全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$#"""*&"!$
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收稿日期$!"#&*"0*#) &修改稿收到日期$
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基金项目$科技部转基因生物新品种培育科技重大专项子课题" !"#&12"3"#!*""! # 作者简介$高运通"
#030(
#!男!在读硕士研究生!主要从事植物分子遗传学研究
4*56-7
$&$"3"$0" !88 +9:5 " 通信作者$王爱民!理学硕士!副教授!主要从事植物生理与分子生物学教学与研究
4*56-7
$6-5-/;6/ ,<br./=+>?=+9/ 小立碗藓 1 2 !3,$
基因启动子
分离及其启动活性分析
高运通!潘沈元!王爱民"
"江苏师范大学 生命科学学院!江苏徐州
!!###
#
摘
!
要$@AB) 蛋白在多种植物中被发现并预测在叶片生长发育过程中起作用!但是在高等植物中最古老且唯一 没有维管束的苔藓植物中却未有报道该文通过 CD@EF 比对水稻 !"#$!)
基因编码的氨基酸序列得到小立碗藓
@AB)
蛋白编码基因
%
&
#$!) !扩增 % & #$!)
基因起始密码子上游的启动子序列!利用在线软件
G76/HI@J4
和
GD@I4
分析该启动子的结构特征&并构建启动子分析载体
K
G
K
@AB)*ALE
!转化拟南芥!通过转基因拟南芥
ALE
染色结果分析推测
%
&
#$!) 启动子的启动特性结果显示$"
#
#
%
&
#$!) 基因启动子序列中含有大量的光反应有 关的顺式作用元件以及数个分生组织相关和防御与胁迫相关作用元件" ! # F ! 代转基因拟南芥的 ALE 染色结果 表明! % & #$!)
基因启动子会启动
$( 在拟南芥的不同部位和不同生长时期表达!而且在根尖(叶片顶端(雄蕊的 花药(雌蕊的柱头和种子等部位的染色较其他部位更深" % #生长在光照强度 #"""7M 和 &"""7M 下转基因拟南芥 的 ALE 酶活性比光照强度 )"""7M 和 #""""7M 下的低研究表明所克隆的 % & #$!)
基因启动子具有组成性启
动活性!且在生长旺盛的部位启动活性较强!此外其启动活性还受到光照因素的影响!为进一步研究小立碗藓的
%
&
#$!) 基因功能提供了重要依据 关键词$小立碗藓&
%
&
#$!) &启动子 中图分类号$
N)3$& N)30 文献标志码$
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#146/7-
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*
",-./012334
&
4025"
&
%
&
#$!) & K V:5:H>V !! @AB 蛋白" 6V < :/6=H> K V:H>-/. #是 JP@ 诱导 的沉默复合物" J\EI #的核心成分!它在几乎所有已 知的 JP@ 沉默通路中发挥关键作用!包括维持基 因组的稳定(调控组织发育)#*(对逆境的适应性应答 以及在 JP@ 层面对入侵核酸"转基因和植物病毒# 的免疫等)!* 前人对植物 @AB 蛋白功能的研究在拟南芥中 最为全面和透彻!在拟南芥的 #" 个 @AB 蛋白中全 部具有切割活性所必需的催化三联体 ]]Y 或 ]]] !但目前被证实有切割活性的只有 @H@AB# ( @H@AB& 和 @H@AB) ) %*& * @AB) 最早是在早熟的 拟南芥突变体中与 H6*.-JP@ 一同被鉴定出来的! @?>/:H 等)$*发现
F@E%H6*.-JP@
的产生依赖于
@AB)
蛋白的作用!并且生成的
H6*.-JP@
能继续
与
@H@AB)
结合形成沉默复合体调节下游的靶
5JP@
)
$* * 这是目前为止第一个也是唯一一个被 证实的 @H@AB) 参与的 .-JP@ 通路迄今为止! @AB) 蛋白的功能在水稻(拟南芥等高等开花植物 中的研究已经较为全面!但是在高等植物中最古老 且是唯一一类没有维管束的陆生植物苔藓中尚未有 报道 苔藓植物是最古老的陆生植物之一!广泛分布 于世界各地!虽然属于高等植物!有茎叶的分化但是 茎中无导管!叶中无叶脉!没有输导组织!根的结构 也非常简单称为+假根,)*进化学上认为苔藓植物 和维管植物是起源系统上的一个姐妹进化支从苔 藓植物在进化树上的相对位置说明它是研究陆生植 物进化的理想材料)3*小立碗藓" %) * ",-./012334 & 4025" #属于葫芦藓科小立碗藓属!是目前为止发现 的同源重组率最高的植物!是研究功能基因特性的 理想材料)0*而且在前人对小立碗藓的研究中没有 任何有关 @AB) 蛋白的生物学功能的报道本研 究通过比对拟南芥(水稻和玉米中 #$!)
基因的保
守序列!获得小立碗藓的
@AB)
蛋白编码基因
%
&
#$!) !进而克隆 % & #$!)
基因起始密码子上游
碱基序列!分析其序列结构并构建以
%
&
#$!) 基因 启动子驱动$(
基因表达的启动子分析质粒
K
G*
K
@AB)*ALE
农杆菌介导浸花法转化拟南芥!通
过
ALE
染色和
ALE
活性测定以了解
%
&
#$!) 基 因启动子在拟南芥中的表达特性!为研究小立碗藓 中 % & #$!)
基因的生物学功能提供依据
#
!
材料和方法
;+;
!
实验材料
小立碗藓"
%)
*
",-./012334
&
4025"
#及拟南芥
"
#146/7-
&
"/"0)43/454
#哥伦比亚型由本实验培养
大肠杆菌"
8",)21/,)/4,-3/
#菌种
]Y$" (根癌农杆 菌" # 9 1-64,021/:.0:.2 ; 4,/25" #菌种 4Y@#"$
(启
动子分析载体
K
#%""AP
均由江苏师范大学生命科
学学院保存
F
&
]P@7-
<
6.>
及
<4
=
酶购自
F6^ 6*
J6
公司&限制性内切酶购自
FQ>V5:E9->/H-T-9
公
司&
]P@
片段快速胶回收试剂盒购自北京博大泰克
生物基因技术有限公司引物合成和测序工作均由
上海捷瑞生物工程有限公司完成
;<=
!
1
2
!3,$启动子的克隆及启动子分析质粒的 构建 以小立碗藓成熟茎叶体为材料!用 E]E 法提取 基因组总 ]P@ ) #" * 以水稻的 B.@AB) 蛋白的氨 基酸序列" QHH K$%%
;;;+/9Z-+/75+/-Q+
<
:W
%
K
V:*
H>-/
%
@CB0%%")+#
#为模板对小立碗藓的蛋白质数
据库进行
C76.H
K
"
QHH
K
$%% ;;;+9:.5:..+:V < % Z5 % CD@EF - H RK >_# #比对!得到与 B.@AB) 同源性较 高的蛋白序列!并获得其对应的 ]P@ 碱基序列 利用 GV-5>V$
软件设计正向引物
@GA`
"
$a*9HH@* @AIFFAIFFFFF@@IFFIF@I@FI*%a !下划线 为 >/5? # 酶切位点#和反向引物 @GAJ "$a*666A*
A@FIIAIAAI@FA@FA@I@@@@I@*%a
!下划线
为
?4.Y
$酶切位点#!扩增 % & #$!)
基因起始密
码子上游长
#))%Z
K
的序列扩增条件为
0&b
预
变性
$5-/ & 0&b 变性 &$.
!
$&b 退火 &$.
!
)!b
延
伸
!5-/
!
%"
个循环&
)!b
延伸
#"5-/
&
&b
保存
电泳回收目的基因片段测序
将扩增获得的启动子片段用
?4.Y
$% >/5? # 双酶切后插入到无启动子的含有卡那霉素抗性基因 & 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$
卷
的载体
K
#%""AP
中
?4.Y
$和 >/5? # 之间!后接$(
基因的编码区序列(潮霉素抗性基因
>@$和 A!( 终止子!构建成启动子分析质粒 K G K @AB)* ALE "图 # #酶切鉴定和测序表明构建正确 图 # ! 质粒载体 K G K @AB)*ALE 示意图 DC ( JC+F*]P@ 的左(右边界& P+PBE 终止子& YOA+ 潮霉素抗性 基因编码区& I6[%$E+%$E 启动子& ALE+$(
基因编码区
-`
<
+#
!
E9Q>56H-9?-6
<
V65:THQ>
K
76.5-?
W>9H:V
K
G
K
@AB)*ALE
DC
!
JC+FQ>7>TH6/?V-
<
QHZ:=/?6V
R
:TF*]P@
&
P+PBEH>V5-/6H:V
&
YOA+Y
R<
V:5
R
9-/V>.-.H6/9>
<
>/>9:?-/
<
V>
<
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&
I6[%$E+FQ> %$E
K
V:5:H>V
&
ALE+FQ>9:?-/
<
V>
<
-:/:T$( < >/> ;<> ! 1 2 !3,$
基因启动子序列分析
利用在线启动子分析软件
G76/HI@J4
"
QH*
H
K
$%% Z-:-/T:V56H-9.+ K .Z+= < >/H+Z> % ;>ZH::7. % K 76/H96V> % QH57 %#和 GD@I4 " QHH K$%%
;;;+?/6+6T*
TV9+
<
:+
,K
%
GD@I4
%
.-
<
/67.96/+QH57
#对 克 隆 的
%
&
#$!) 基因启动子潜在的功能进行预测 ;+? ! 拟南芥转化 将启动子分析质粒 K G K @AB)*ALE 通过冻融 法导入到农杆菌 4Y@#"$
中)##*!之后取适量农杆菌
转化子接种至含有
$"5 < % D 卡那霉素的 O4C 液体 培养基中! 3b ( #3"V % 5-/ 振荡培养过夜! B] "" 在 #+! % #+ 之间时室温离心!将农杆菌沉淀重新悬浮 于适当体积的渗透培养基中使 B] "" 在 "+3 左右! 浸花法转化拟南芥)#!* ;<@ ! 转基因拟南芥筛选和 7A% 组织化学染色分析 收集拟南芥种子!消毒后置于含有 %$5
<
%
D
潮
霉素的
#
%
![E
固体培养基上培养
#"?
!将生长正
常的幼苗"转化株#移至土壤中培养待拟南芥成熟
后!分别提取总
]P@
并以
G@A`
和
G@AJ
为引物
GIJ
扩增检验其是否已插入质粒载体分单株收
取转基因拟南芥种子并用上述相同的方法培养得到
F
#
代转化株分别选取不同时期及不同组织的
F
#
代拟南芥转化株按
U>TT>V.:/
的方法进行
ALE
组织
化学染色)#%*
;!
转基因拟南芥不同光照强度处理及
7A%
活性
测定
将培养箱"光照强度
)"""7M
(
#!Q
光照
3Q
黑
暗(
!#b
#中培养
#$? 的 F ! 代拟南芥转化株转到 光照强度分别为 #""" ( &""" ( )""" 和 #""""7M !其 他环境条件不变的培养箱中培养 %? !非转基因拟南 芥置于 &"""7M 光强的培养箱中作为参照 %? 后 测定 ALE 活力!随机选取 & 个处理组转基因拟南芥 及非转基因植株在液氮中研磨!用磷酸缓冲液法提 取总蛋白并测定样品蛋白质含量)#&*然后参照 J-9Q6V? 等)#$*的方法检测各样品中
ALE
的活力
酶活力单位定义为每分钟
GPGA
生成
#/5:7
对硝
基苯酚的酶量为一个单位!
ALE
活力"
L
#以每分钟
每毫 克 蛋 白 的 酶 活 力 表 示 "
/5:7
.
5
<
(#
.
5-/
(#
#
)
#
*
每个处理组设置
%
次重复实验
!
!
结果与分析
=<;
!
1
2
!3,$序列的确定及启动子片段的克隆 通过 C76.H K 比对得到的小立碗藓氨基酸序列 含有 ! 个高度保守的 G@1 和 G\S结构域!具有典 型的 @AB 类蛋白的结构特征为研究 % & #$!)
基因启动子活性!采用
GIJ
扩增从预测的
%
&
#+
$!) 基因启始密码子起上游 #))%Z K 的 ]P@ 片段 "图 ! ! @ #之后将扩增的片段与 F 载体连接然后 转化大肠杆菌 ]Y$
"
!挑取单菌落进行菌落
GIJ
和
?4.Y
$% >/5? # 双酶切鉴定"图 ! ! C #并将阳性克 隆测序!测序结果与数据库" QHH K$%%
;;;+9:.*
5:..+:V
<
#序列一致
=<=
!
1
2
!3,$基因启动子的结构特征 用 G76/HI@J4 数据库分析我们所得 到 的 % & #$!)
启动子序列!结果"图
%
#表明!
%
&
#$!) 基因起始密码子 @FA 上游 #))%Z K 启动子序列中 含有启动子 区域 特征元件 F@F@*Z:M## 个! I@@F*Z:M0 个进一步结构分析发现! % & #$!)
启动子序列中含有高水平转录调控因子
$a*LFJ 嘧 啶密集区"$a*LFJG
R
*V-9Q.HV>H9Q
#&与光反应有关
的
CB2*
$( IA*5:H-T ( IAF*5:H-T ( A*Z:M ( A*C:M ( AF#*5:H-T ( AFAAI*5:H-T 及与病原体(真菌诱导子 侵入有关的 C:M*S# ( [CE ( SZ:M 等顺式作用元 件&同时还发现了数个响应低氧环境的作用元件 @J4 (响应低温脱水的作用元件 I*V> K >6H % ]J4 (与 分生组织有关的作用元件 I@F*Z:M (与防御和物理 胁迫有关的元件 FI*V-9QV> K >6H. 以及响应低温环 境的元件 DFJ 等多个顺式作用元件 =<> ! 启动子分析质粒 5 07C$D7A%
的构建与转
基因植株的获得
按照上述方法将构建的启动子分析质粒
K
G*
K
@AB)*ALE
通过浸花法转化拟南芥分单株收获
)&
%
期
!!!!!!!!!!!
高运通!等$小立碗藓 % & #$!)
基因启动子分离及其启动活性分析
种子并萌发于含有潮霉素的选择培养基上!筛选出
长势良好的幼苗移至土壤中继续生长随机选取
$株转基因拟南芥植物提取总 ]P@ !以 @GA` 和 @GAJ 为引物进行 GIJ 扩增!均获得约 !cZ 条带 图 ! ! 小立碗藓 % & #$!)
启动子的扩增"
@
#与启动子分析质粒
K
G
K
@AB)*ALE
的酶切鉴定"
C
#
@+GIJ
扩增
%
&
#$!) 启动子片段$
[+]D!"""
&
G+%
&
#$!) 启动子& C+ 启动子 K G K @AB)*ALE 质粒酶切鉴定$
[#+#"cZ
&
[!+]D!"""
&
N+
启动子
K
G
K
@AB)*ALE
质粒用
?4.Y
$% >/5? # 双酶切的产物 -` < +! ! @ < 6V:.> < >7>7>9HV: K Q:V>.-.:THQ>% & #$!)
K
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K
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&
4025"6/?
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K
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R
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K
G
K
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R
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<
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K
7-T-96H-:/:T%
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#$!) K V:5:H>V;-HQGIJ & [+]D!""" & G+GV:5:H>V:T% & #$!)
&
C+\?>/H-T-96H-:/:THQ>
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6/67
R
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K
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R
?4.Y
$% >/5? # 图 % ! 小立碗藓 % & #$!)
基因启动子序列特征分析
-`
<
+%
!
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R
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&
#$!) < >/> K V:5:H>VTV:5%B & 4025" 3& 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$
卷
"图
&
#表明获得的植株即为插入了质粒载体
K
G*
K
@AB)*ALE
的转化株
=!
1
2
!3,$启动子的启动活性分析 为了检测所扩增的序列是否具有启动活性!分 图 & ! 转基因拟南芥的 GIJ 检测结果 [+]D!""" & d+ 阳性对照& (+ 阴性对照& # %$+
转基因拟南芥
-`
<
+&
!
GIJ6/67
R
.-.:THV6/.
<
>/-9#146/7-
&
"/"
[+]D!"""
&
d+G:.-H-W>9:/HV:7
&
(+P>
<
6H-W>
9:/HV:7
&
#($+FV6/. < >/-9#146/7- & "/" 别选取生长 #" ( !" ( &$
和
$$? 等 & 个时期的转基因 拟南芥的根(茎(叶(花和果实!进行 ALE 组织化学 染色"图 $ #由图可见!拟南芥转化株在这 & 个时 期都有显色!而且在各自时期的根(叶(茎(花和种子 部位也都有不同程度的着色"图 $ ! @ % #并且在 根尖(叶片顶端(雄蕊的花药(雌蕊的柱头和种子这 些部位的染色相对于其他部位更深"图 $ ! ] ( U ( ^ 和 D #由此可以推测该启动子可能在个体生长发育 的整个时期都有启动活性 =<@ ! 1 2 !3,$ 启动子的启动活性与光照强度关系 由于 % & #$!) 启动子的序列分析中发现有很 多光敏感的作用元件!为此分析了不同光照强度下 该启动子活性结果"图 #显示!在光照强度 )""" 7M 和 #""""7M 条件下!转基因拟南芥中 ALE 活性 图 $ ! F ! 代转基因拟南芥各个时期不同部位 ALE 组织化学染色 @ ( C ( U+#"? 的拟南芥& I ( ] ( ^+!"? 的拟南芥& 4 ( ` ( D+&$? 的拟南芥& A % \+$$ ?
的拟南芥&
@
%
`
(
U
%
D
用解剖显微镜拍摄!
A
%
用数码相机拍摄
-`
<
+$! FQ>ALE.H6-/-/ < :TH;:* < >/>V6H-:/HV6/. < >/-9#146/7- & "/"6HW6V-:=.H-5>.6/?-/?-TT>V>/H K 6VH. @ ! C ! U+#"?6 R .:T#146/7- & "/" & I ! ] ! ^+!"?6 R .:T#146/7- & "/" & 4 ! ` ! D+&$?6
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#
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期
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高运通!等$小立碗藓
%
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#$!)
基因启动子分离及其启动活性分析
图

!
转基因拟南芥
ALE
活性与光照强度关系柱状图
-`
<
+
!
FQ>Q-.H:
<
V65:TALE>/X
R
5>69H-W-H
R
6H?-TT>V>/H
7-
<
QH-/H>/.-H->.-/HV6/.
<
>/-9#146/7-
&
"/"
无显著差异!都在
%"/5:7
.
5
<
(#
.
5-/
(#左右而
在光照强度
#"""7M
和
&"""7M
条件下!转基因拟
南芥中的
ALE
活性则要显著低于
#""""7M
条件
"
%
#
"+"#
#与光照强度
#"""7M
相比!光照强度
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(
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和
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下生长的转基因拟南芥中
的
ALE
活性分别是其
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倍(
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倍和
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倍
在非转基因拟南芥中!
ALE
活性几乎为零
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讨
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论
@AB
蛋白是一个高度保守且庞大的家族!作为
沉默复合体的核心成分!在
JP@
沉默中发挥着关
键作用)#)*
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蛋白是植物体内特有的一种小
JP@
即反式作用小
JP@
"
H6*.-JP@
#生物合成途
径中必需的拟南芥
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基因敲除突变体表
现为早熟!继而导致叶片形态结构的缺陷)#3*水稻
中
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基因的超表达会引起叶片内卷)#0*在
玉米中
C.#$!)
基因下调突变株中!叶片维管束生
成异常!从而影响了叶片的形态)!"*番茄中
(D#+
$!)
在营养组织叶中微弱表达!而在生殖器官花中
强烈表达!表达量从花蕾到盛开的花呈递增趋势!但
在果实不同发育时期中表达都非常微弱甚至不表
达)!#*由此推测
@AB)
蛋白介导的
H6*.-JP@
途径
可能在植物叶片和花器官的形态结构和发育过程起
到一定作用本实验从小立碗藓中分离出
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基因起始密码子上游
#))%Z
K
的启动子片段!
并以此构建启动子分析载体!在转基因拟南芥的
ALE
染色结果中!根尖(叶顶端和花的花药与柱头
都有较深的着色!而这些一般都是生长分化较快的
部位!说明此段启动子区域的启动活性具有组织特
异性!并且也预示着
%
&
#$!)
基因可能在小立碗藓
的组织生长发育(叶片极性生长和花的发育的过程
中起到一定的的调控作用
N=
等)!!*发现!拟南芥
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和
#0#$!#
共
同参与由
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介导的对芜菁皱缩病毒"
FIe
#的
免疫反应!其中
#0#$!#
占主导作用而
#0#$!)
起
辅助作用在
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基因启动子序列中也发现
了与病原体(真菌诱导子侵入有关的顺式作用元件
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(
SZ:M
和
[CE
!其中
[CE
是
[OC
转录
因子的结合位点!
[OC
转录因子家族参与植物苯
丙烷类次生代谢途径的调节!而苯丙烷类次生代谢
途径在植物抗病害作用中发挥着重要作用)!%*这
似乎预示着
%
&
#$!)
基因可能在对抗入侵病原体
和真菌诱导子的过程中发挥作用!但还有待于进一
步的实验验证另外!由于在
%
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#$!)
启动子序列
中有大量的光响应有关作用元件!为了探究此片段
启动活性是否与光照因素有关!本实验又设置了
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组不同的光照强度培养
F
!
代转基因拟南芥!并分
别测定
ALE
酶活性结果也证明了光照强度的高
低确实会影响
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基因启动子的启动活性
这些结果都为进一步探究小立碗藓中
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蛋白
的生物学功能提供了重要的基础
参考文献!
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其中$知识创新工程基金 ! 项!西部之光基金 ) 项!其它基金 #" 项 >+ 各部委基金! 3! 项!占基金项目总数的 #"+)g 其中$科技部基金
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基因启动子分离及其启动活性分析