＭＶ、甘薯潜隐病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌａ￣
ｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓꎬＳＰＬＶ)、甘薯 Ｇ 病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ
ＧꎬＳＰＶＧ)、甘薯脉花叶病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｅｉｎ ｍｏ￣
ｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬＳＰＶＭＶ)ｃｐ基因的重组质粒用于荧光定
量 ＰＣＲ的特异性检验ꎮ 这 ４种重组质粒均由本实
验室构建并保存[４ꎬ１０]ꎮ
　 　 分别在浙江、四川、江苏等地采集具有典型
ＳＰＶＤ症状的甘薯茎蔓栽种于防虫温室中ꎬ用于硝酸
纤维素膜酶联免疫吸附测定(ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ)、常规
ＲＴ￣ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ ３种方法检测效果的
比较ꎮ
１􀆰 ２　 主要试剂与仪器
　 　 ＳＰＣＳＶ 硝酸纤维素膜酶联免疫吸附测定
(ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ)检测试剂盒购自国际马铃薯中心
(ＣＩＰ)ꎮ ＵＮＩＱ￣１０柱式总 ＲＮＡ抽提试剂盒为上海
生工生物工程公司产品ꎻＲＮａｓｅ 抑制剂、Ｍ￣ＭＬＶ
反转录酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ酶购
自大连宝生物技术公司ꎮ 其他试剂为国产分析纯ꎮ
ＤＮＡ 测序由上海生工生物工程公司完成ꎮ 荧光定
量 ＰＣＲ仪为 ＡＢＩ ７５００ 型ꎬＮａｎｏＶｕｅ ＰＬＵＳ 超微量
分光光度计为美国 ＧＥ公司产品ꎮ
１􀆰 ３　 引物和探针的设计及合成
　 　 根据 ＧｅｎＢａｎｋ 中登录的 ＳＰＣＳＶ 核苷酸序列
(登录号:ＦＪ８０７７８５)ꎬ设计扩增 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ ｃｐ 基
因的特异性引物 ＣＳＶ￣ＣＰ￣Ｐ１ 和 ＣＳＶ￣ＣＰ￣Ｐ２ꎮ 在
ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ ｃｐ基因内部设计一对特异性引物和一
条特异性探针(表 １)ꎬ用于荧光定量检测 ＳＰＣＳＶꎮ
引物和探针均由大连宝生物技术公司合成ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ
Ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′→ ３′) Ｌｅｎｇｔｈ / ｂｐ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｌｅｎｇｔｈ / ｂｐ
ＣＳＶ￣ＣＰ￣Ｐ１(Ｆ) ＡＴＧＧＣＴＧＡＴＡＧＣＡＣＴＡＡＡＧＴＣＧＡ ２３
ＣＳＶ￣ＣＰ￣Ｐ２(Ｒ) ＴＣＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧ ２３
７７４
ＣＳＶ￣ＤＬ１(Ｆ) ＧＡＣＴＣＡＧＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＴＡＡ ２０
ＣＳＶ￣ＤＬ２(Ｒ) ＴＧＧＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＣＴＴＧ ２１
１８６
ＣＳＶ￣ｐｒｏｂｅ ＦＡＭ￣ ＡＡＣＴＡＣＡＧＴＣＣＧＡＧＴＡＴＧＣＧＴＣＴＣ￣ＢＨＱ１ ２４
　 Ｆ: Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒꎻ Ｒ: Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ􀆰
２６４
　
　 ５期 王 丽ꎬ等:甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量 ＰＣＲ检测方法的建立及应用
１􀆰 ４　 ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ
　 　 从待检甘薯植株的顶部、中部和底部叶片上各
取直径 １ ｃｍ的叶盘ꎬ混合研磨后点于硝酸纤维素
膜上ꎬ利用 ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ 检测试剂盒对 ＳＰＣＳＶ 进
行检测ꎬ按照试剂盒使用说明进行操作[４]ꎮ
１􀆰 ５　 病毒 ＲＮＡ的提取和 ＲＴ￣ＰＣＲ
　 　 用上海生工生物工程公司的 ＵＮＩＱ￣１０ 柱式总
ＲＮＡ抽提试剂盒ꎬ提取感病甘薯叶片总 ＲＮＡꎮ 用
ＣＳＶ￣ＤＬ２引物反转录合成 ｃＤＮＡ 第一链ꎬ用于实
时荧光定量 ＰＣＲ 检测ꎻ用 ＣＳＶ￣ＣＰ￣Ｐ２ 引物反转录
合成 ｃＤＮＡ 第一链ꎬ再利用正向引物 ＣＳＶ￣ＣＰ￣Ｐ１
进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ ＰＣＲ 反应体系:ｃＤＮＡ ５ μＬ、１０×
ＥｘＴａｑ 缓冲液(含 ＭｇＣｌ２)５ μＬ、２􀆰 ５ ｍｏｌ / Ｌ ｄＮＴＰ
混合物 ２ μＬ、正向引物和反向引物各 １ μＬ、ＥｘＴａｑ
ＤＮＡ聚合酶(５ Ｕ / μＬ)０􀆰 ２５ μＬꎬ补充 ｄｄＨ２Ｏ至总
体积 ５０ μＬꎮ ＰＣＲ 反应条件:９４℃ １ ｍｉｎꎬ５６℃ ３０
ｓꎬ７２℃ １ ｍｉｎꎬ３５ 个循环ꎻ最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
扩增产物经 １􀆰 ０％琼脂糖凝胶电泳、ＵＶＰ凝胶成像
系统观察和照相ꎮ
１􀆰 ６　 荧光定量 ＰＣＲ方法的建立
１􀆰 ６􀆰 １　 标准质粒的制备　 利用 ＲＴ￣ＰＣＲ方法扩增出
ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ 的 ｃｐ 基因ꎬ将纯化后的 ＰＣＲ 产物和
ｐＭＤ１９￣Ｔ载体连接ꎬ转化大肠杆菌 ＴＧ１ꎬ提取质粒ꎮ
经测序验证正确后获得 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ ｃｐ基因的重组质
粒ꎮ 用分光光度计测定重组质粒的浓度和纯度ꎬ根据
阿伏伽德罗常数[ １１]计算出质粒的拷贝数ꎮ 对重组质
粒进行 １０倍连续梯度稀释ꎬ获得 １０倍浓度差的质粒
(１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０)ꎬ
作为 ＳＰＣＳＶ检测用阳性标准品ꎮ
１􀆰 ６􀆰 ２　 反应体系和循环条件的优化　 以 ＳＰＣＳＶ￣
ＷＡ ｃｐ标准质粒 ＤＮＡ(１０－ ４)为模板ꎬ将引物浓度
在 ０􀆰 １ μｍｏｌ / Ｌ ~ ０􀆰 ４ μｍｏｌ / Ｌ 的范围内以 ０􀆰 １
μｍｏｌ / Ｌ 递增ꎻ探针浓度在 ０􀆰 １ μｍｏｌ / Ｌ ~ ０􀆰 ５
μｍｏｌ / Ｌ的范围内以 ０􀆰 １ μｍｏｌ / Ｌ 递增ꎬ筛选引物
和探针的最佳浓度ꎮ 扩增反应总体系为 ２０ μＬꎬ其
中 Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ １０ μＬꎬＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ Ⅱ
０􀆰 ４ μＬꎬ模板 ２ μＬꎬ用灭菌 ＤＥＰＣ 水补足 ２０ μＬꎮ
获得最佳反应体系后ꎬ采用三温循环方式ꎬ对荧光
定量 ＰＣＲ退火温度进行优化ꎬ退火温度分别设为
４９、５２、５５、５８和 ６１℃ ５个梯度处理ꎮ
１􀆰 ６􀆰 ３　 灵敏性试验　 用 １０ 个梯度标准质粒 ＤＮＡ
(１０－１ ~１０－１０)为模板ꎬ进行常规 ＰＣＲ 与荧光定量
ＰＣＲ检测ꎬ比较 ２种检测方法的灵敏度ꎮ
１􀆰 ６􀆰 ４ 　 特异性试验　 用标准质粒 ＤＮＡ(１０－７)作
为阳性对照ꎬ同时以分别含有 ＳＰＶＧ、 ＳＰＬＶ、
ＳＰＶＭＶ以及 ＳＰＦＭＶ 的 ｃｐ 基因重组质粒作为检
测对象ꎬ检测该方法的特异性ꎮ
１􀆰 ６􀆰 ５　 重复性试验 　 分别以 ６ 个梯度标准质粒
ＤＮＡ(１０－２ ~１０－７)为模板ꎬ同一试验中每个稀释度
的标准质粒设 ３ 次重复ꎬ分析组内差异ꎻ以相同的
标准质粒为模板进行 ３次独立重复试验ꎬ分析不同
批次试验之间的重复性ꎮ
１􀆰 ７　 实时荧光定量 ＰＣＲ的初步应用
　 　 将从浙江、四川、江苏等地田间采集具有典型
ＳＰＶＤ症状的甘薯样品ꎬ分别采用 ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ、常
规 ＲＴ￣ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ ３ 种方法进行检
测ꎬ比较这 ３种方法检测田间样品的效果ꎮ
１􀆰 ８　 实时荧光定量 ＰＣＲ产物的克隆和序列测定
　 　 为了验证实时荧光定量 ＰＣＲ的扩增产物为目
的病毒的基因片段ꎬ随机将部分样品荧光定量
ＰＣＲ 的扩增产物进行克隆和序列测定ꎮ 利用
ＤＮＡＭＡＮ和 ＢＬＡＳＴ对所测序列进行比较分析ꎮ
２　 结果
２􀆰 １　 标准质粒的制备
　 　 通过 ＲＴ￣ＰＣＲ 扩增获得了 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ 的 ｃｐ
基因片段ꎬ大小与预期相同(图 １)ꎬ将 ｃｐ基因克隆
Ｆｉｇ. １　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ ｃｐ ｂｙ ｒｅ￣
ｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ
Ｌａｎｅ Ｍ:ＤＬ２０００ꎻ Ｌａｎｅ １－２:ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ ｃｐꎻＬａｎｅ ３:Ｎｅｇａ￣
ｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ􀆰
３６４
　
植物病理学报 ４４卷
到 ｐＭＤ１９￣Ｔ上ꎬ获得重组质粒ꎬ经序列分析验证ꎬ
ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ ｃｐ基因全长为 ７７４ ｂｐꎮ 用分光光度计
测其浓度为 １２５􀆰 ８ ｎｇ / μＬꎬ Ａ２６０ / Ａ２８０ 比值为
１􀆰 ８６ꎬ纯度符合荧光定量 ＰＣＲ 标准品的要求ꎮ 换
算成拷贝数为 ３􀆰 ３１×１０１０ ｃｏｐｉｅｓ / μＬꎮ
２􀆰 ２　 引物、探针浓度及反应条件的优化
　 　 用 ３􀆰 ３１ × １０６ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ 稀释度的标准质粒
ＤＮＡ 为模板ꎬ分别对引物浓度、探针浓度进行优
化ꎬ结果显示ꎬ上、下游引物终浓度均为 ０􀆰 ３ μｍｏｌ /
Ｌ、探针终浓度为 ０􀆰 ３ μｍｏｌ / Ｌꎬ能检测到最小的 Ｃｔ
值和较高的荧光强度增加值(ΔＲｎ)ꎮ 反应条件优
化结果显示ꎬ三温循环条件下ꎬ５５℃为最佳退火温
度ꎮ 优化后的反应程序为:９５℃预变性 ３０ ｓꎬ９５℃
变性 ５ ｓꎬ５５℃退火 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 ３０ ｓ 并采集荧
光ꎬ共 ４０个循环ꎮ
２􀆰 ３　 标准曲线的建立
　 　 使用 １０倍系列稀释的标准质粒 ＤＮＡ(３􀆰 ３１×
１０３ ~３􀆰 ３１×１０８ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ)为模板ꎬ进行荧光定量
ＰＣＲ扩增ꎮ 反应结束后ꎬ系统软件自动分析得到
了荧光定量 ＰＣＲ方法的扩增曲线和标准曲线ꎮ 标
准曲线方程为:Ｙ ＝ －３􀆰 ２３９Ｘ＋４０􀆰 １９３ꎬ扩增效率为
１０３􀆰 ５６８％ꎬ相关系数为 １ꎬ标准品曲线中 Ｃｔ值和标
准质粒浓度之间呈现良好的线性关系 (图 ２、
图 ３)ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｕｒｖｅｓ
Ｓｔａｎｄａｒｄ ＤＮＡ ｏｆ ＳＰＣＳＶ ｉｓ ３􀆰 ３１×１０８ꎬ ３􀆰 ３１×１０７ꎬ ３􀆰 ３１×１０６ꎬ
３􀆰 ３１×１０５ꎬ ３􀆰 ３１×１０４ꎬ ３􀆰 ３１×１０３ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ ｆｒｏｍ １ ｔｏ ６ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ７:Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ􀆰
Ｆｉｇ. ３　 Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
４６４
　
　 ５期 王 丽ꎬ等:甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量 ＰＣＲ检测方法的建立及应用
２􀆰 ４　 荧光定量 ＰＣＲ与常规 ＰＣＲ检测方法的灵敏
度比较
　 　 分别对不同稀释度的标准质粒 ＤＮＡ(３􀆰 ３１×
１０９ ~３􀆰 ３１×１００ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ)进行扩增ꎬ当标准质粒
浓度为 ３􀆰 ３１×１００ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ 时仍有荧光曲线(图
４)ꎬ表明本研究建立的荧光定量 ＰＣＲ 方法的检测
灵敏度可达 ３􀆰 ３１×１００ ｃｏｐｉｅｓ / μＬꎮ 而常规 ＰＣＲ 方
法最低能检出 ３􀆰 ３１×１０３ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ(图 ５)ꎬ表明本
研究建立的荧光定量 ＰＣＲ 检测 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ 的灵
敏度比常规 ＰＣＲ高 １ ０００倍ꎮ
２􀆰 ５　 特异性试验
　 　 为验证所建立的检测 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ 荧光定量
ＰＣＲ方法的特异性ꎬ以 ３􀆰 ３１×１０３ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ的质粒
为模板ꎬ同时以分别含有 ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＶ 以
及 ＳＰＶＭＶ ｃｐ基因的重组质粒作为检测对象ꎬ结
果 ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＶ、ＳＰＶＭＶ在反应过程中均
未出现有效扩增荧光信号ꎬ而 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ 则有很
好的扩增动力学曲线(图 ６)ꎬ表明本试验建立的荧
光定量 ＰＣＲ方法具有良好的特异性ꎮ
２􀆰 ６　 重复性试验
　 　 用 ３􀆰 ３１×１０３ ~３􀆰 ３１×１０８ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ稀释度的标准
质粒 ＤＮＡ进行实时荧光定量 ＰＣＲ反应ꎬ在同一试验
中ꎬ每个稀释度的标准质粒设 ３次重复ꎬ组内重复性
试验结果表明ꎬ６个不同稀释度标准质粒 Ｃｔ值的变异
系数为 ０􀆰 １８％~１􀆰 ６２％(表 ２)ꎮ 再以相同的标准质粒
为模板进行 ３次独立的重复试验ꎬ结果表明组间变异
系数在 ０􀆰 ０８％~０􀆰 ９９％之间(表 ３)ꎮ 说明本研究建立
的荧光定量 ＰＣＲ方法的重复性和稳定性较好ꎮ
Ｆｉｇ. ４　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
１－１０: Ｓｔａｎｄａｒｄ ＤＮＡ ｏｆ ＳＰＣＳＶ ｉｓ ３􀆰 ３１×１０９－３􀆰 ３１×１００ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ ｉｎ ｔｕｒｎꎻ １１: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ􀆰
Ｆｉｇ. ５　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ
Ｌａｎｅ Ｍ:ＤＬ２０００ꎻＬａｎｅ １－１０: Ｓｔａｎｄａｒｄ ＤＮＡ ｏｆ ＳＰＣＳＶ ｉｓ ３􀆰 ３１×１０９－３􀆰 ３１×１００ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ ｉｎ ｔｕｒｎꎻＬａｎｅ １１:Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ􀆰
５６４
　
植物病理学报 ４４卷
２􀆰 ７　 荧光定量 ＰＣＲ的初步应用
　 　 利用 ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ、常规 ＲＴ￣ＰＣＲ 和实时荧光
定量 ＰＣＲ方法ꎬ对采自我国四川、江苏等地的 ９ 份
具有典型 ＳＰＶＤ症状的甘薯植株样品进行检测ꎬ结
果表明ꎬＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ检测出 ２份样品呈 ＳＰＣＳＶ阳
性ꎬ常规 ＲＴ￣ＰＣＲ检测出 ６份样品呈 ＳＰＣＳＶ阳性ꎬ
而实时荧光定量 ＰＣＲ 方法检测出 ９ 个样品均呈
ＳＰＣＳＶ阳性(表 ４)ꎮ 说明实时荧光定量 ＰＣＲ方法
检测田间样品的灵敏度明显高于 ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ 和
常规 ＲＴ￣ＰＣＲ方法ꎮ
Ｆｉｇ. ６　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
１: Ｓｔａｎｄａｒｄ ＤＮＡ ｏｆ ＳＰＣＳＶ ｃｐ (ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ)ꎻ ２: Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｏｆ ＳＰＦＭＶ ｃｐꎻ
３: Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｏｆ ＳＰＶＧ ｃｐꎻ ４: Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｏｆ ＳＰＬＶ ｃｐꎻ ５: Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｏｆ ＳＰＶＭＶ ｃｐꎻ ６: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ􀆰
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｉｎｔｒａ￣ａｓｓａｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｃｏｐｉｅｓ / μＬ
Ｃｔ
１ ２ ３
Ｍｅａｎ Ｃｔ ＣＶ / ％
３􀆰 ３１×１０８ １２􀆰 ５１８ １２􀆰 ９２３ １２􀆰 ７８６ １２􀆰 ７４ ± ０􀆰 ２１ １􀆰 ６２
３􀆰 ３１×１０７ １５􀆰 ８２５ １５􀆰 ９０９ １５􀆰 ９６４ １５􀆰 ９０ ± ０􀆰 ０７ ０􀆰 ４４
３􀆰 ３１×１０６ １９􀆰 １６６ １９􀆰 １４０ １９􀆰 ０９６ １９􀆰 １３ ± ０􀆰 ０４ ０􀆰 １８
３􀆰 ３１×１０５ ２２􀆰 ３７３ ２２􀆰 ４７５ ２２􀆰 ３９５ ２２􀆰 ４１ ± ０􀆰 ０５ ０􀆰 ２４
３􀆰 ３１×１０４ ２５􀆰 ５８０ ２５􀆰 ６９４ ２５􀆰 ７６３ ２５􀆰 ６８ ± ０􀆰 ０９ ０􀆰 ３６
３􀆰 ３１×１０３ ２８􀆰 ７２８ ２８􀆰 １９３ ２８􀆰 ７２５ ２８􀆰 ５５ ±０􀆰 ３１ １􀆰 ０８
　 Ｔａｂｌｅ ３　 Ｉｎｔｅｒ￣ａｓｓａｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｃｏｐｉｅｓ / μＬ
Ｃｔ
１ ２ ３
Ｍｅａｎ Ｃｔ ＣＶ / ％
３􀆰 ３１×１０８ １２􀆰 ５１３ １２􀆰 ５２０ １２􀆰 ７３３ １２􀆰 ５９ ± ０􀆰 １３ ０􀆰 ９９
３􀆰 ３１×１０７ １５􀆰 ９７５ １５􀆰 ８３３ １５􀆰 ８１６ １５􀆰 ８８ ± ０􀆰 ０９ ０􀆰 ５５
３􀆰 ３１×１０６ １９􀆰 ００５ １８􀆰 ９７７ １９􀆰 ０５９ １９􀆰 ０１ ± ０􀆰 ０４ ０􀆰 ２２
３􀆰 ３１×１０５ ２２􀆰 ５１９ ２２􀆰 ５４７ ２２􀆰 ４７６ ２２􀆰 ５１ ± ０􀆰 ０４ ０􀆰 １６
３􀆰 ３１×１０４ ２５􀆰 ６１６ ２５􀆰 ４９０ ２５􀆰 ４５９ ２５􀆰 ５２ ± ０􀆰 ０８ ０􀆰 ３３
３􀆰 ３１×１０３ ２８􀆰 ９１４ ２８􀆰 ９６１ ２８􀆰 ９３０ ２８􀆰 ９４ ± ０􀆰 ０２ ０􀆰 ０８
６６４
　
　 ５期 王 丽ꎬ等:甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量 ＰＣＲ检测方法的建立及应用
　 Ｔａｂｌｅ ４　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＰＶＤ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｉｔｈ ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡꎬ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｎｄ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｓａｍｐｌｅ ｎａｍｅ Ｏｒｉｇｉｎ ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ ＲＴ￣ＰＣＲ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｍｉｎ￣１２￣１ ＱｕａｎｚｈｏｕꎬＦｕｊｉａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ – ＋ ＋
Ｊｉｎ￣１２￣１ ＹｕｎｃｈｅｎｇꎬＳｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ – ＋ ＋
Ｓｕ￣１２￣６ ＸｕｚｈｏｕꎬＪｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ ＋ ＋ ＋
Ｌｕ￣１２￣１ ＪｉｎｉｎｇꎬＳｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ – – ＋
Ｙｕ ￣１２￣３３ ＬｕｏｙａｎｇꎬＨｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ – ＋ ＋
Ｚｈｅ￣１２￣３ ＨａｎｇｚｈｏｕꎬＺｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ ＋ ＋ ＋
Ｃｈｕａｎ￣１２￣８ ＮａｎｃｈｏｎｇꎬＳｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ – ＋ ＋
Ｓｈａｎ￣１２￣４ Ｂａｏｊｉꎬ Ｓｈａａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ – – ＋
Ｘｉａｎｇ￣１２￣９ ＣｈａｎｇｓｈａꎬＨｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ – – ＋
　 “＋”: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓꎻ “－”: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ􀆰
２􀆰 ８　 荧光定量 ＰＣＲ扩增产物的鉴定
　 　 为了进一步验证荧光定量 ＰＣＲ扩增出的片段
为目的病毒的核酸序列ꎬ随机选取部分样品的荧光
定量 ＰＣＲ扩增产物进行克隆和序列测定ꎮ 结果表
明ꎬ扩增出的目的片段的核苷酸序列与 ＧｅｎＢａｎｋ
中 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ 核苷酸序列一致性达 ９７％ ~ ９９％ꎬ
说明扩增出的片段均为目的病毒的特异性片段ꎮ
３　 讨论
　 　 本研究以 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ ｃｐ 基因的保守区域设
计特异性引物和探针ꎬ建立了检测 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ 的
实时荧光定量 ＰＣＲ方法ꎮ 该方法的检测极限可达
３􀆰 ３１ｃｏｐｉｅｓ / μＬꎬ比常规 ＰＣＲ 方法高 １０００ 倍ꎬ而且
特异性强ꎬ重复性好ꎮ 对田间样品的 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ
检出率显著高于 ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ 和常规 ＲＴ￣ＰＣＲ 方
法ꎮ
　 　 ＳＰＣＳＶ在甘薯植株内含量较低ꎬ分布不均匀ꎬ
而且常与多种病毒混合侵染[１ꎬ１２ꎬ１３]ꎬ因此ꎬＳＰＣＳＶ
的分离纯化比较困难ꎬ目前国内尚未成功制备
ＳＰＣＳＶ的特异性抗体ꎮ 另外ꎬ由于甘薯植株体内
富含胶质、多酚和多糖等物质[１４ꎬ１５]ꎬ这些物质会干
扰 ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ和常规 ＲＴ￣ＰＣＲ的检测效果ꎬ导致
结果的误判ꎮ 为了克服这些干扰ꎬ需先将待检测甘
薯样品嫁接到指示植物巴西牵牛上ꎬ待巴西牵牛发
病后ꎬ再对巴西牵牛进行检测ꎬ费时费力ꎮ 本研究
建立的 ＳＰＣＳＶ￣ＷＡ实时荧光定量 ＰＣＲ检测方法ꎬ
虽然其灵敏度也可能受甘薯植株内胶质、多酚和多
糖等物质的影响ꎬ但由于其灵敏度比常规 ＰＣＲ 高
１ ０００倍ꎬ大大提高了直接从甘薯叶片中检测病毒
的检出率ꎬ在一定程度上弥补了 ＥＬＩＳＡ 和传统
ＰＣＲ检测方法的不足ꎮ
　 　 ＳＰＣＳＶ 可与 ＳＰＦＭＶ 等多种病毒发生协生作
用ꎬ导致甘薯病毒病症状加重[１ꎬ１２ꎬ１３]ꎮ ＳＰＶＤ 是
ＳＰＣＳＶ和 ＳＰＦＭＶ 共同侵染甘薯植株导致协生病
害发生的典型例子ꎮ 当 ＳＰＦＭＶ 和 ＳＰＣＳＶ 单独侵
染甘薯植株时ꎬ甘薯植株不表现或者只表现出轻微
的症状ꎬ而当 ２ 种病毒共同侵染甘薯植株时ꎬ就会
表现甘薯叶片畸形、植株矮化等严重症状ꎮ 由于
ＳＰＦＭＶ在我国甘薯上普遍存在[４]ꎬＳＰＶＤ 的流行
取决于 ＳＰＣＳＶ的发生ꎬ要从根本上控制 ＳＰＶＤꎬ关
键是控制 ＳＰＣＳＶ的传播ꎮ 因此ꎬ建立 ＳＰＣＳＶ高效
灵敏的实时荧光定量 ＰＣＲ 检测技术ꎬ加强对
ＳＰＣＳＶ的早期监测预警ꎬ对 ＳＰＶＤ 的防控具有重
要意义ꎮ 另外ꎬ深入研究 ＳＰＣＳＶ 与其他甘薯病毒
相互作用的分子机制ꎬ可为寻找更有效的抗病毒途
径提供依据ꎮ ＳＰＣＳＶ 实时荧光定量 ＰＣＲ 检测方
法可定量检测单个拷贝数的病毒ꎬ可作为甘薯病毒
互作机制研究的高效工具ꎬ具有实用价值ꎮ
参考文献
[１] 　 Ｇｕｔｉéｒｒｅｚ Ｄ Ｌꎬ Ｆｕｅｎｔｅｓ Ｓꎬ Ｓａｌａｚａｒ Ｌ Ｆ􀆰 Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ
ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ( ＳＰＶＤ): Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎꎬ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅꎬ ａｎｄ
ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｙｉｅｌｄ ｉｎ Ｐｅｒｕ [ Ｊ ] 􀆰 Ｐｌａｎｔ
Ｄｉｓｅａｓｅꎬ ２００３ꎬ ８７: ２９７－３０２􀆰
７６４
　
植物病理学报 ４４卷
[２] 　 Ｑｉａｏ Ｑꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚ Ｃꎬ Ｑｉｎ Ｙ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ􀆰 Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ
Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ
ｉｎ Ｃｈｉｎａ [Ｊ] 􀆰 Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ ２０１１ꎬ ９５(３): ３５６􀆰
[３] 　 Ｚｈａｎｇ Ｚ Ｃꎬ Ｑｉａｏ Ｑꎬ Ｑｉｎ Ｙ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ􀆰 Ｆｉｒｓｔ ｅｖｉｄｅｎｃｅ
ｆｏｒ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ (ＳＰＶＤ)
ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｄｕａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ
ｆｅａｔｈｅｒｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ
ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] 􀆰 Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏ￣
ｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报)ꎬ ２０１２ꎬ ４２(３): ３２８ －
３３３􀆰
[４] 　 Ｑｉａｏ Ｑꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚ Ｃꎬ Ｚｈａｎｇ Ｄ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ􀆰 Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｓｗｅｅｔ
ｐｏｔａｔｏ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] 􀆰 Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏ￣
ｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报)ꎬ ２０１２ꎬ ４２(１): １０－
１６􀆰
[５] 　 Ｚｈａｎｇ Ｐꎬ Ｌａｎ Ｘ Ｚꎬ Ｑｉａｏ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ􀆰 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ￣ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ (ＳＰＶＤ) ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] 􀆰 Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ (植物保护)ꎬ ２０１３ꎬ ３９(２): ８６
－９０􀆰
[６] 　 Ｋｏｋｋｉｎｏｓ Ｃ Ｄꎬ Ｃｌａｒｋ Ｃ Ａ􀆰 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓｅｓ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ ２００６ꎬ ９０(６): ７８３－７８８􀆰
[７] 　 Ｙｕ Ｃꎬ Ｙａｎｇ Ｃ Ｙꎬ Ｚｈａｎｇ Ｓ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ􀆰 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ
Ａｒａｂｉｓ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] 􀆰 Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏ￣
ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报)ꎬ ２００８ꎬ ３８(４):
３８８－３９３􀆰
[８] 　 Ｋｒｅｕｚｅ Ｊ Ｆꎬ Ｓａｖｅｎｋｏｖ Ｅ Ｉꎬ Ｖａｌｋｏｎｅｎ Ｊ Ｐ Ｔ􀆰 Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡｓ ｏｆ
Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅａｌ ｓｅｖｅｒａｌ ｎｅｗ
ｆｅａｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ [Ｊ] 􀆰 Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ ２００２ꎬ
７６(１８): ９２６０－９２７０􀆰
[９] 　 Ｈｏｙｅｒ Ｕꎬ Ｍａｉｓｓ Ｅꎬ Ｊｅｌｋｍａｎｎ Ｗꎬ ｅｔ ａｌ􀆰 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ａ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｓｕｎｋｅｎ ｖｅｉｎ
ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ ｆｒｏｍ Ｋｅｎｙａ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ
ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ａｍｏｎｇ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ
ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ [ Ｊ] 􀆰 Ｐｈｙｔｏｐａ￣
ｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９９６ꎬ ８６: ７４４－７５０􀆰
[１０] Ｑｉｎ Ｙ Ｈꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚ Ｃꎬ Ｑｉａｏ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ􀆰 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ
(ＳＰＣＳＶ) ａｎｄ ｆｉｖｅ Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ
ｉｎ Ｃｈｉｎａ [Ｊ] 􀆰 Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ ２０１３ꎬ １５８ (２):
４９１－４９５􀆰
[１１] Ｕｍｅｓａｋｉ Ｙꎬ Ｓｅｔｏｙａｍａ Ｈ􀆰 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ｆｌｏｒａ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｔ ｉｍｍｕｎｅ
ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ａ ｒｏｄｅｎｔ ｍｏｄｅｌ [Ｊ] 􀆰 Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎꎬ
２０００ꎬ ２(１１): １３４３－１３５１􀆰
[１２] Ｍｕｋａｓａ Ｓ Ｂꎬ Ｒｕｂａｉｈａｙｏ Ｐ Ｒꎬ Ｖａｌｋｏｎｅｎ Ｊ Ｐ Ｔ􀆰
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ａ ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓꎬ ａｎ ｉｐｏｍｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａ
ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ ｉｎ ｃｏｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓ [ Ｊ] 􀆰 Ｐｌａｎｔ
Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ ５５(３): ４５８－４６７􀆰
[１３] Ｕｎｔｉｖｅｒｏｓ Ｍꎬ Ｆｕｅｎｔｅｓ Ｓꎬ Ｓａｌａｚａｒ Ｌ Ｆ􀆰 Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ (Ｃｒｉｎｉ￣
ｖｉｒｕｓ) ｗｉｔｈ ｃａｒｌａ￣ꎬ ｃｕｃｕｍｏ￣ꎬ ｉｐｏｍｏ￣ꎬ ａｎｄ ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ
ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ [ Ｊ] 􀆰 Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ ２００７ꎬ ９１:
６６９－６７６􀆰
[１４] Ｃａｌｉ Ｂ Ｂꎬ Ｍｏｙｅｒ Ｊ Ｗ􀆰 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ｓｅｒｏｌｏｇｙꎬ ａｎｄ
ｐａｒｔｉｃｌｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｗｏ ｒｕｓｓｅｔ ｃｒａｃｋ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ
ｐｏｔａｔｏ ｆｅａｔｈｅｒｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ [ Ｊ ] 􀆰 Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ
１９８１ꎬ ７１: ３０２－３０５􀆰
[１５] Ｍｏｙｅｒ Ｊ Ｗꎬ Ｃａｌｉ Ｂ Ｂꎬ Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｇ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ􀆰 Ｉｄｅｎｔｉｆｉ￣
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｆｅａｔｈｅｒｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ
ｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ [ Ｊ] 􀆰 Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ１９８０ꎬ ６４(８):
７６２－７６４􀆰
责任编辑:于金枝　 　
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