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The identification of soybean powdery mildew fungus

大豆白粉病病原菌鉴定



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  45(5): 548 ̄551(2015)
收稿日期: 2014 ̄08 ̄08ꎻ 修回日期: 2015 ̄04 ̄14
基金项目: 国家自然基金项目(31170013)ꎻ吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(吉教科合字[2012]第 36号)
通讯作者: 刘淑艳ꎬ教授ꎬ主要从事菌物分子生物学研究ꎻE ̄mail:liussyan@163.comꎮ
doi:10.13926 / j.cnki.apps.2015.05.013
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研究简报
大豆白粉病病原菌鉴定
柳 建1ꎬ 姜文涛1ꎬ 安保宁1ꎬ 刘淑艳1ꎬ2∗
( 1 吉林农业大学农学院ꎬ长春 130118ꎻ 2吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心ꎬ长春 130118)
The identification of soybean powdery mildew fungus   LIU Jian1ꎬ JIANG Wen ̄tao1ꎬ AN
Bao ̄ning1ꎬ LIU Shu ̄yan1ꎬ2   ( 1 College of Agronomyꎬ Jilin Agricultural Universityꎬ Changchun 130118ꎬ Chinaꎻ 2 Engi ̄
neering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungiꎬ Jilin Agricultural Universityꎬ Chang ̄
chun 130118ꎬ China)
Abstract: Soybean powdery mildew is a common diseaseꎬ and its pathogen is previously reported as Erysiphe
glycines in China. In 2012ꎬ soybean powdery mildew was collected in Gongzhuling of Jilin Province and the
pathogen was identified as Oidium subgenus Pseudoidium based on the morphological characteristics. A sequence
of the ribosomal DNA internal transcribed spacer region including the 5.8S rDNA gene was amplified from the
fungusꎬ and was 100% identical to that of Erysiphe diffusa and Oidium sp. records on GenBankꎬ on which the
fungus was speculated to be E. diffusa. This was the first report of E. diffusa as a pathogen of soybean in China.
The results of this paper will contribute to disease control.
Key words: Erysiphe diffusaꎻ new pathogenꎻ ITS genes
文章编号: 0412 ̄0914(2015)05 ̄0548 ̄04
    大豆白粉病是大豆叶部病害ꎬ能降低叶片光合
作用ꎬ使产量损失高达 35%ꎮ 1921 年首次在德国
发现ꎬ之后在南美和北美陆续发生ꎬ在日本、韩国、
越南、泰国也有报道[1]ꎮ 而中国大豆白粉病报道
较少ꎬ只在吉林、北京、贵州、河北有所报道[2ꎬ3]ꎬ最
近仅在浙江和广东有过报道ꎮ 国外报道的大豆白
粉病病原菌有 Erysiphe glycines和 E. diffusa[1ꎬ4ꎬ5]ꎬ
其中日本[1]和巴西[5]的报道主要依据无性态特征
和分子数据ꎻ国内报道的仅有 E. glycines[3]ꎬ而 E.
diffusa还未在大豆上见到报道ꎮ 另外ꎬ吉林报道的
大豆白粉病病原菌为 E. polygoni[2]ꎬ但 Zheng等[3]
认为该病原菌应该是或极可能是 E. glycinesꎮ
2012年 9月作者在吉林省公主岭市发现大豆白粉
病ꎬ发病率达 78%ꎬ且危害严重ꎮ 本文通过形态鉴
定和 ITS序列分析明确该病原菌分类地位ꎬ为病害
防治提供依据ꎮ
1  材料与方法
1.1  材料
    本试验标本于 2012年 9月采自吉林省公主岭
市植物保护研究所大豆试验田ꎬ现保存于吉林农业
大学菌物标本馆ꎬ编号为 HMJAU01514ꎮ
1.2  病害症状观察
    对大豆白粉病症状进行观察ꎬ包括病斑颜色、
大小、发病部位和危害程度等ꎮ
 
  5期 柳 建ꎬ等:大豆白粉病病原菌鉴定
1.3  病原菌形态学观察
    采用粘贴法观察病原菌形态特征ꎮ 用透明胶
带粘取新鲜病斑ꎬ 水作为浮载剂ꎬ 在显微镜
(NikonYS100、基恩士 VHX ̄600)下观察病原菌菌
丝、附着胞、分生孢子梗、分生孢子及其着生方式
等ꎬ并测量相关数据ꎮ 同时采用葱表皮法观察分生
孢子萌发ꎮ
1.4  病原菌 rDNA ITS片段的 PCR扩增和序列测定
    采用 Chelex ̄100法从分生孢子及菌丝体中提
取基因组 DNAꎬ用引物对 ITS5 / P3 和 ITS5 / ITS4
进行半巢式 PCR扩增ꎬ扩增产物用 1.0%琼脂糖凝
胶电泳检测ꎮ 扩增后ꎬ送至生工生物工程(上海)
股份有限公司进行双向测序ꎬ 测得序列用
DNAMAN( version 6. 0)进行分析、剪切ꎬ并与从
GenBank中下载的相关序列进行比对分析ꎮ
2  结果与分析
2.1  病害症状与病原菌形态特征观察
    发病初期叶面上有稀疏的白色菌丝(图 1 ̄A)ꎬ
条件适宜时ꎬ浓密逐渐扩大至整个叶面ꎬ后期叶片
上铺满白色霉层(图 1 ̄B)ꎬ叶背有褪绿小斑ꎮ 病原
菌叶正面着生ꎬ未发现有性世代ꎮ
Fig. 1  The symptom of powdery mildew on
soybean leaves
A: Early stageꎻ B: Later stage.
    病原菌分生孢子梗直或弯、不分枝ꎬ分生孢子梗
大小为(40.5~ 72.0)μm×(8.3 ~ 13.5)μm(图 2 ̄A)ꎻ
脚胞大小为(16.6 ~ 45.0)μm×(6.8 ~ 11.6)μmꎬ上部
着生 1~3个细胞ꎻ分生孢子单生ꎬ椭圆形至圆形ꎬ大
小为(29.0~47.2)μm×(15.3~24.9)μm(图 2 ̄B)ꎻ附
着器为裂片状(图 2 ̄C)ꎬ芽管类型为 Pseudoidium
type(图 2 ̄D)ꎮ 据此初步鉴定该病原菌为粉孢属的
假粉孢亚属 Oidium subgenus Pseudoidium[4]ꎮ
Fig. 2   Morphological characteristics of the
fungus  causing  soybean  powdery
mildew
A:Conidiophoreꎻ B:Conidiaꎻ C:Appressoriaꎻ D:Germ tube.
2.2  rDNA ITS 片段的扩增与测序
    对大豆白粉病病原菌基因组 DNA进行 PCR扩
增ꎬ产物直接用于测序ꎬ得到长度为 559 bp的 rDNA
ITS序列(GenBank 登录号为 KC832863)ꎮ 将测得
的序列与大豆属植物上已报道的白粉菌 ITS 序列
(表 1)进行比对分析ꎬ结果显示该序列与 GenBank
中报道的大豆上 10 个 Erysiphe diffusa (Cooke &
Peck) U. Braun & S. Takam. 序列、11个 Oidium sp.
的序列和 2个野大豆上报道的 Oidium sp.序列相似
性值均为 100%ꎬ而与大豆上的 E. glycines F.L. Tai
(登录号AB078807)序列相似度仅为 82%ꎮ 同时ꎬ与
E. glycines引起的其他豆科植物白粉病菌的 ITS 序
列相似值均不大于 95%(表 1)ꎮ 由此可以推断ꎬ本
研究所采集到的大豆白粉病菌的有性世代应为
E. diffusaꎬ而不是以往报道的 E. glycinesꎮ
945
 
植物病理学报 45卷
Table 1  The ITS sequences information and identity
Species Host Country of origin GenBank accession No. Identity / %
Erysiphe diffusa Glycine max Brazil: Paraná AY739112 100
E. diffusa Glycine max Brazil: Rio Grande do Sul EF196675 100
E. diffusa Glycine max Brazil: Paraná EF196673 100
E. diffusa Glycine max Brazil: Paraná EF196671 100
E. diffusa Glycine max Brazil: Goiás EF196669 100
E. diffusa Glycine max Brazil: Minas Gerais EF196674 100
E. diffusa Glycine max Brazil: Minas Gerais EF196670 100
E. diffusa Glycine max Brazil: Rio Grande do Sul EF196672 100
E. diffusa Glycine max Brazil: Paraná EF196668 100
E. diffusa Glycine max Brazil: Paraná EF196667 100
Oidium sp. Glycine max Japan: Oita AB078800 100
Oidium sp. Glycine max Japan: Kumamoto AB078801 100
Oidium sp. Glycine max Japan: Fukushima AB078802 100
Oidium sp. Glycine max Japan: Nara AB078803 100
Oidium sp. Glycine max Japan: Shizuoka AB078804 100
Oidium sp. Glycine max Japan: Okayama AB078805 100
Oidium sp. Glycine max Japan: Mie AB078806 100
Oidium sp. Glycine max South Korea: Chongju AB078808 100
Oidium sp. Glycine max Viet Nam: Hanoi AB078809 100
Oidium sp. Glycine max USA: Minnesota AB078810 100
Oidium sp. Glycine max USA: Illinois AB078811 100
Oidium sp. Glycine soja South Korea: Chunchon AB078812 100
Oidium sp. Glycine soja Japan: Gifu AB078813 100
E. glycines var. lespedezae Lespedeza cuneata Japan: Toyama AB015921 94
E. glycines var. lespedezae Lespedeza thunbergii Japan: Toyama AB015923 94
E. glycines var. glycines Glycine max Japan: Mie AB078807 82
E. glycines var. glycines Desmodium oxyphyllum Japan: Mie AB015927 83
E. glycines var. glycines
Amphicarpaea edgeworthii
var. japonica
Japan: Mie AB015934 82
 
3  讨论
    关于大豆白粉病病原菌的报道ꎬ国内外有所不
同ꎮ 目前国外报道有两种ꎬ分别为 E. glycines 和
E. diffusa[1ꎬ4ꎬ5]ꎬ无性世代为 Oidium sp.ꎻ而我国 E.
diffusa仅在二色棘豆(Oxytropis bicolor Bunge)上
有侵染ꎬ未在大豆上发生[3]ꎮ 1987 年 Chen 等[2]报
道大豆白粉病病原菌为 E. polygoniꎬ但 Zheng等[3]
并不认同此鉴定结果ꎬ而认为该病原菌应为 E. gly ̄
cinesꎮ 我国其他地区虽有大豆白粉病的报道ꎬ但
主要侧重于病害的调查和防治ꎬ没有病原菌鉴定的
详细资料ꎮ
    E. glycine 和 E. diffusa 的无性态都属于粉孢
属的假粉孢亚属 Oidium subgenus Pseudoidiumꎬ共
055
 
  5期 柳 建ꎬ等:大豆白粉病病原菌鉴定
同特征是分生孢子单生ꎬ附着器浅裂片状ꎬ芽管类
型为 Pseudoidium typeꎮ 仅在分生孢子梗长短、分
生孢子大小和脚胞大小上稍有不同ꎬ根据无性世代
很难确定其病原菌的种类ꎮ 二者的区别主要在于
有性世代闭囊壳外附属丝的分枝情况ꎬE. diffusa
的附属丝顶端是明显的二叉状分枝ꎬ多为 2 ~ 4 次
分枝ꎬ而 E. glycines 少数有曲折状至扭曲状分枝ꎮ
然而目前采集到的大豆白粉病病原菌多为无性世
代[1ꎬ5]ꎬ这给病原菌的鉴定带来困难ꎬ用分子生物
学方法为解决这一问题提供了新的途径ꎮ 2002 年
Takamatsu等[1]对采自日本、韩国等地的大豆白粉
菌样本进行了形态和分子生物学的研究ꎬ结果表
明ꎬ引起大豆白粉病的病原菌有 E. glycines 和
E. diffusa两个种ꎮ 其中 E. glycines 的鉴定主要依
据的是有性世代ꎬ而 E. diffusa 是根据无性态特征
和分子序列分析推测得到的ꎮ 2008 年 Almeida
等[5]对引起巴西大豆白粉病的 10 个样本进行研
究ꎬ无性态 ITS序列分析的结果与 Takamatsu 等[1]
的结果一致ꎮ 本研究通过形态学鉴定和 ITS 序列
的比对、分析ꎬ结果显示试验标本的形态与 E.
diffusa无性世代相近ꎬITS 序列与寄生在大豆上的
E. diffusa的相似性达 100%ꎬ因此综合推测其有性
世代为 E. diffusaꎮ 在今后的研究中要注意大豆白
粉病病原菌的有性世代ꎬ这样才能更好的确定其病
原菌种类ꎮ E. diffusa作为大豆白粉病的病原在国
内首次报道ꎬ生产上要注意该病害的发生ꎮ
参考文献
[1]   Takamatsu Sꎬ Shin H Dꎬ Paksiri Uꎬ et al. Two
Erysiphe species associated with recent outbreak of
soybean powdery mildew: results of molecular
phylogenetic analysis based on nuclear rDNA
sequences [J] . Mycoscienceꎬ 2002ꎬ 43(4): 333-341.
[2]   Chen Q Eꎬ Bai J K. An illustrated handbook of
soybean diseases and insect pests in China ( in
Chinese) [M] . Changchun: Jilin Science and Tech ̄
nology Press (长春: 吉林科学技术出版社)ꎬ 1987.
[3]   Zheng R Yꎬ Yu Y N. Flora fungorum sinicorum .Vol.
1ꎬ Erysiphales ( in Chinese) [M] . Beijing: Science
Press (北京: 科学出版社)ꎬ 1987.
[4]   Braun Uꎬ Cook R. Taxonomic manual of the
Erysiphales ( Powdery Mildews) [M] . Utrecht the
Netherland: CBS Biodiversity Series 11ꎬ 2012ꎬ1-707.
[5]   Almeida Á M Rꎬ Binneck Eꎬ Piuga F Fꎬ et al. Char ̄
acterization of powdery mildews strains from soybeanꎬ
beanꎬ sunflowerꎬ and weeds in Brazil using rDNA ̄ITS
sequences [ J] . Tropical Plant Pathologyꎬ 2008ꎬ 33
(1): 20-26.
责任编辑:曾晓葳   
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