全 文 ：356
阿魏侧耳胞外多糖
对小鼠巨噬细胞的激活作用
王 晶1，2，3，张春丹1，杨利敏1，解春艳1，2，3，杜 娟1，2，3，闫训友1，2，3，吴智艳1，2，3，*
(1.廊坊师范学院生命科学学院，河北廊坊 065000;
2.河北省高校食药用菌应用技术研发中心，河北廊坊 065000;
3.廊坊市食用菌技术重点实验室，河北廊坊 065000)
收稿日期:2015－10－09
作者简介:王晶(1983－) ，女，博士，讲师，研究方向:动物细胞工程和生物活性物质，E－mail:oucflora@ 163.com。
* 通讯作者:吴智艳(1962－) ，女，教授，研究方向:食用菌栽培与深加工，E－mail:lfwuzhiyan@ 126.com。
基金项目:河北省高等学校科学技术研究青年基金项目(QN2016019) ;河北省高等学校科学研究计划优秀青年基金项目(YQ2013027) ;河北省高
校食药用菌应用技术研发中心项目(YF201411 － 321) ;河北省高等学校遗传学重点发展学科项目(201221) ;廊坊师范学院微生物学重
点学科项目(201501) ;廊坊师范学院大学生创新训练计划项目(201510100036)。
摘 要:利用巨噬细胞体外培养体系，研究阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用。无菌获得小鼠腹腔巨噬细
胞，中性红吞噬实验检测细胞吞噬活性;荧光探针标记和 Griess反应分别检测细胞内外 NO的含量，酶联免疫吸附法检
测细胞内一氧化氮合成酶(NOS)、培养上清中肿瘤坏死因子－α(TNF－α)、白细胞介素－1(IL－1)和白细胞介素 12
(IL－12)的含量。结果表明，与空白组相比，25～200 mg /L 阿魏侧耳胞外多糖可显著增强巨噬细胞的吞噬活性(p ＜
0.05) ，增加细胞因子 IL－1(p ＜ 0.05)和 IL－12(p ＜ 0.05)的分泌量;50～200 mg /L 阿魏侧耳胞外多糖可显著提高细胞
NOS(p ＜ 0.05)和 NO(p ＜ 0.05)的含量以及 TNF－α的分泌量(p ＜ 0.05)。因此，一定浓度阿魏侧耳胞外多糖对体外培
养的小鼠巨噬细胞具有激活作用。
关键词:胞外多糖，荧光探针，一氧化氮合成酶，白细胞介素－1，白细胞介素－12
Activation effects of extracellular polysaccharides produced
by Pleurotus ferulae Lanzi on murine macrophage
WANG Jing1，2，3，ZHANG Chun－dan1，YANG Li－min1，XIE Chun－yan1，2，3，
DU Juan1，2，3，YAN Xun－you1，2，3，WU Zhi－yan1，2，3，*
(1.College of Life Sciences，Langfang Teachers University，Langfang 065000，China;
2.Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities，Langfang 065000，China;
3.Edible Fungi Key Laboratory of Langfang City，Langfang 065000，China)
Abstract:The culture system of macrophages was established to investigate the activation effects of extracellular
polysaccharides produced by Pleurotus ferulae Lanzi(IPP)on murine macrophage.Murine macrophages were
cultured in sterile environment.Phagocytic activity，the content of nitric oxide synthetase(NOS)and nitric oxide
(NO) ，the levels of tumor necrosis factor－α(TNF－α) ，interleukin－1(IL－1) ，and interleukin－12(IL－12)in culture
supernatant were examined with neutral red phagocytosis test，fluorescein labeled probe technique，griess reaction
and enzyme－ linked immunosorbent assay(ELISA) ，respectively.The results showed that IPP in the range of 25～
200 mg /L reduced absorbance of neutral red in cytoplasm(p ＜ 0.05) ，improved the secretion level of IL－1(p ＜
0.05)and IL－12(p ＜ 0.05)in culture supernatant.And IPP in the range of 50～200 mg /L increased the content of
NOS(p ＜ 0.05)and NO(p ＜ 0.05) ，and the secretion level TNF－α(p ＜ 0.05).So murine macrophages cultured in
vitro could be activated by IPP at a certain concentration.
Key words:extracellular polysaccharides;fluorescein labeled probe;nitric oxide synthase;interleukin － 1;
interleukin－12
中图分类号:TS201.4 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2016)10－0356－04
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 10． 065
多糖广泛分布于动植物和微生物中，是自然界
中含量最丰富的大分子化合物之一［1］，根据在细胞中
存在部位不同，多糖分为胞内多糖、胞壁多糖和胞外
多糖三种，与胞内多糖不同，真菌胞外多糖易与菌体
357
分离，可通过深层发酵获得［2－3］。
阿魏侧耳(Pleurotus ferulae lanzi) ，是一种具有很
高食药用价值的担子菌，具有抗肿瘤，提高免疫
力［4－5］和延缓衰老等功效［6］，阿魏侧耳胞外多糖是从
阿魏侧耳液体发酵液中提取的多糖组分［3］，目前对于
阿魏侧耳胞外多糖生物活性的研究局限在体内研究
阶段［7］，未有体外激活巨噬细胞及其机理的相关报
道。本文利用建立的小鼠巨噬细胞体外培养体系，
研究阿魏侧耳胞外多糖对巨噬细胞吞噬和细胞因子
分泌等免疫功能的影响作用，为其在食品、药品中的
进一步开发利用提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
阿魏侧耳(Pleurotus ferulae Lanzi)胞外多糖 实
验室制备［3］;BALB /C 小鼠 动物许可证号:SCXK
(京)2011－0011，北京维通利华实验动物技术有限公
司;胎牛血清(FBS) 上海生物工程有限公司;
DMEM 美国 Gibco公司;脂多糖(LPS) 美国 Sigma
公司;一氧化氮检测试剂盒、一氧化氮 DAF－FM DA探
针 碧云天生物技术有限公司;小鼠一氧化氮合成酶
(NOS)、肿瘤坏死因子(TNF－α)、白细胞介素－1(IL－1)
和白细胞介素－12(IL－12)ELISA检测试剂盒 美国
R＆D公司;青霉素和链霉素 山东鲁抗医药股份有
限公司;实验中所用其他试剂 均为分析纯。
MCO－20AIC 二氧化碳培养箱 日本 SONYA 公
司;FD－1D－50 真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪
器有限公司;ZHJH－C超净工作台 上海智城分析仪
器制造有限公司;BX50 系统(荧光)显微镜(配有
DP71 成像系统)、CKX41SF 倒置显微镜 日本
Olympus 公司;MLS－3750 高压蒸汽灭菌锅 日本
SONYA公司;iMark 酶标仪 美国 Bio － Rad 公司;
Milli－Q超纯水机 美国 Millipore 公司。VCX130 超
声波细胞破碎仪 美国 Sonics公司。
1.2 实验方法
1.2.1 多糖溶液的配制 阿魏侧耳胞外多糖用
DMEM培养液溶解，0.22 μm 针头滤器过滤除菌后得
浓度为 2 g /L的阿魏侧耳胞外多糖母液，冰箱中冷藏
备用。
1.2.2 小鼠巨噬细胞的获得及多糖处理 参考王晶
等［7］方法。小鼠颈椎脱臼处死，75% 酒精浸泡，注
5 mL DMEM完全培养液(含 10%体积分数的胎牛血
清)至腹腔，静置 5 min，超净工作台中无菌打开腹
腔，收集腹腔液，1500 r /min 离心 10 min，弃上清，
DMEM完全培养液重悬细胞并接种至培养皿中，
37 ℃，5% CO2 培养箱培养 4 h，弃培养液，磷酸盐缓
冲溶液(PBS)漂洗去未贴壁细胞，胰蛋白酶消化，收
集细胞，1500 r /min 离心 10 min，弃上清，DMEM完全
培养液重悬后得纯化的小鼠巨噬细胞悬液。台盼蓝
染色后计数，调整活细胞密度为 5.0 × 105个 /mL分别
接种至培养皿或细胞培养板中，多糖处理组添加
2 g /L的阿魏侧耳胞外多糖母液，终浓度分别为 0、
25、50、100、200 mg /L，阳性对照组添加终浓度为
20 μg /mL的LPS，置于 CO2 培养箱中培养。
1.2.3 巨噬细胞吞噬能力检测 采用中性红法［8］。
按上述方法获取、纯化并接种巨噬细胞至 96 孔细胞
培养板中，接种量为 200 μL。每组设 10 个重复孔。
培养板用 PBS 漂洗 3 次后，每孔添加终浓度 0.075%
中性红溶液(无菌 PBS 配制)100 μL，置 37 ℃，5%
CO2 恒温培养箱中孵育 1 h，吸弃上层溶液，PBS 漂洗
后加入细胞裂解液(0.01 mol /L冰醋酸与无水乙醇混
合液，体积比为 1∶ 1)200 μL，4 ℃静置过夜。酶标仪
检测 490 nm处吸光值 A490 nm。
1.2.4 巨噬细胞 NO含量测定 NO的生成采用荧光
探针法检测［9］。按照上述方法获取、纯化并接种巨噬
细胞至载玻片(置于培养皿中) ，待细胞贴壁后，添加
足量 DMEM(含 10% FBS)培养液。每组设 3 个重
复。多糖处理 24 h后，收集培养上清，离心后冰箱冷
藏备用。取出载玻片，细胞面朝上，添加稀释好的
DAF－FM DA探针，37 ℃细胞培养箱内孵育 20 min。
PBS 洗涤细胞三次，充分去除未进入细胞内的
DAF－FM DA探针，加盖洁净的盖玻片后，荧光显微
镜观察拍照。
NO含量的测定采用 Griess 法［10］。依照试剂盒
说明，酶标板分设为标准孔、空白孔和待测样品孔，
标准孔依次加浓度分别为 0、1、2、5、10、20、40、60、
100 μmol /L标准品(NaNO2)溶液 50 μL，空白孔加标
准品稀释液(DMEM完全培养液)50 μL，样品孔加不
同处理组巨噬细胞培养上清，各孔分别添加 50 μL
Griess Reagent Ⅰ及 50 μL Griess Reagent Ⅱ。酶标仪
检测 540 nm处吸光值 A540 nm，根据浓度标准曲线计算
样品中 NO浓度。
1.2.5 一氧化氮合成酶(NOS)含量测定 按上述方
法获取、纯化和接种细胞至培养皿中，接种量为
5 mL。多糖处理 24 h后，细胞刮刀刮取细胞，离心，弃
上清，磷酸缓冲溶液(PBS)重悬，超声波细胞破碎仪
破碎细胞(功率 39 W;工作时间 3 s，停止时间 3 s，共
50 个循环) ，离心，收集上清，采用双抗体一步夹心法
酶联免疫吸附实验［10］测定巨噬细胞内 NOS含量。
按照试剂盒说明，取出室温平衡 20 min 后的板
条，设置标准品孔、空白孔和样品孔，标准品孔各加
入不同浓度的标准品 50 μL，样品孔加待测样品
10 μL和 40 μL样品稀释液，空白孔不加。除空白孔
外，标准孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶标
记的检测抗体 100 μL，37 ℃温育 30 min。弃去液体，
吸水纸拍干，洗涤液洗涤 5 次，吸水纸拍干，每孔加
入底物 A、B各 50 μL，37 ℃避光孵育 15 min 后每孔
加入终止液 50 μL，酶标仪检测 450 nm 波长处各孔
A450 nm，根据浓度标准曲线计算样品中 NOS浓度。
1.2.6 TNF－α、IL－1 和 IL－12 含量测定 采用双抗
体一步夹心法酶联免疫吸附实验［11］。取出多糖处理
后的巨噬细胞培养上清，按照试剂盒说明操作(方法
同 1.2.5) ，根据浓度标准曲线计算 TNF－ α、IL－1 和
IL－12含量。
1.2.7 统计方法 结果以平均数 ± 标准差表示
(珋x ± s) ，采用 SPSS20.0 软件进行单因素方差分析
(ANOVA)。p ＜ 0.05，表示差异性显著。
358
2 结果与分析
2.1 阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞吞噬活性的
影响
利用中性红法检测巨噬细胞吞噬功能，通过测定
细胞内中性红的含量来反映巨噬细胞的吞噬能力。结
果显示(表 1) ，培养体系中添加了阿魏侧耳胞外多糖
(25～200 mg /L)、LPS(20 mg /L)的巨噬细胞中，中性红
的含量显著增加(p ＜ 0.05) ，表明，阿魏侧耳胞外多糖
对小鼠巨噬细胞的吞噬能力有增强作用。
表 1 阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响
Table 1 Effect of IPP
on phagocytic activities of murine macrophages
组别 添加量(mg /L) 吸光值(A490)
对照组 0 0.40 ± 0.03
多糖处理组
25 0.54 ± 0.06*
50 0.59 ± 0.06*
100 0.60 ± 0.05*
200 0.61 ± 0.05*
LPS处理组 20 0.63 ± 0.07*
注:“* ”表示与空白对照组相比，差异显著(p ＜ 0.05) ;表 2、
表 3 同。
2.2 阿魏侧耳胞外多糖对巨噬细胞 NO 和 NOS 含
量的影响
巨噬细胞在免疫活化或外界信号刺激下，细胞
内可诱导型一氧化氮合成酶基因被诱导表达，催化
精氨酸氧化成瓜氨酸并产生大量的 NO［12］。DAF－
FM DA 是最新一代用于 NO 定量检测的荧光探
针［13］，能够进入细胞并被细胞内酯酶催化形成不能
穿过细胞膜的 DAF－FM。DAF－FM 本身仅有很弱的
荧光，但和细胞内 NO 反应后可以产生强烈的荧
光［14］。荧光结果显示(图 1) ，对照组和添加 25 mg /L
阿魏侧耳胞外多糖组的巨噬细胞内的荧光较弱，说
明两组巨噬细胞可能没有产生 NO，细胞内的荧光是
DAF－FM自发荧光。而添加 50～200 mg /L阿魏侧耳
胞外多糖、20 mg /L LPS 的巨噬细胞内绿色荧光的强
度和平均光密度明显增强(p ＜ 0.05) (见图 1C～F 和
图 2) ，表明，添加 50～200 mg /L的阿魏侧耳胞外多糖
诱导巨噬细胞产生了 NO。
NO是一种重要的参与机体炎症反应和免疫调
节的脂溶性气体信号分子，可通过细胞膜快速扩散，
细胞外 NO极不稳定，被氧化后以 NO －3 或 NO
－
2 的形
式存在，NO －2 可以被 Griess Reagent 检测，在一定程
度上反映扩散到细胞外的一氧化氮的相对量［15］，不
同样品对巨噬细胞 NO 含量的影响如表 2 所示。由
表 2 可知，随着阿魏侧耳胞外多糖添加量的增加，巨
噬细胞 NOS和 NO的含量不断增加，与对照相比，添
加量 25 mg /L的胞外多糖对巨噬细胞 NOS 和 NO 的
含量无明显影响，添加量 50～200 mg /L 的胞外多糖
和 20 mg /L LPS则显著增加了巨噬细胞 NOS 和 NO
的含量(p ＜ 0.05)。表明，添加量 50～200 mg /L 的阿
魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞具有活化作用，并
诱导其产生更多的 NOS和 NO。
图 1 NO荧光探针标记的小鼠巨噬细胞(200 ×)
Fig.1 Murine macrophage stained
by fluorescence probe for NO(200 ×)
注:A，空白对照组;B～E，25、50、100、200 mg /L
阿魏侧耳胞外多糖处理组;F，20 mg /L LPS处理组。
图 2 小鼠巨噬细胞中 NO荧光探针的平均光密度值
Fig.2 Mean optical density of fluorescence probe
for NO in murine macrophage
注:“* ”，表示与对照组相比，差异显著(p ＜ 0.05)。
表 2 阿魏侧耳胞外多糖
对小鼠巨噬细胞胞外 NO和 NOS含量的影响
Table 2 Effects of IPP on content of
NO and NOS of murine macrophages
组别
添加量
(mg /L)
NOS
(μmol /L)
NO
(μmol /L)
对照组 0 4.93 ± 0.48 3.39 ± 0.420
多糖处理组
25 5.52 ± 0.51 3.63 ± 0.54
50 6.53 ± 0.48* 5.06 ± 0.83*
100 9.76 ± 0.20* 7.96 ± 0.84*
200 20.67 ± 0.23* 8.26 ± 1.59*
LPS处理组 20 8.17 ± 0.15* 16.25 ± 1.06*
2.3 阿魏侧耳胞外多糖对巨噬细胞 TNF－α、IL－1
和 IL－12 分泌量的影响
正常巨噬细胞(又称为常驻巨噬细胞)处于相对
静止状态，很少甚至不分泌细胞因子，可在抗原刺激
359
表 3 阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞多种细胞因子分泌量的影响
Table 3 Effects of IPP on secretion level of cytokines of murine macrophages
组别 添加量(mg /L) TNF－α(ng /L) IL－1(ng /L) IL－12(ng /L)
对照组 0 62.77 ± 4.36 17.59 ± 2.12 6.93 ± 0.44
多糖处理组
25 66.97 ± 1.77 21.00 ± 1.92* 8.28 ± 1.46*
50 68.82 ± 0.40* 18.03 ± 0.32* 8.35 ± 0.10*
100 71.81 ± 4.68* 19.86 ± 0.18* 7.66 ± 0.39*
200 69.63 ± 1.05* 21.13 ± 0.78* 9.07 ± 2.00*
LPS处理组 20 75.84 ± 2.74* 26.51 ± 0.12* 9.86 ± 0.10*
下发生活化，转变成炎症巨噬细胞，表现为对病原体
和肿瘤细胞杀伤活性增强、分泌大量细胞因子(如
TNF－α、IL－1、IL－12)等生物活性的变化［16－18］。TNF－α
是由巨噬细胞分泌产生的一种多效细胞因子，它具
有杀伤或抑制肿瘤细胞、提高机体的免疫调节功能、
提高中性粒细胞的吞噬活性以及抗感染等功效;
IL－1 主要由活化的单核－巨噬细胞产生，可活化胸腺
细胞和 T细胞，促进 B 细胞增殖和抗体的分泌，调节
机体免疫能力;IL－12 由 B 细胞和巨噬细胞等产生，
具有激活 NK 细胞、刺激 T 细胞增殖等作用［19］。由
表 3 可知，随着阿魏侧耳胞外多糖添加量的增加，
TNF－α、IL－1、IL－12 三种细胞因子的分泌量均呈上
升趋势。其中，添加量 25～200 mg /L 的胞外多糖可
显著提高小鼠巨噬细胞 IL－1 和 IL－12 的分泌量
(p ＜ 0.05)。添加量 50～200 mg /L 的胞外多糖可显著
增加小鼠巨噬细胞 TNF－α 的分泌量(p ＜ 0.05)。表
明，一定添加量的的阿魏侧耳胞外多糖可活化小鼠
巨噬细胞，诱导其产生更多的 TNF－α、IL－1、IL－12
等促炎细胞因子。
3 结论
本文采用原代培养技术获得大量小鼠巨噬细
胞，建立了其体外培养体系，并利用这一体系研究了
阿魏侧耳胞外多糖对体外培养的巨噬细胞的激活作
用。根据中性红实验、Griess实验和酶联免疫吸附实
验，可知添加一定浓度的阿魏侧耳胞外多糖可增强
小鼠的吞噬能力，提高巨噬细胞 NOS 和 NO 的含量，
增加免疫相关细胞因子 TNF－α、IL－1 和 IL－12 的分
泌量。由此可见，从阿魏侧耳液体发酵液中获得的
胞外多糖具有激活巨噬细胞并增强机体细胞免疫的
功能，这为阿魏侧耳液体发酵液的进一步开发利用
具有一定的指导意义。
参考文献
［1］戴慧，高晓明 .多糖特异性免疫识别的分子机制及其免疫
生物学意义［J］.中国免疫学杂，2009，25(1) :35－39.
［2］张金波 .阿魏侧耳深层发酵条件及其胞外多糖理化性质
的研究［D］.武汉:华中农业大学，2005.
［3］闫训友，闫春江，史振霞，等 .乙醇提取阿魏侧耳发酵液多
糖的优化设计［J］.食品工业科技，2008，29(1) :197－199.
［4］邓春生，吕作舟 .阿魏侧耳水溶性多糖免疫活性的研究
［J］.华中农业大学学报，2002，21(5) :447－449.
［5］王金辉，黄健，巩平，等 .阿魏侧耳多糖抗癌作用机理研究
［J］.中国现代中药，2011，13(1) :39－43.
［6］田金强，朱克瑞，李新明，等 .阿魏菇多糖的抗氧化功能及
其对果蝇寿命的影响［J］.食品科学，2006，27(4) :223－226.
［7］王晶，闫训友，王万雷，等 .阿魏侧耳胞外多糖对荷瘤小鼠
免疫能力的影响［J］.食品科学，2014，35(15) :268－271.
［8］余叶红，郭本恒，吴正钧，等 .干酪乳杆菌 LC2W 细胞壁组
分对 RAW264.7 巨噬细胞吞噬活性的影响［J］.中国微生态学
杂志，2009，21(1) :23－25.
［9］谢燕霞 .芦笋多糖对巨噬细胞的免疫调节研究［D］.济南:
山东师范大学，2008.
［10］朱培欣，梅余霞，梁运祥 .一种虫草多糖的体外免疫学活
性［J］.食品科技，2013，38(9) :25－28.
［11］陈璐 .MAPK 信号通路在 β－葡聚糖刺激巨噬细胞生成
NO和 TNF－α中的作用［D］.镇江:江苏大学，2008.
［12］翟中和 .细胞生物学［M］.第四版 .北京:高等教育出版
社，2014:165.
［13］Cheng W W，Lin Z Q，Ceng Q，et al. Single － wall carbon
nanotubes induce oxidative stress in rat aortic endothelial cells
［J］. Toxicology Mechanisms and Methods，2012，22 (4) :
268－276.
［14］Ma WW，Xu W Z，Xu H，et al. Nitric oxide modulates
cadmium influx during cadmium－ induced programmed cell death
in tobacco BY－2 cells［J］.Planta，2010，232(2) :325－335.
［15］王永敏 .发酵蛹虫草胞外多糖的分离提取及对巨噬细胞
的激活作用研究［D］.济南:山东师范大学，2006.
［16］金伯泉 .细胞和分子免疫学［M］.第二版 .北京:科学出版
社，2001:482－484.
［17］Lemon J K，Miller M R，Weiser J N.Sensing of Interleukin－1
Cytokines during Streptococcus pneumoniae Colonization
Contributes to Macrophage Recruitment and Bacterial Clearance
［J］.Infection and Immunity，2015，83(8) :3204－3212.
［18］Xie C，Kang J，Ferguson M E，et al.Blueberries reduce pro－
inflammatory cytokine TNF － α and IL － 6 production in mouse
macrophages by inhibiting NF － κB activation and the MAPK
pathway［J］. Molecular Nutrition ＆ Food Research，2011，55
(10) :1587－1591.
［19］周光炎 .免疫学原理［M］.上海:上海科学技术出版社，
2007:40－41.