全 文 ：第 7 卷 第 4 期
1年 1 2月
生 物 物 理 学 报 V o l . 7
A C T A B I O P H Y S IC A S I N I CA D e e
.
1
N
o
.
4
9 9 1
用稳态荧光探针研究竹红菌乙素
光敏损伤对人红细胞膜流动性的影响’
乐加昌 秦静芬 孙继 山 庞素珍
(中国科学院生物物理所 , 北京 1 0 0 0 8。 )
摘 要
木文以红细胞膜为材料 , 用了三种稳态荧光探乍卜研究了H B光敏作用引起人红细胞膜流动性
的改变 . 实验结果表明在 H B光敏作用下 , 膜的旋转扩散速度和侧向扩散速度均发生明显变化 ,
A N S 和 D P H探针测得 H B引起膜流动性降低 , 也就是膜粘度增加 , 用花探针结果则表明膜的侧
向扩散变慢 . 本文还对 H B光敏作用的机理进行了探讨 , 我们观察了数种单重态氧碎灭剂 , 经自
由基碎灭剂和抗氧化剂对于光敏作用的影响 , 分别测定了膜流动性和膜的内源荧光的变化 , 发
现在 H B光敏作用中 , 除了 ` 0 的作用之外 , 还存在其它自由基的作用 . 在 H B 与 H A 光敏能力的
比较中发现 , 在比较高一些浓度条件下 , 存在着 H B大于 H A的趋向 .
关键词 : 人红细胞膜 , 流动性 , 光敏剂 , 荧光探针 .
竹红菌是我国首先发现并应用于治疗某些肤病的新型光疗药物 `” , 近来研究表明它对
肿瘤细胞有一定的杀伤作用 〔“ ’ , 自1 9 8 0年万象义等分离签定其主要光敏色素 , 竹红菌甲素
H yP co
r e il n A ( 简称 H A ) 以来 , 1 9 8 6年竹红菌中另一光敏色素 , 竹红菌乙素 (简称 H B )
也被分离和签定 , 其结构如下 “` ’ :
虽然竹红菌中乙素含量较少 , 但是它有一定疗效 , 有文献
报道 H B 产 生单重态氧能力和 H A差不多 `4 ’ 。 本实验室在对膜
通透性研究结果表明 : H B 比 H A光生物学作用能力还要强 ` 5 ’ ,
因此开展对于 BH 光生物学特征研究 , 不仅具有临 床 应 用 价 。 I,o
值 , 而且有利于了解花酿衍生物的光生物学特征的理论意义 。 0切
众所周知 , 细胞膜的流动性改变是细胞膜结构变 化 的 重 要特
征 , 本文用人红细胞膜为材料 , 使用了三种稳态荧光探针 A N S
( 1
, 苯胺一 8 蔡磺酸 ) , D P H ( 1 , 6二苯基一 1 , 3 , 5一己三
苯 ) 花和分别测定了乙素光敏作用后膜流动性的变化 。 用数种
o 、 H / 0
单重态氧碎灭剂 , 经自由基碎灭剂和抗氧化剂研究分析了 H B 光敏作用 的 机 理 ; 并 且 以
H A为对照观察了两者对膜流动性影响的异 同 。
. 国家自然科学签金资助项日
生 物 物 理 学 报 19 0 1年
材料和方法
1
. 竹红菌乙素的制取按文献 “` ’方法制备 , 提纯样品经 N M R鉴定与文献 〔“ ’值一致 。
2
.荧光探针和化学试剂 : 1 , 6一二苯基一 1 , 3 , 5一已三稀 ( D P H ) ; 1一苯胺一 8一
茶磺酸 ( A N )S ; 花 ; 2 , 6一双一特丁基对甲苯酚 (B H T ) , S艳m : 产品 。 1 , 4一二氮杂
二环〔 2 , 2 , 2〕辛烷 ( D A B C o ) : N一对胺基苯甲酞一 L一谷氨酸 ( p A B G A ) ; F l l u K a 公
司 。 L一组氨酸 (中科院上海生物化学研究所 , 层析纯 ) , D刃 为北 京化工厂产品 , 纯度
9 9
.
7%
。
3
.人红细胞膜的制备与膜蛋 白的测定见前文 `” , 4 ℃保存一周 内使用 。
4
.荧光探针的标记 : 将光照后的红细胞膜立即 加 入 A N S ( 2 0 拼M ) 或花 ( 2 0 拼M ) 摇
匀 , 30 分钟后进行荧光偏振测定 。 D P H溶解在四氢吠喃中使用时用 P B S 缓冲液稀释至 4 x
1。 ~ ” M然后 以等体积加入红细胞膜溶液中 , 震荡 , 37 ℃水浴中保温 1 . 5小时后测定 t ? 〕 。
5
.光照条件 : l 0 0 0w 碘钨灯用水滤去红外线 , 光照强度 , 1 . 4 K W / M Z光照时样品置于
冰水中并用磁力搅拌 。
(以上所有实验使用磷酸缓冲溶液 P H 二 7 . 4样品重复三次以上 )
荧光谱仪 : 日立 8 50 型
结 果
一 、 D P H , A N S , 和花结合红细胞膜后的荧光光谱
D P H , A N s和花 , 三种探针在 P B S 缓冲液中几乎没有荧光 , 但当它们分别和红细胞膜
结合后 , 荧光强度增加几十倍 。 由于本实验条件 H B的使用浓度大都在小 于 2 x 1 0一 。 M , 它
们的荧光峰值和无 H B存在下的文献报导的结果一致 〔” 〔” ’ , H B 掺入对上述三种探针的荧光
峰值基本不影响 。
二 、 H B光敏作用对人红细胞膜的流动性的影晌
用 D P H , A N s 探针的实验结果表明 , H B 光敏作用引起了红细胞膜的旋转扩散速度的
降低 , 它随着光照时间 的增长荧光偏振度增大 , 也就是膜的流动性减少 , 二种探针 的结果
见表 ( 1 ) 。
T a b l e I T卜e H B 一 s e n s i t i z e d Ph o t o d a m a g e t o f l u i d i t y o f e r y t h r o e y t e m e m b r a n e s
一述仪…
_ 竺,
_
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_ _
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·
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[ 6 0 r e s u l t s
2 3 9士 . 0 0 1 . 2 4 4士 . 0 0 3 . 3 5 5土 . 0 0 G Po l a r i z a t i o n
i n e了 e a昌 e d
.
18 5士 . 0 0 4 } . 2 0 5士 . 0 06 . 2 03土 . 0 0 4 . 2 1了士 . 0 0 2 狱票沈飞盆“ ”
T h e c o取 c e n t丈 a t i o u o f Hy P0 e r e l l i n B 2 x 1 0一 ` M
p = ( I
v v一 e x v h ) /( Iv v+ G l v五 ) c = I h, / 1 h h ; x v v = 9 0 ’ , 9 0 ’ ; I h v = 0 . , 。0 ’
I
v
h 二 。 0 . , 0 . ; I b h 二 0 . , 0 .
e r y t h r o c y t e
f l u o r e s e e n
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m e m b r a o e
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0
.
2 m g P:
.
/ m l
P o l a r i z a t i o n m e
a s u r i n g : 几e x :
只e m :
D P H
: 2 x 1 0
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M ; A N S
: 2 x 1 0
一 “
M
.
T = 3 0℃
D F H : 36 2 n m : A N S
: 38 5 n m :
D P H
: 5 3 0 n m ; A N 只: 4 8 0 n n l .
T 二 m 1 n u t e 弓
第 4期 用稳态荧光探针研究竹红菌乙素光敏损伤对人红细胞膜流动性的影响 6 05
用花探针研究红细胞膜在 H B光敏作用下侧向扩散速率也随光 照时间延长而降 低 (数
据未列出 ) , 表 ( 2 ) , 给出了随着 H B 浓度增加 , 同样光照时间内红细胞膜的侧向扩散
速度变化的情况 。 所测结果是以花探针激发二聚体荧光强度和单体荧光强度的比值 , 它反
映的是膜侧向扩散流动性的变化 。 从数据看出在本实验范围 内 H B光敏作用随着浓度增加
而增加 。 (有关 H B光敏浓度效应 对于 D P H偏振度的影响将在下面讨论 ) 。
T a b l e 2 T h e e f f e e t o f H B Ph
o t o d a m a g e o n l a t e r a l d i f f u s i o n
o f e r y t h
r o e y t e m e m b
r a n e
H B 二 C o N c E N T R A T I o N S (M )
P a r a m e l e r
2 X 1 0
一 7
} 6 X 1 0
一 7 I X 1 0一 ` 1
.
4 X 1 0
一 6 2 X 1 0一 6
石’ I u . I n . M o n o扭 e r
( M )
9 0士 2 5 3士 l 4 9士 1 5 1士 5 4 7士 2
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.
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2 3士 2 1 6士 2 1 3 5士 1 4士 l 1 1士 1
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3 0 2 0
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2 76 0
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2 74
Ja t e r a l
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d e e r e a s e d
e r y t h r o e y t e m e m b r a n e s
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e o n e e n t r a t i o n o f
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, , m l
2 0 拼M , 1 r r a d i a t i o n 1 0 m i n u t e s
M 3 3 5 n m
D 4 7 8 n m
三 、 比较H B 和 H A 不同浓度对B P H 荧光偏振值的影晌
图 ( 1 ) 表示了不同浓度 H B ( H A ) 的光敏作用对 D P H 偏 振值的影响 , 当光照 10 分钟
时 , 无 H B存在下的偏 振值 (0 . 2 0 5 3 士。 . 0 0 1 9 ; 而在同样条件下 , 加入不 同浓度 H B 后偏振
度增加到 ( 。 . 2 2 8 4士 0 . 0 0 0 3) , 可见 H B浓度光敏作用的影响 (有关 H A和 H B光敏能力异 同
将在下面讨论 ) 。
::
二、 / 产
/
/ 尸
F 19
.
1 E f f e e t o f C o n e e n t r a t i o n s o f H B a n d
H A
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o f e r y t h r o e y t e m e m b -
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P
o s u r e t i m e 1 0 m i n ; m e a s u r e n t e o n -
d i t i 。 n , : r e s h o w n i n t a b l e ( 1 )
.
T = 2 5℃ ,
L u n 、 i n o u s i n t e n s i t y : 1 K W / M
,
. 0 ( u . 。 /乙
e。 朴产 , 卜十, , t , 八卜
四 、 光敏机理研究
从上可见 H B光 敏作用对于膜的流动性影响是十分明显的 , 有关 HB 光敏损伤作用机理
是 自由华还是单重态氧 , 现在还不十分清楚 , 我们 以 Dz o , 通 N : 脱氧 , 和单重态氧碎灭剂
D A B C O (1
,
4一氮杂二环 2 , 2 , 2) 辛烷 ; L一组氮酸 ; 经白由基碎灭剂 P A B G A ( N一对氮
60 6 生 物 物 理 学 报 19叭年
基苯甲酞基谷氨酸 ) 和抗氧化剂 B H T (2 , 6一双一特丁基对甲苯酚 ) 分别加入到红 细胞膜
中 , 与乙素一起进行光照 , 观察了这些淬灭剂的作用 , 结果见 图 ( 2 ) , 它反映了不同的
淬灭剂对于膜流动性的影响 。
除了观察荧光偏振度的变化之外 , 我们还观察了部分的碎灭剂和抗氧化剂对于 乙素光
敏作用前后的膜蛋 白内源荧光的变化 , 结果见图 ( 3 ) 。 膜 内源荧光的变 化 , 实质上反映
了膜蛋 白受到光敏损伤的程度 。
刁…一一ǎ卜尸巧ó“óū)1职.一试助欲曰ù禹功ù、口召…、lllweeses一
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F 19
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2 T h e e f f e e t s o f g u e n e h e t s a n d
a n t i o x i d a n t o n H B一 s e n s i t i z e d P h o t o d a m -
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3 H B
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i n s i e f l u o r e s e e n e e o f e t g t h
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3 4 0 n m
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y t五r o e y t e m e m b r a n e : o . 2 5 m g , P r .
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x 1 0
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}一了3 0 m i n u , e s i r r a d i a ` i o n
从图 ( 2 ) , ( 3 ) 综合的结果来看 , 由于 D刃 中的单重态氧的寿命大约是普通水中
的 10 倍 , 因此在重水中`的光敏损伤无论是从膜的偏振度的变化 , 还是从内源灸光的碎灭都
显出明显作用 , 通氮脱氧的结果 , 对于 H B 光敏作用也说明了氧的重要作用 。 当然 , H B光
敏作用中除了单重态氧的作用之外 , 还有 0 ” 和 o H ’ 等 自由基的作用 。 加入单重态氧拌灭剂
L 一 1
5 不能对 (细胞膜中 ) 偏振度起保护作用 , 以及对 内源荧光也无明显保护作用 , 这说
明了本研究中并不能完全 以单线态氧作用作出解释 , 还存在着其它 ( 活性氧 ) 的作用 , 为
此 , 我们使用 , o H ’ 淬灭剂 ( P A B G A ) , 发现它对膜蛋 白的光敏损伤保护作用十分明显 ,
对于偏振度的保护也有一定作用 , 说明了本体系 中确实存在其它活性氧 (自由基的作用 。
由于 B H T能抑制类的过氧化 , 而不能抑制膜蛋 白的过氧化 (图 ( 2 )的结果 ) 。 本体系中加
入 B H T的结果说明了脂过氧化对膜流动性有重要的影响 。 另外 D A B C o 也 是单重态氧的拌
灭剂 , 他们 的作用不 同程度也反映了单重态氧对于 H B光敏损伤中的作用 。
讨 论
用稳态荣光探针 D P H , A N S 和花分别观察了 乙素光敏作用损伤红细胞膜后 , 引起膜流
动性的改变可得如下 结论 .: ( l ) 随着 H B 掺 入的浓度增加 (同样的光照时间内 ) 荧光偏
振度增加 。 在同样的浓度 乙素存在下 , 随着光照时间的延长 , 红细胞膜的偏振度增加即流
第 4 期 用稳态荧光探针研究竹红菌乙素光敏损伤对人红细胞膜流动性的影响 607
动性降低 , 实 际上反映了红细胞膜的粘度增加 。 以上结果与甲素光敏作用于红细胞膜流动
性的影响结果有类似的作用 ” ’ , 「` 。 ’ , 与文献 〔1 1〕报导结果有很大的差别的原因 可 能 是文
献 `川掺入 H B的浓度大于本实验的浓度 10 0倍所致 。 ( 2 ) 本文使用了三种不 同的荧 光 探
针观察到 乙素光敏作用不仅能引起膜的旋转扩散和侧向扩散速度降低 , 而且反映了不同膜
部位的作用影响 。 A N S荧光探针是结合到脂极性头部所 , 反映的是表面膜的流动性的情况 ,
而 D P H 是插入脂烃链的双分子层 , 所测结果为整个脂肪链各层次的流动性的平均值 。 从我
们实验结果来看 A N S荧光偏振度的变计小于 D P H偏振度表 ( 1 ) 。 它实际上反应 了H B光敏
作用主要在脂疏水区 。 这里和夕射线照射红细胞膜的作用不 同 。 ( 3 ) 从 H A , H B光敏能力
的对比来看 , 两者在光照 1时于钟之后 , 不 同浓度的变 化基本上光敏能力一致 (图 1 ) , 但
是在比较高些浓度 F , 已出现 H B大于 H A的趋向 , 是什么原因造成 H B大于 H A的现象 , 从结
构式分析我们可以知道 I珊 更倾向于疏水性 , 实验中发现 , 它在水中溶解度大大低于 H A ,
这样可能导致H B在红细胞膜内更趋向膜的更深层次。 我们用花探针的荧光峰强度 l/ ! 比值
的变化 , 分别测定了甲 , 乙素光照 10 分钟之后 , 膜的微极性的改变情况 , 用电介常数计算
公式 “ “ ’ : 。 二 86 . 2 (I / I ) 一 87 . 8计算结果如下 ,
H B 二 一 1 9 . 9 6 0 6 + 0 . 0 0 1 ; H A = 一 2 1 . 1 6 7 + 0 . 0 0 5。 从电介常数数值上也说明了 H B更
加趋于疏水的环境 。 由于 B H 和 H A 对膜的偏振度变化影响比较接近 , 很难看出较大的差
别 , 在上实述验条件下我们还观察了 H B , H A光敏作用下 (光 照 60 分钟后 ) 对膜流动性和
膜内源荧光的拌灭能力比较 , 发现 H B 的光 敏能力明显大于 H A (数据未列出 ) 。 综上所
述 , H B 和 H A一样 , 是一种优良的光敏剂 , 有关竹红菌素光氧化机理是很复杂的 〔` “ ’ , H B
大于 H A的原因我们正在深入研究之中 。
参 考 文 献
〔 l 〕
〔 2 〕
〔 3 〕
〔 4 〕
〔 5 〕
〔 o 〕
〔 7 )
〔 8 〕
〔 9 〕
〔1 0〕
〔1 1〕
〔1 2〕
〔卫3〕
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,
1 9 8 1
,
1 0 4 0一 1 0 4 2
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梁丽 , 竺乃迁 , 张曼华 , 《科学通 报 》 (1 ) , 1 08 了, SG一引〕
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程龙生 , 王家珍等 : 《 实验生物学报 》 , 15 ( l ) , 20 5 5 , 5 9一 9了
程龙生 , 王 家珍等 : 《实验生物学报 》 , ( z G ) 1 0 5 3 , 4 0 。一迄1了
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杜健 : 1 98 8年中科 院生物物理所 , 硕上学位论文 P且一 场
程龙生 , 唐祥 , 郑建华 ; 《生物化学与生物物理学报” , 2 0 ( 2 ) , 1 98 8, ” 5一 1姆
工云宝 , 许金钧 , 陈国珍 : 《 化学通报 》 , 了 , 1 0 9 0 , 拍一 4 3
王志军 , 蒋丽金 , 张曼华 : 《化学学报 》 , 4 5 , 2 9 , o , 4 a 3一 4 a s
本文于 1 0牡 年 4 月 2 日收到 .
启 o e生 物 物 理 学 报 19 9 1年
IN V E ST I G AT I ON OF H YP OR C EL L IN B S EN S IT IZ D E
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a n d t h e l a t e r a l d i f f u s i o n r a t e d e e r e a s e d ( b y m e a s u r i n g p y r e n e e x e im e r / m
o n o m e r
r a t i o ) w i t h i
n e r e a s i n g e o n e e n t r a t i o n o f h y P o e r e l l i n B
.
T o e l u e i d a t e t h e m e e h a n i s m o f Ph o t o d a m a g e o f h y P o e r e l l i n B i n b i o l o g i e a l
s y s t e m s
, 10 : q u e n c h e r s s u e h a s
,
1
,
4
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,
2
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-
d a n t : B u t y l a t e d h y d r o x y t o l u e n e ( B H T ) r e a g e n t a n d D e u t e r i u m s o l v e n t e f f e e t s w e r e
i n v e s t i g a t e d
.
T il e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e P h o t o d a m a g e s t o f l u i d i t y o f e r y t h r o e y t e
m e m b r a n e s w e r e n o t o n l y d u e t o t h e s im P l e m e e h a n i s m o f 10
: ; b u t a l s o d u e t o
o t h e r r a d i e a l s a o w e l l
.
W e a l s o e o m P a r e d t h e e f f e e t o f d i f f e r e n t e o n c e n t r a t i o n s o f
H B a n d H A o n t h e P o l a r i z a b i l i t y o f e r y t h r o e y t e m e m b r a n e s i t w a s f o u n d t h a t t h e
e f f e e t o f H B w a s g r e a t e r t h a n t h a t o f H A w h e n t h e e o n e e n t r a t i o n s w e r e m o r e
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