全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(１): ８０￣８７(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０３￣２４ꎻ 修回日期: ２０１３￣１０￣２５
基金项目: 国家科技部 ８６３项目(２０１２ＣＢ１１１４０１)
通讯作者: 刘西莉ꎬ教授ꎬ主要从事杀菌剂与病原菌互作及病原卵菌致病机制研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｓｅｅｄｌｉｎｇ＠ｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 李波涛ꎬ男ꎬ浙江台州人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事杀菌剂与病原菌互作研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｉｂｏｔａｏ￣０６６＠１６３.ｃｏｍꎮ
水稻稻瘟病菌对烯肟菌胺的抗性风险评估
及抗性机制初探
李波涛１ꎬ 吴隆起１ꎬ 倪笑霞１ꎬ 王艳辉２ꎬ 刘西莉１∗
( １中国农业大学 农学与生物技术学院ꎬ 北京 １００１９３ꎻ ２ 北京市平谷区植物保护站ꎬ 北京 １０１２００)
摘要:采用菌丝生长速率法测定了 １００株采自我国主要水稻产区的水稻稻瘟病菌对烯肟菌胺的敏感性ꎬ结果表明ꎬ其 ＥＣ５０
分布于 ０.０１１ １~０.２９５ ６ μｇ􀅰ｍＬ－１ꎬ平均 ＥＣ５０ ＝(０.０７８ ６±０.０５６ １) μｇ􀅰ｍＬ
－１ꎮ 供试菌株对烯肟菌胺的敏感性分布呈单侧
峰曲线ꎬ未出现抗药性亚群体ꎬ可将该曲线作为稻病瘟菌对烯肟菌胺的敏感性基线ꎮ 通过室内药剂驯化获得了 ７株抗药突
变体ꎬ突变频率为 １.１１×１０－４ꎬ其中 ２株高抗突变体 ＮＪ０８１１￣Ｉ和 Ａ１０的抗性水平大于 １ ０００倍ꎬ抗药性性状能稳定遗传ꎬ致病
力显著弱于其亲本菌株ꎻ５株低抗突变体抗性水平在 ２.０５~ ４.５５倍之间ꎬ抗药稳定性差ꎬ适合度与亲本无显著性差异ꎮ 交互
抗药性结果表明ꎬ烯肟菌胺与嘧菌酯存在正交互抗药性ꎬ与田间防治稻瘟病常用药剂稻瘟灵、异稻瘟净无交互抗药性ꎮ 综
合分析表明ꎬ稻瘟病菌对烯肟菌胺可能存在低到中等抗性风险ꎮ 进一步克隆了抗药突变体及其亲本的 ｃｙｔｂ基因ꎬＣＹＴＢ氨
基酸序列比对结果表明ꎬ２株高抗突变体均在 １４３位由甘氨酸突变为丝氨酸(Ｇ１４３Ｓ)ꎬ建立了高抗菌株的 ＡＳ￣ＰＣＲ 分子检
测方法ꎻ而 ５株低抗突变体 ｃｙｔｂ基因未发生点突变ꎬ推测可能存在其他的抗性分子机制ꎮ
关键词:稻瘟病菌ꎻ 烯肟菌胺ꎻ 敏感基线ꎻ 抗性风险评估ꎻ 抗药性分子机制
Ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ
ｏｒｙｚａｅ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ｔｏ ＳＹＰ￣１６２０ 　 ＬＩ Ｂｏ￣ｔａｏ１ꎬ ＷＵ Ｌｏｎｇ￣ｑｉ１ꎬ ＮＩ Ｘｉａｏ￣ｘｉａ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｙａｎ￣ｈｕｉ２ꎬ
ＬＩＵ Ｘｉ￣ｌｉ１ 　 ( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｂｅｉｊｉｎｇ
Ｐｉｎｇｇｕ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０１２００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ １００ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｒｉｃｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｒｅａｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｔｏ
ＳＹＰ￣１６２０ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｏｌｏｎｙ ｄｉａｍｅｔｅｒ ａｓｓａｙ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＥＣ５０ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ
０.０１１ １－０.２９５ ６ μｇ􀅰ｍＬ－１ . Ｔｈｅ ｍｅａｎ ＥＣ５０ ｖａｌｕｅ ｗａｓ (０.０７８ ６±０.０５６ １) μｇ􀅰ｍＬ
－１ . Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
ｏｆ Ｍ. ｏｒｙｚａｅ ｔｏ ＳＹＰ￣１６２０ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ａｓ ａ ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｐｅａｋ ｃｕｒｖｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｕｂ￣
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓꎬ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｂａｓｅｌｉｎｅ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｆｉｅｌｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｍ.
ｏｒｙｚａｅ ｔｏ ＳＹＰ￣１６２０. Ｔｗｏ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｆｉｖｅ ｌｏｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ ａｄ￣
ａｐｔａｔｉｏｎ ａｔ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ １.１１×１０－４ . Ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｓｔａｂｌｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ａ￣
ｂｏｖｅ １ ０００ ｆｏｌｄｓꎬ ｂｕｔ ｔｈｅ ｌｏｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｈｉｃｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ２.０５ ｔｏ ４.５５ ｆｏｌｄｓ ａｎｄ ｕｎｓｔａｂｌｅ. Ａｓ
ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｐａｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓꎬ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｎ ｒｉｃｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ￣
ｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｆｉｔｎｅｓｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｌｏｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｐａｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ. Ｃｒｏｓｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｒｏｓｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＹＰ￣１６２０
ａｎｄ ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎꎬ ｂｕｔ ｎｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＹＰ￣１６２０ ａｎｄ ｉｐｒｏｂｅｎｆｏｓꎬ ｉｓｏｐｒｏｔｈｉｏｌａｎｅ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉ￣
ｃａｎｔｌｙ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｆｉｔｎｅｓｓꎬ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｉｓｋ ｏｆ Ｍ. ｏｒｙｚａｅ ｔｏ ＳＹＰ￣１６２０ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｌｏｗ ｔｏ ｍｏｄｅｒａｔｅ. Ｔｈｅ ｃｙｔｂ
ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐａｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ. Ｏｎｅ ｓｉｎｇｌｅ￣ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ＣＹＴＢ ａｔ ａｍｉｎｏ
　
　 １期 　 　 李波涛ꎬ等:水稻稻瘟病菌对烯肟菌胺的抗性风险评估及抗性机制初探
ａｃｉｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎ １４３ ｆｒｏｍ ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｏ ｓｅｒｉｎｅ (Ｇ１４３Ｓ)ꎬ ｗｈｉｃｈ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｍ.
ｏｒｙｚａｅ ｔｏ ＳＹＰ￣１６２０. Ｔｈｅ ＡＳ￣ＰＣＲ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ Ｇ１４３Ｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｆｉｅｌｄ. Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ
ｃｙｔｂ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ: Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅꎻＳＹＰ￣１６２０ꎻｂａｓｅｌｉｎｅ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎻｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｉｓｋꎻｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
中图分类号: Ｓ４３２.１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０１￣００８０￣０８
　 　 稻瘟病是流行最广、危害最严重的世界性水稻
病害之一ꎬ可引起大幅减产ꎬ轻者减产 ２０％ ~ ３０％ꎬ
重者减产 ５０％以上ꎬ甚至颗粒无收ꎮ ２０ 世纪 ９０ 年
代以来ꎬ该病害每年在我国发生面积均在 ３８０ 万
ｈｍ２ 以上ꎬ每年造成数亿千克的稻谷产量损失 [１]ꎮ
稻瘟病菌无性世代为 Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅꎬ有性世代
为 Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅꎮ 目前ꎬ生产上稻瘟病的防
治主要是采用抗病育种和化学防治 ２ 种措施[２]ꎮ
但因稻瘟病菌生理小种变异快ꎬ易导致品种抗病性
丧失[３]ꎬ化学防治以其快速、高效等特点ꎬ仍然是
稻瘟病综合治理体系中重要的组成部分ꎬ尤其在病
害大流行或品种抗性丧失期间更显现出其不可替
代的作用ꎮ 目前ꎬ生产上用于防治稻瘟病的化学药
剂主要有稻瘟灵、异稻瘟净、春雷霉素、三环唑、肟
菌酯、烯肟菌胺、咪鲜胺和戊唑醇等[４]ꎮ 随着一些
杀菌剂的高频率、单一性连续重复使用ꎬ田间产生
了抗药性菌株并出现防治效果下降的现象ꎮ Ｍｉｕｒａ
等[５]报道了日本山形县稻瘟病菌对春雷霉素产生
了抗药性ꎻＰｅｎｇ等[６]在 １９９０ 年发现了异稻瘟净的
抗性菌株ꎬ其中部分抗性菌株同时对稻瘟灵产生了
抗性ꎻ三环唑对稻瘟病菌也出现田间防效下降的情
况[７]ꎻＫｉｍ等[８]在田间发现了侵染黑麦草的稻瘟
病菌对嘧菌酯的抗性突变体ꎮ 但目前水稻生产上
未有稻瘟病菌对 ＱｏＩｓ杀菌剂抗药性的报道ꎮ
烯肟菌胺是我国沈阳化工研究院自主研制开
发的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂ꎮ 该药剂具有杀菌
谱广、杀菌活性高、对环境生物友好等特点ꎬ兼有保
护和治疗作用ꎬ已经登记应用于稻瘟病、纹枯病、稻
曲病等多种水稻病害的防治[９]ꎮ 目前ꎬ有关稻瘟
病菌对烯肟菌胺的敏感性及交互抗药性方面的研
究仅有零星报道[１０~１１]ꎬ未见稻瘟病菌对烯肟菌胺
抗性风险评估及其抗性机制方面的研究报道ꎮ 因
此ꎬ本研究旨在明确稻瘟病菌对烯肟菌胺的室内抗
性风险ꎬ为指导田间科学施药ꎬ避免或延缓抗药性
的产生ꎬ延长该药剂的使用周期提供参考ꎻ揭示稻
瘟病菌对烯肟菌胺的抗性分子机制ꎬ并建立田间抗
性菌株的分子检测技术ꎬ为田间抗性快速监测提供
技术支持ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 试验材料
１.１. １ 　 供试药剂 　 ９８％烯肟菌胺 (代号 ＳＹＰ￣
１６２０):由沈阳化工研究院提供ꎻ９５％稻瘟灵( Ｉｓｏ￣
ｐｒｏｔｈｉｏｌａｎｅ)、９８％异稻瘟净( Ｉｐｒｏｂｅｎｆｏｓ)、９５％嘧菌
酯(Ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ):由农业部农药检定所提供ꎻ水杨
肟酸(Ｓａｌｉｃｙｌｏｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄꎬＳＨＡＭ):购于 ＳＩＧ￣
ＭＡ￣ＡＬＤＲＩＣＨ公司ꎮ
１.１.２　 供试菌株　 稻瘟病菌(Ｍ. ｏｒｙｚａｅ):于黑龙
江、江苏、湖南、云南、吉林和福建 ６ 省未施用过烯
肟菌胺和其他 ＱｏＩｓ杀菌剂的水稻栽培地区采集分
离ꎬ共 １００株稻瘟病菌菌株ꎮ
１.１.３　 供试培养基 　 马铃薯葡萄糖琼脂培养基
(ＰＤＡ):马铃薯 ２００ ｇꎬ葡萄糖 １８ ｇꎬ琼脂粉 １４ ｇꎬ
加蒸馏水定容至 １ ０００ ｍＬꎮ 高压蒸汽灭菌
(１２１℃)２０ ｍｉｎꎬ用于病原菌的培养、保存以及敏感
性测定ꎮ 米糠培养基:米糠 ２０ ｇꎬ琼脂粉 １４ ｇꎬ去离
子水 １ ０００ ｍＬꎬ调节 ｐＨ 至 ６. ０ꎮ 高压蒸汽灭菌
(１２１℃)２０ ｍｉｎꎬ用于稻瘟病菌产孢ꎮ
１.１.４　 供试生化试剂 　 胶回收试剂盒ꎬＴａｑ ＤＮＡ
聚合酶及其他 ＰＣＲ试剂等ꎬ购自全式金生物公司ꎻ
连接克隆试剂盒ꎬ购自天根生化科技有限公司ꎮ
１.１.５　 主要仪器 　 ＫＱ￣２５０ＤＥ 型数控超声波清洗
器ꎻＫｏｎｋＹｏ ＣＮ１５￣Ｔ３１ 型显微镜ꎻ血球计数板ꎻ计
数器ꎻＭｙＣｙｃｌｅｒＴＭＰＣＲ仪ꎻＳｏｒｖａｌｌ Ｐｒｉｍｏ Ｒ离心机ꎻ
Ｋ３０８干式恒温器ꎮ
１.２　 试验方法
１.２.１　 稻瘟病菌对烯肟菌胺的敏感性测定　 采用
菌丝生长速率法测定稻瘟病菌对烯肟菌胺的敏感
性ꎮ 将供试菌株接种在 ＰＤＡ 培养基上于 ２５℃黑
暗培养 ７ ｄꎬ用直径为 ５ ｍｍ 的打孔器于菌落边缘
的同一圆周上打取菌饼ꎬ将菌饼接种到含有 １５０
１８
　
植物病理学报 ４４卷
μｇ􀅰 ｍＬ－１ 的水杨肟酸和烯肟菌胺系列浓度
(０􀆰 ０００ꎬ０.０１５ꎬ０.０２５ꎬ０.０５０ꎬ０.１００ 和 ０􀆰 ５００ μｇ􀅰
ｍＬ－１)的 ＰＤＡ 带药平板上ꎬ加入等体积的溶剂甲
醇作为对照ꎬ于 ２５℃下黑暗培养ꎬ７ ｄ 后用十字交
叉法测量各处理的菌落直径ꎬ每处理重复 ３次ꎮ 按
照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百
分率(％)ꎮ
　 生长抑制率(％)＝对照菌落直径
－处理菌落直径
对照菌落直径－菌饼直径
×１００％
以抑制率的几率值作为 Ｙ 坐标ꎬ药剂浓度对
数作为 Ｘ坐标ꎬ求出毒力回归方程 Ｙ＝ｂＸ＋ａ 和相
关系数( ｒ)ꎬ计算药剂对病菌的抑制中浓度 ＥＣ５０
(μｇ􀅰ｍＬ－１) [１２]ꎮ
１.２.２　 室内抗药性突变体诱导及筛选 　 (１)药剂
驯化 按照 Ａｖｉｌａ￣ａｄａｍｅ等[１３]的方法ꎮ 制备含有 １０
μｇ􀅰ｍＬ－１烯肟菌胺和 １５０ μｇ􀅰ｍＬ－１ ＳＨＡＭ 的带
药平板(简称 ＳＳ 带药平板)ꎬ将稻瘟病菌接种在
ＳＳ带药平板上ꎬ２５℃黑暗培养 １０~１５ ｄ后ꎬ从已产
生黑色素的菌落上打取菌饼ꎬ接种到 ＳＳ 带药平板
上ꎬ培养 １５~２０ ｄ后如发现带药平板上有突变菌落
形成ꎬ则定义为疑似突变体ꎮ 将疑似突变体接种到
无药 ＰＤＡ 平板上ꎬ转代 ３ 次后打取菌饼继续转接
到 ＳＳ带药平板上ꎬ以亲本敏感菌株作为对照ꎬ如
果可形成明显大于亲本菌株的菌落ꎬ则该菌落为突
变体ꎮ
(２)自然筛选 将田间采集获得的稻瘟病菌菌
株在 ＰＤＡ培养基上培养 ７ ｄꎬ接种到 ＳＳ 带药平板
上ꎬ２５℃黑暗培养 ７ ｄꎬ如有菌株的菌丝生长速率明
显快于其他菌株ꎬ则为疑似突变体ꎮ 验证疑似突变
体方法同上ꎮ
(３)紫外诱导 将 １００ μＬ 孢子悬浮液(浓度为
１０６ 个分生孢子􀅰ｍＬ－１)均匀涂在 ＰＤＡ培养基上ꎬ
用固定高度(２０ ｃｍ)和固定强度的紫外灯ꎬ以 ３０ ｓ
为间距设置时间梯度ꎬ进行紫外照射ꎮ 照射后置于
黑暗条件下 １ ｈꎬ防止光修复ꎮ ２５℃黑暗培养 ２４ ｈꎬ
以未经紫外照射为对照ꎬ统计孢子萌发率ꎬ以矫正
孢子萌发率在 ５％~１０％为照射剂量进行后续突变
体筛选ꎮ 分生孢子经过紫外照射ꎬ在 ２５℃黑暗培
养 １０ ｄꎬ如果有菌落长出ꎬ为疑似突变体ꎬ验证方法
同上ꎮ
１.２.３　 抗药突变体的生物学性状研究 　 (１)抗药
突变体抗药稳定性 将抗药突变体及其亲本在 ＰＤＡ
上培养 １０ ｄꎬ待其长满皿后在菌落边缘打取菌饼ꎬ
接种到 ＰＤＡ培养基上ꎬ连续 ８次转代培养后ꎬ采用
菌丝生长速率法分别测定烯肟菌胺对第 １、５、８ 代
供试菌株的 ＥＣ５０ꎬ根据以下公式计算抗性水平( ｒｅ￣
ｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒꎬＲＦ)ꎬ分析抗性突变体在转代过程中
的抗药稳定性ꎮ
ＲＦ＝
突变体的 ＥＣ５０
亲本菌株的 ＥＣ５０
(２)抗药突变体的生长速率 将突变体及其亲
本菌株接种于无药 ＰＤＡ 平板上ꎬ２５℃黑暗条件下
培养 ７ ｄꎬ在菌落边缘同一圆周上打取菌饼ꎬ接种于
无药 ＰＤＡ平板上ꎬ每个菌株 ３次重复ꎬ２５℃黑暗条
件下培养 １２ ｄꎬ每隔 ２４ ｈ 用十字交叉法测量各菌
株的菌落直径ꎮ
(３)抗药突变体的离体产孢能力 将突变体及
其亲本菌株接种至米糠培养基上ꎬ２５℃条件下黑暗
培养 １０ ｄꎬ用灭菌的毛笔刷掉菌丝ꎬ２８℃黑光灯照
射 ３ ｄ诱导其产孢ꎮ 每皿加入 ５ ｍＬ无菌水洗脱孢
子ꎬ震荡 ３０ ｓꎬ超声震荡 ５ ｍｉｎꎬ用血球计数板计算
孢子浓度ꎬ每个菌株 ３次重复ꎮ
(４)孢子萌发能力测定 将新制备好的孢子悬
浮液稀释到适当浓度(１０×１０倍镜下每个视野 ５０~
１００个孢子)ꎬ每皿吸取 １００ μＬ孢子悬浮液均匀涂
布于水琼脂平板上ꎬ培养 ２４ ｈ 后在显微镜下观察
孢子的萌发数ꎬ每个处理观察 １００ 个孢子ꎬ计算萌
发率ꎬ每个菌株 ３次重复ꎮ
(５)抗药突变体的致病力测定 制备抗药突变
体及其亲本的孢子悬浮液ꎬ浓度控制在 １０６ ~ １０７
个􀅰ｍＬ－１ꎬ采用高压喷雾接菌ꎬ接种于 ３ 叶 １ 心期
的水稻叶片上ꎬ水稻品种为 ＣＯ３９ 和丽江新团黑
谷ꎮ 接种后塑料薄膜保湿 ４８ ｈꎬ温度不低于 ２８℃ꎬ
保证一定的昼夜温差ꎮ 接菌 ８ ｄ 后ꎬ调查病情指
数ꎮ 病情分级标准采用全国统一分级标准(ＧＢ / Ｔ
１５７９０￣２００９)ꎮ
１.２.４　 交互抗药性研究　 选择对烯肟菌胺表现为
不同敏感性的稻瘟病菌ꎬ以及通过田间抗药性监测
获得的稻瘟灵和异稻瘟净的抗性菌株为材料ꎬ采用
菌丝生长速率法分别测定烯肟菌胺、稻瘟灵和异稻
瘟净对供试菌株的 ＥＣ５０ꎻ测定嘧菌酯对烯肟菌胺
的高抗菌株及其亲本的 ＥＣ５０ꎻ然后以烯肟菌胺对
供试菌株的 ＥＣ５０的对数值为横坐标ꎬ以稻瘟灵、异
稻瘟净的 ＥＣ５０对数值为纵坐标做图ꎬ通过秩相关
２８
　
　 １期 　 　 李波涛ꎬ等:水稻稻瘟病菌对烯肟菌胺的抗性风险评估及抗性机制初探
(ｓｐｅａｒｍａｎ ｒａｎｋ)方法分析各药剂之间是否存在的
交互抗药性ꎮ
１.２.５ 　 水稻稻瘟菌 ｃｙｔｂ 克隆及序列比对 　 采用
ＣＴＡＢ法[１４]提取稻瘟病菌的基因组 ＤＮＡꎬ以此为
模板克隆 ｃｙｔｂ 基因ꎮ 扩增引物参考 Ｗａｎｇ[１５]ꎬ前
引物 ｃｙｔｂＦ１: ５′￣ＧＧＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＧＴＴＴＡＡＣ￣３′ꎻ
后引物 ｃｙｔｂＲ１:５′￣ＡＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＡＴ￣３′ꎮ
ＰＣＲ扩增反应体系(２５ μＬ):２.５ μＬ １０×Ｔａｑ ｒｅａｃ￣
ｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ( ２. ５ μＭ)ꎬ １. ５ μＬ ｄＮＴＰｓ ( １０ ｍＭ
ｅａｃｈ)ꎬ０.５ μＬ ｃｙｔｂＦ１ꎬ０.５ μＬ ｃｙｔｂＲ１ꎬ１.０ μＬ ＤＮＡ
模板ꎬ０􀆰 ５ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(５ Ｕ􀅰μＬ－１)ꎬ
１８.５ μＬ ｄｄＨ２Ｏꎮ 反应条件:预变性 ９４℃ ４ ｍｉｎꎻ变
性 ９４℃ ３０ ｓꎬ退火 ５５℃ ３０ ｓꎬ延伸 ７２℃ １ ｍｉｎ(３５
个循环)ꎻ延伸 ７２℃ １０ ｍｉｎꎮ 将 ＰＣＲ 产物进行胶
回收、纯化ꎬ连接转化ꎬ测序ꎮ 用 ＤＮＡＭＡＮ软件进
行序列比对ꎮ 测序由北京三博远志生物技术有限
责任公司完成ꎮ
１.２.６　 抗药性菌株等位特异性 ＰＣＲ检测方法的建
立　 采用等位特异性 ＰＣＲ(ＡＳ￣ＰＣＲ)建立抗药性
菌株的分子检测方法ꎮ 根据突变位点的核苷酸序
列设计等位特异性引物ꎬ序列如下:ｃｙｔｂ ＡＳＦ:５′￣
ＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＣＧ￣３′ꎬ ｃｙｔｂ ＡＳＲ:５′￣
ＧＡＴＴＡＧＴＡＡＴＡＡＣＴＧＴＡＧ ＣＡＣＴ￣３′ꎮ 以 ｃｙｔｂＦ１
和 ｃｙｔｂＲ１引物对的扩增结果为对照ꎮ ＰＣＲ反应体
系及反应条件同上ꎮ 引物由北京三博远志生物技
术有限公司合成ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 稻瘟病菌对烯肟菌胺的敏感基线建立
测定了来自 ６ 个主要水稻省区的 １００ 株稻瘟
病菌对烯肟菌胺的敏感性ꎬ其敏感性频率分布如图
１ 所示ꎬ供试菌株对烯肟菌胺的敏感性呈连续变
化ꎬＥＣ５０值分布于 ０.０１１ １ ~ ０.２９５ ６ μｇ􀅰ｍＬ
－１ꎬ平
均 ＥＣ５０ ＝(０.０７８ ６±０.０５６ １) μｇ􀅰ｍＬ
－１ꎮ １００ 株稻
瘟病菌的敏感性分布呈单侧峰曲线ꎬ表明田间高敏
感菌株为优势群体ꎬ且没有出现敏感性下降的抗药
性亚群体ꎬ可以将该曲线作为稻瘟病菌对烯肟菌胺
的敏感基线ꎬ用于田间抗性监测ꎮ
２.２　 突变体的获得及抗性水平测定
通过药剂驯化获得了 ７株抗药突变体(表 １)ꎬ
抗性频率为 １.１１×１０－４ꎬ而通过自然筛选和紫外诱
导均未获得抗药突变体ꎮ 其中ꎬ２ 株突变体的抗性
水平均大于 １ ０００倍ꎬ表现为高抗药性水平ꎻ另外 ５
株突变体抗性水平在 ２.０５~４.５５ 倍之间ꎬ表现为低
抗水平ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ １００
ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ｔｏ
ＳＹＰ￣１６２０
２.３　 突变体生物学性状研究
２.３.１　 抗药稳定性 　 连续培养 ８ 代后ꎬ抗药突变
体的 ＥＣ５０值和抗性水平均有不同程度的降低(表
１)ꎮ 其中ꎬ２ 株高抗突变体仍表现出高抗药性水
平ꎬ而 ５株低抗突变体均丧失了抗药性ꎬ对烯肟菌
胺表现为敏感ꎮ
２.３.２　 抗药突变体及其亲本生存适合度比较研
究　 抗药突变体及其亲本菌株的生物学性状测定
结果表明ꎬ抗药突变体与亲本菌株的离体产孢量和
孢子萌发率均没有显著性差异ꎻ除高抗突变体
ＮＪ０８１１￣Ｉ 的菌丝生长速率显著低于亲本菌株
ＮＪ０８１１外ꎬ其他突变体与其亲本菌株的生长速率
相当(表 ２)ꎮ 致病力研究显示ꎬ２ 株高抗突变体的
致病力显著弱于其亲本菌株ꎬ低抗突变体与亲本菌
株的致病力无显著性差异ꎮ 综合分析表明ꎬ２ 株高
抗突变体的生存适合度显著低于其亲本菌株ꎬ在田
间引发抗性病害流行的风险较低ꎮ
２.４　 交互抗药性结果
交互抗药性试验结果表明ꎬ稻瘟病菌对烯肟菌
胺产生抗药性后对嘧菌酯的敏感性也会显著下降ꎬ
即烯肟菌胺与嘧菌酯存在正交互抗药性(表 ３ꎬ图
２)ꎮ
３８
　
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ｔｏ ＳＹＰ￣１６２０
Ｐａｒｅｎｔ
ｉｓｏｌａｔｅ
ＥＣ５０
(μｇ􀅰ｍＬ－１)
Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｍｕｔａｎｔ
１ｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ５ｔｈ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ８ｔｈ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ＥＣ５０
(μｇ􀅰ｍＬ－１)
ＲＦ
ＥＣ５０
(μｇ􀅰ｍＬ－１)
ＲＦ
ＥＣ５０
(μｇ􀅰ｍＬ－１)
ＲＦ
ＤＷ ０.０２３ ７ Ａ１０ ４７.９３０ ７ ２ ０２２.３９ ３９.６４６ ０ １ ６７２.８３ ２３.６９６ ７ ９９９.８６
ＮＪ０８１１ ０.０４７ ４ ＮＪ０８１１￣Ｉ ５３.９５２ ９ １ １３８.２５ ３７.１１６ ５ ７８３.０５ ３５.８７０ ９ ７５６.７７
ＨＮ９ ０.０１９ ８ ＨＮ９ Ｃ３Ｉ ０.０４０ ６ ２.０５ ０.０２０ ８ １.０５ － －
ＨＮ１１ ０.０３３ ２ ＨＮ１１ Ａ３ ０.０７６ １ ２.２９ ０.０４２ １ １.２７ － －
ＪＬ０８０９ ０.０３５ ２ ＪＬ０８０９ Ａ ０.０７１ ７ ２.２４ ０.０４８ １ １.３７ － －
ＪＬ０８０９ ０.０３５ ２ ＪＬ０８０９ Ｂ ０.０７７ ４ ２.２０ ０.０４２ ３ １.２０ － －
ＳＨ０８０１ ０.０２６ ７ ＳＨ０８０１ Ｃ３Ｉ ０.１２１ ６ ４.５５ ０.０２５ ３ ０.９５ － －
Ｎｏｔｅ:“－”ｍｅａｎｓ ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ.
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｆｉｔｎｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｐａｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ
ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ｔｏ ＳＹＰ￣１６２０ ａ
Ｉｓｏｌａｔｅ
Ｆｉｔｎｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒ
Ｃｏｌｏｎｙ ｄｉａｍｅｔｅｒ
(ｍｍ)
Ｓｐｏｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
(１０５ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ􀅰ｃｍ－２)
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｓｐｏｒｅ
ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ(％)
Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ
ＣＯ３９ ｌｉｊｉａｎｇｘｉｎｔｕａｎｈｅｉｇｕ (ＬＴＨ)
ＤＷ ６８.８ ２.０ ９５ ８.５ ６３.７
Ａ１０ ６７.５ ２.２ ９３ ３.７ ２６.７∗
ＮＪ０８１１ ５８.９ １.１ ８７ ９４.１ ９４.１
ＮＪ０８１１￣Ｉ ５３.８∗ １.２ ８５ ４９.１∗ ６０.０∗
ＨＮ９ ６７.０ ３.２ ９１ ８２.２ ９３.３
ＨＮ９ Ｃ３Ｉ ６５.８ ３.３ ９３ ８５.９ ９４.８
ＨＮ１１ ６９.５ ３.１ ８７ ９１.８ ９２.６
ＨＮ１１ Ａ３ ６８.５ ２.８ ８５ ７３.３ ９０.３
ＳＨ０８０１ ６５.８ １.３ ８８ ７１.１ ９４.１
ＳＨ０８０１ Ｃ３Ｉ ６５.０ １.１ ８７ ４８.９ ８３.０
ＪＬ０８０９ ５２.３ １.１ ８９ ４９.６ ７８.５
ＪＬ０８０９ Ａ ５２.０ ０.９ ８８ ６３.０ ８１.５
ＪＬ０８０９ Ｂ ５４.０ １.１ ８７ ４２.２ ７７.０
Ｎｏｔｅ: ａꎬＴｈｅ ｔｅｓｔ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｐａｉｒ (ｇｒｏｕｐ) ｏｆ ｍｕｔａｎｔ (ｐｌａｉｎ ｔｅｘｔ) ａｎｄ ｐａｒｅｎｔ (ｂｏｌｄ ｔｅｘｔ) ｏｆ Ｍ. ｏｒｙｚａｅ ａｔ ｓｉｇ￣
ｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｌｅｖｅｌ α＝ ０.０５ꎻ ∗ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ.
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＳＹＰ￣１６２０ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ
ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐａｒｅｎｔａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｔｏ ＳＹＰ￣１６２０ ａｎｄ Ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ
Ｉｓｏｌａｔｅ
ＥＣ５０(μｇ􀅰ｍＬ
－１)
ＳＹＰ￣１６２０ Ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ
ＮＪ０８１１ ０.０４７ ４ ０.４６４ ４
ＮＪ０８１１￣Ｉ ５３.９５２ ９ ５７.５７６ １
ＤＷ ０.０２３ ７ ０.５９０ ０
Ａ１０ ４７.９３０ ７ ７０.４７２ ５
４８
　
　 １期 　 　 李波涛ꎬ等:水稻稻瘟病菌对烯肟菌胺的抗性风险评估及抗性机制初探
Ｆｉｇ. ２　 Ｃｏｓｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＹＰ￣１６２０ ａｎｄ ｉｓｏｐｒｏｔｈｉｏｌａｎｅ(Ａ)、ｉｐｒｏｂｅｎｆｏｓ(Ｂ)
进一步选择对烯肟菌胺表现为不同敏感性的稻瘟
病菌ꎬ以及稻瘟灵和异稻瘟净的抗性菌株进行了交
互抗药性测定ꎬ结果显示烯肟菌胺与稻瘟灵和异稻
瘟净之间的秩相关性分析 Ｐ>０.０５ꎬ即不存在交互
抗药性ꎮ
２.５　 抗感菌株 ｃｙｔｂ基因序列比对结果
抗药突变体和其亲本菌株的 ｃｙｔｂ 序列比对分
析表明ꎬ２株高抗突变体的 ｃｙｔｂ 序列在 ４２７ 位发生
了单碱基突变ꎬ均由 Ｇ变成了 Ａꎬ即导致氨基酸序
列第 １４３ 位由 Ｇｌｙ(甘氨酸)突变成了 Ｓｅｒ(丝氨
酸)ꎬ而其余的 ５株抗药性状不稳定的低抗突变体
均未发现点突变(图 ３)ꎮ
２.６　 ＡＳ￣ＰＣＲ方法检测结果
如图 ４所示ꎬ采用引物 ｃｙｔｂＦ１ 和 ｃｙｔｂＲ１ꎬ无论
是敏感菌株还是抗药突变体都能扩增出约 １ １８２
ｂｐ 的片段ꎻ采用等位特异性引物 ｃｙｔｂＡＳＦ 和
ｃｙｔｂＡＳＲꎬ以抗药突变体 ＤＮＡ 为模板可扩增出约
３９０ ｂｐ的特异性条带ꎬ而以敏感菌株 ＤＮＡ 为模板
未扩增出任何条带ꎮ 表 明 引 物 ｃｙｔｂＡＳＦ 和
ｃｙｔｂＡＳＲ对发生 Ｇ１４３Ｓ 点突变的抗性菌株具有特
异性ꎬ可用于田间稻瘟病菌对烯肟菌胺产生高抗性
水平群体的抗性监测ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＹＴＢ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ
ａｎｄ ｐａｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ
５８
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ４　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ
Ｎｏｔｅ:Ｓ１、Ｓ２ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｐａｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ＤＷ ａｎｄ ＮＪ０８１１ ꎻ Ｒ１、Ｒ２ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ Ａ１０
ａｎｄ ＮＪ０８１１￣Ｉ ꎻ Ｍ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｍａｒｋ.
３　 结论与讨论
敏感基线的建立是药剂￣病原菌互作中抗性风
险评估的一项基本内容ꎮ Ｒｕｓｓｅｌ 认为 ５０ 个样本可
以反映一个地区的敏感性分布ꎬ而地理范围较大的
地域则需要更多不同空间分布的菌株[１６]ꎮ 本研究
采用的稻瘟病菌样本量充足ꎬ覆盖了全国 ６ 个主要
的水稻产区ꎬ空间分布广ꎬ建立的敏感基线(ＥＣ５０ ＝
(０.０７８ ６±０.０５６ １) μｇ􀅰ｍＬ－１)范围包含辽宁等部
分地区的稻瘟病菌对烯肟菌胺的敏感性范围[１０]ꎬ
更具有代表性ꎮ
已有研究显示ꎬＱｏＩｓ 杀菌剂作用位点单一ꎬ田
间容易产生抗性菌株ꎬ因此国际杀菌剂抗药性行动
委员会 ( Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ａｃｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅꎬ
ＦＲＡＣ)将 ＱｏＩｓ 杀菌剂列为高抗药性风险的药
剂[１６]ꎮ 而稻瘟病菌田间产孢量大ꎬ持续产孢时间
长ꎬ再侵染频繁[１７]ꎬＦＲＡＣ 将稻瘟病菌划分为高等
抗性风险的植物病原菌[１６]ꎮ 因此 ＦＲＡＣ 认为稻瘟
病菌￣ＱｏＩｓ杀菌剂结合分析是高抗药性风险的组
合ꎮ 高霞等通过药剂驯化和紫外诱导 ４ 株敏感菌
株获得了 ６株中抗菌株ꎬ推断烯肟菌胺对稻瘟病菌
是高等抗性风险[１１]ꎮ 本研究通过药剂驯化获得了
７株抗药性突变体ꎬ抗性频率为 １.１１×１０－４ꎬ而通过
自然筛选和紫外诱导均未获得抗药突变体ꎮ 其中ꎬ
２株高抗突变体的致病力和生存适合度较亲本菌
株明显减弱ꎬ很难形成抗药亚群体ꎮ 而其余的 ５ 株
低抗菌株抗药稳定性差ꎬ经过 ５ 代培养后基本丧失
抗药性ꎮ 交互抗药性结果显示ꎬ烯肟菌胺与稻瘟灵
和异稻瘟净无交互抗药性ꎬ与嘧菌酯有交互抗药
性ꎮ Ａｖｉｌａ￣ａｄａｍｅ 等[１３]ꎬＫｉｍ 等[８]ꎬＭａ 等[２１]虽在
室内和田间分别获得了牛筋草和黑麦草上稻瘟病
菌对嘧菌酯的抗性菌株ꎬ但黑麦草稻瘟病菌抗性菌
株的适合度、竞争力低[２１]ꎮ 而 Ｗｅｉ 等[２２]对日本
８１３株水稻稻瘟病菌进行敏感性检测未发现有抗
性菌株ꎬ且国际上嘧菌酯等 ＱｏＩｓ 杀菌剂在生产中
使用了很多年ꎬ迄今还未有因水稻稻瘟病菌对嘧菌
酯等 ＱｏＩｓ杀菌剂产生抗药性而导致防效下降的报
道ꎮ 综合评估认为田间水稻稻瘟病菌对烯肟菌胺
可能存在低￣中等抗性风险ꎮ
国际上已有研究表明ꎬＱｏＩｓ杀菌剂抗药性产生
的主要原因是靶标基因( ｃｙｔｂ)的突变[８ꎬ１８ꎬ１９]ꎬ影响
药剂和靶标位点的结合ꎮ 而不同位点的氨基酸取
代表现出不同的抗性水平[２０]ꎬ其中 Ｆ１２９Ｌ 点突变
会造成中等抗性[１９ꎬ２１]ꎬ而 Ａｖｉｌａ￣ａｄａｍｅ 检测到抗嘧
菌酯的突变体突变位点为 Ｇ１４３Ａ 和 Ｇ１４３Ｓ[１３]ꎬ表
现为高抗ꎮ 本研究结果显示高抗菌株的 ＣＹＴＢ 发
生了 Ｇ１４３Ｓ的点突变ꎬ与已有研究结果一致ꎬ说明
Ｇ１４３Ｓ可能是稻瘟病菌对 ＱｏＩｓ杀菌剂烯肟菌胺的
主要抗性机制ꎮ 而 ５ 株低抗突变体的抗药稳定性
较差ꎬ推测可能是由于病原菌在药剂的选择压下暂
时表现出耐药性反应ꎬ亦或存在其他的抗性机制ꎬ
虽然抵抗菌株的抗药稳定性差ꎬ但生产中有可能在
高剂量药剂的选择压下进一步突变为高抗菌株ꎬ加
剧了稻瘟病菌的抗药性风险ꎮ 这需要进一步的田
间试验验证ꎮ 本研究基于靶标基因的突变位点建
６８
　
　 １期 　 　 李波涛ꎬ等:水稻稻瘟病菌对烯肟菌胺的抗性风险评估及抗性机制初探
立了 ＡＳ￣ＰＣＲ抗药突变体分子检测方法ꎬ为实时监
测田间高抗药性群体的发生和发展提供了理论依
据和技术支持ꎮ 但该方法只适用于 Ｇ１４３Ｓ 类型的
抗药菌株ꎬ因此ꎬ在田间病原菌抗药性的监测中应
该把传统的检测方法和分子检测方法相结合ꎮ
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[２０] Ｓｉｅｒｏｔｚｋｉ ＨꎬＰａｒｉｓ ＳꎬＳｔｅｉｎｆｅｌｄ Ｕꎬｅｔ ａｌ. Ｍｏｄｅ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔ￣
ａｎｃｅ ｔｏ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｃ１ ｅｎ￣
ｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｊｅｎｓｉｓ ｆｉｅｌｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ
[Ｊ] . Ｐｅｓｔ. Ｍａｎａｇ. Ｓｃｉ.ꎬ ２０００ꎬ ５６: ８３３－８４１.
[２１] Ｍａ Ｂ.ꎬＵｄｄｉｎ Ｗ. Ｆｉｔｎｅｓｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎ
ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｇ１４３Ａ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ
ｏｒｙｚａｅ ｆｒｏｍ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｒｙｅｇｒａｓｓ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ.ꎬ ２００９ꎬ
９３: １０４４－１０４９.
[２２] Ｗｅｉ Ｃ ＺꎬＫａｔｏｈ ＨꎬＮｉｓｈｉｍｕｒａ Ｋꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｉｔｅ￣ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ＱｏＩ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ
ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ [ Ｊ] . Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇ. Ｓｃｉ.ꎬ ２００９ꎬ ６５
(１２): １３４４－１３５１.
责任编辑:张宗英
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