全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(６): ５８５￣５９１(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０６￣０６ꎻ 修回日期: ２０１５￣０６￣１４
基金项目: 国家自然科学基金项目(３１２０１４８５)ꎻ高等学校博士学科点专项科研基金(２０１０００６１１２００３６ꎻ２０１２３７０２１１００１３)
通讯作者: 刘金亮ꎬ副教授ꎬ主要从事植物病毒学与分子植物病理学研究ꎻ Ｔｅｌ:０４３１￣８７８３５７０７ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｊｌｌｉｕ＠ ｊｌｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
共同第一作者: 张雅琦ꎬ女ꎬ吉林珲春人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事分子植物病毒学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇ＿ｙａ＿ｑｉ＠１６３.ｃｏｍꎻ
祝富祥ꎬ男ꎬ山东德州人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事分子植物病毒学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｆｅｎｇｘｉａｎｇｓｕｉ２００９＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０６.００４
芜菁花叶病毒长春分离物 ｐ３基因的克隆、
序列分析及 Ｐ３蛋白抗血清的制备
张雅琦１＃ꎬ 祝富祥１＃ꎬ 王凤婷１ꎬ 潘洪玉１ꎬ 李向东２ꎬ 刘金亮１∗
( １吉林大学植物科学学院ꎬ长春 １３００６２ꎻ ２山东农业大学植物保护学院ꎬ泰安 ２７１０１８)
摘要:用 ＲＴ￣ＰＣＲ方法从长春感染芜菁花叶病毒( Ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬＴｕＭＶ)的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的 ｐ３ 基
因ꎬ并对其序列进行了比较分析ꎮ 结果表明ꎬ本研究所获得的 １０个 ＴｕＭＶ分离物 ｐ３基因含 １ ０６５个核苷酸ꎬ其序列一致率
为 ９８.８％~９９.６％ꎬ与 ＧｅｎＢａｎｋ中其他 １５个 ＴｕＭＶ分离物核苷酸一致率为 ８０.９％~９９.４％ꎮ 根据 ｐ３基因核苷酸序列构建的
系统进化树显示:２５个 ＴｕＭＶ 分离物可分为 ４ 个组ꎬ本研究得到的 １０ 个 ＴｕＭＶ 分离物均属于 ｂａｓａｌ￣ＢＲ 组ꎮ 将 ＴｕＭＶ
ＪＣＲ０６分离物 ｐ３基因 Ｎ端 ６６３ ｂｐ片段克隆至原核表达载体 ｐＥＴ￣２８ａ(＋)ꎬ并在大肠杆菌 ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐＬｙｓＳ中表达出分子
量约为 ２８ ｋＤａ的融合蛋白ꎮ 以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔ꎬ制备了 Ｐ３ 蛋白的特异性抗血清ꎮ 以 ＴｕＭＶ 侵染的萝卜
为抗原ꎬ间接 ＥＬＩＳＡ测定抗血清的效价为 １ ∶ ２ ０４８ꎮ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明ꎬ制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发
生特异性反应ꎮ
关键词:芜菁花叶病毒ꎻ ｐ３基因ꎻ 序列分析ꎻ 原核表达ꎻ 抗血清制备
Ｃｌｏｎｉｎｇꎬ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐ３ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ ａｎｄ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ 　 ＺＨＡＮＧ Ｙａ￣ｑｉ１＃ꎬ ＺＨＵ Ｆｕ￣ｘｉａｎｇ１＃ꎬ ＷＡＮＧ Ｆｅｎｇ￣ｔｉｎｇ１ꎬ
ＰＡＮ Ｈｏｎｇ￣ｙｕ１ꎬ ＬＩ Ｘｉａｎｇ￣ｄｏｎｇ２ꎬ ＬＩＵ Ｊｉｎ￣ｌｉａｎｇ１ 　 ( １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００６２ꎬ
Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔａｉ′ａｎ ２７１０１８ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｅｎ Ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ (ＴｕＭＶ) ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｒｕｃｉｆｅｒｏｕｓ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ｉｎ
Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ. Ｔｈｅ ｐ３ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ １０ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ １ ０６５ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓꎬ ｗｉｔｈ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ９８.８％－９９.６％ ａｔ ｔｈｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｅｖｅｌ. Ｔｈｅｓｅ ｐ３ ｇｅｎｅｓ ｓｈａｒｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ８０.９％－９９.４％ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ １５ ＴｕＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｖａｉｌａｂｌｅ
ｉｎ ｔｈｅ ＧｅｎＢａｎｋ. Ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐ３ ｇｅｎｅｓꎬ ｔｈｅ ２５
ＴｕＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ４ ｇｒｏｕｐｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ １０ ＴｕＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓａｒｃｈ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｇｒｏｕｐ
ｂａｓａｌ￣ＢＲ. Ｔｈｅ Ｎ￣ｔｅｒｍｉｎｎａｌ ６６３ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｐ３ ｇｅｎｅ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅ ＪＣＲ０６ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ｐＥＴ￣２８ａ(＋) ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐＬｙｓＳ. ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｎ￣ｔｅｒｍｉｎｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ
ｐ３ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ａ ２８ ｋＤａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ. Ｒａｂｂｉｔ ｗａｓ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｕｓｉｏｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ. Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｗａｓ １ ∶ ２ ０４８ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｔｅｓｔ ｔｏ ｄｅ￣
ｔｅｃｔ ＴｕＭＶ ｉｎ ｒａｄｉｓｈ. Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ (ＴｕＭＶ)ꎻ ｐ３ ｇｅｎｅꎻ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎻ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３２.４１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０６￣０５８５￣０７
　
植物病理学报 ４５卷
　 　 芜菁花叶病毒(Ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬＴｕＭＶ)是
危害蔬菜最严重的 ５种病毒之一ꎬ寄主范围非常广
泛ꎬ可侵染 ４３ 科 １５６ 属的 ３１８ 种植物ꎬ是唯一侵染
芸薹属植物的马铃薯 Ｙ病毒属(Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ)病毒[１]ꎮ
被侵染的植株初期表现为花叶、明脉、皱缩ꎬ后期出
现矮化、畸形等症状[２]ꎬ严重影响作物的产量和品
质ꎮ 自然状态下ꎬＴｕＭＶ 主要通过蚜虫以非持久性
方式传播ꎬ人工接种也可以通过摩擦传毒ꎮ
　 　 ＴｕＭＶ基因组为正义单链 ＲＮＡꎬ包含一个大
的开放阅读框架(ＯＲＦ)ꎬ首先翻译成一个大的多
聚蛋白ꎬ通过自身编码的蛋白酶裂解成 １０ 个成熟
蛋白(Ｐ１、ＨＣ￣Ｐｒｏ、Ｐ３、６Ｋ１、ＣＩ、６Ｋ２、ＶＰｇ、ＮＩａ￣Ｐｒｏ、
ＮＩｂ、ＣＰ)ꎮ 在 Ｐ３蛋白编码区内部还有一个较短的
ＯＲＦꎬ通过核苷酸移码策略翻译形成 Ｐ３Ｎ￣ＰＩＰＯ 蛋
白[３]ꎮ 相比其他蛋白ꎬＰ３蛋白容易变异ꎬ在大肠杆
菌中表达会产生毒素且难于复性[４]ꎮ 因此ꎬ对 Ｐ３
结构和功能了解很少ꎬ保守的结构和功能基序鲜有
报道ꎮ 据报道ꎬＰ３蛋白可能在病毒复制、决定致病
性、症状形成、寄主抗性、病毒移动等方面具有重要
功能[４~９]ꎮ 本研究从长春感病的十字花科蔬菜上
扩增得到 １０个 ＴｕＭＶ ｐ３基因ꎬ并利用其中一个分
离物的 ｐ３基因 Ｎ端 ６６３ ｂｐ片段进行了原核表达ꎬ
将融合蛋白纯化后作为抗原免疫家兔ꎬ获得了其特
异性抗血清ꎬ以期为研究该蛋白的结构和功能提供
帮助ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 １０个 ＴｕＭＶ分离物采自长春田间表现花叶症
状的十字花科蔬菜ꎬ分别命名为:ＪＣＲＲ０１、ＪＣＲ０２、
ＪＣＲ０３、 ＪＣＲ０４、 ＪＣＲ０５、 ＪＣＲ０６、 ＪＣＣ０７、 ＪＣＣ０８、
ＪＣＲａ０９ 和 ＪＣＭ１０ꎮ Ｔｒｉｚｏｌ、克隆载体 ｐＭＤ１８￣Ｔ
Ｖｅｃｔｏｒ购自 ＴａＫａＲａ 公司ꎻＰＶＤＦ 膜为北京鼎国昌
盛 生 物 技 术 有 限 公 司 产 品ꎻ 大 肠 杆 菌
(Ｅ. ｃｏｌｉ)ＤＨ５α与 ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐＬｙｓＳ、原核表达
载体 ｐＥＴ￣２８ａ(＋)均由本实验室提供ꎮ
１.２　 目的基因扩增与序列分析
　 　 根据 ＧｅｎＢａｎｋ 中 ＴｕＭＶ 全基因组序列ꎬ分别
于 ＨＣ￣Ｐｒｏ 和 ＣＩ 中选取保守区段设计引物 ＴｕＬＢ￣
ＨＣ２￣Ｆ ( ５′￣ＧＣＴＧＣＧＴＡＡＣＡＡＣＡＧＡＡＴＣＡ￣３′) 和
ＴｕＬＢＣＩ２￣Ｒ(５′￣ＧＡＧＴＧＧＧＴＴＣＧＡＧＡＡＧＣＡＡ￣３′)ꎬ
所扩增的片段包含完整的 ｐ３ 基因ꎮ 利用 Ｔｒｉｚｏｌ试
剂盒提取病样的总 ＲＮＡꎮ 以提取的总 ＲＮＡ 为模
板ꎬ采用 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法进行扩增ꎮ 纯化后的 ＰＣＲ
产物连接到 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体ꎬ转化 Ｅ. ｃｏｌｉ ＤＨ５α 感
受态细胞ꎬＰＣＲ 筛选阳性重组质粒ꎮ 序列测定由
华大基因公司完成ꎮ 依据已发表的相关分型文献ꎬ
从 ＧｅｎＢａｎｋ中选择了 １５ 个具有代表性ꎬ分别来源
于不同寄主、不同地域和不同年份ꎬ并已确定致病
型的 ＴｕＭＶ分离物[１０~１３](表 １)ꎮ 采用 ＤＮＡＳＴＡＲ
软件进行序列分析ꎬ用 ＭＥＧＡ４. ０ 中的 ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣
ｊｏｉｎｉｎｇ方法构建系统进化树ꎮ
１.３　 原核表达载体的构建
　 　 参考 Ｎｏｖáｋｏｖá 等[１４]的方法ꎬ利用 ｐ３ 基因 Ｎ
端 ６６３ ｂｐ 片段进行原核表达ꎬ推测蛋白大小约为
２８ ｋＤａꎮ 根据 ｐ３ 基因 Ｎ 端 ６６３ ｂｐ 片段序列设计
上游引物 ＴｕＪＣＲ０６￣Ｆ ( ５′￣ＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣ￣
ＣＡＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡＣ￣３′)和下游引物 ＴｕＪＣＲ０６￣Ｒ
(５′￣ＧＣＴＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＧＴＡＡＧＡＧＧＡＣＧＴＧＡＣＴ￣
ＧＡＣ￣３′)ꎬ５′端分别引入 ＥｃｏＲ Ｉ和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 酶切位
点(下划线部分)ꎮ 用特异引物 ＴｕＪＣＲ０６￣Ｆ 和
ＴｕＪＣＲ０６￣Ｒꎬ以重组 ｐＭＤ１８￣ ＪＣＲ０６ 质粒为模板进
行 ＰＣＲ扩增ꎬ０.８％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段ꎮ
经 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 双酶切后回收目的片段ꎬ连
接到同 ２ 种酶双酶切的 ｐＥＴ￣２８ａ ( ＋) 后ꎬ转化
Ｅ. ｃｏｌｉ ＤＨ５α感受态细胞ꎮ 经 ＰＣＲ 扩增和酶切验
证后的阳性重组质粒进行序列测定ꎬ验证阅读框架
是否正确ꎮ
１.４　 融合蛋白诱导表达及纯化
　 　 将阳性重组质粒 ｐＥＴ２８ａ￣ＪＣＲ０６ 转化大肠杆
菌表达菌株 ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐＬｙｓＳ中ꎬｐＥＴ￣２８ａ(＋)空
载体作为阴性对照ꎮ 挑取单克隆接种于 ５ ｍＬ ＬＢ
液体培养基(含 ５０ μｇ / ｍＬ卡那霉素)中ꎬ３７℃培养
过夜ꎬ１ ∶ １００稀释到 １０ ｍＬ ＬＢ液体培养基(含 ５０
μｇ / ｍＬ卡那霉素)中ꎬ同样条件下培养至 ＯＤ６００为
０.３ ~ ０.４ꎬ加 ＩＰＴＧ 至终浓度为 １ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ继续培
养ꎮ 分别在未诱导及诱导 ２、４、６ 和 ８ ｈ 时收集菌
体ꎬ加适量 ＴＥ缓冲液(ｐＨ ８.０)ꎬ振荡悬浮ꎬ再加入
等体积 ２ × ＳＤＳ 样品缓冲液ꎬ煮沸 １０ ｍｉｎꎬ ＳＤＳ￣
ＰＡＧＥ电泳检测蛋白的表达情况ꎮ
６８５
　
　 ６期 张雅琦ꎬ等:芜菁花叶病毒长春分离物 ｐ３基因的克隆、序列分析及 Ｐ３蛋白抗血清的制备
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｉｓｏｌａｔｅｓ Ｏｒｉｇｉｎａｌ ｈｏｓｔ Ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ Ｙｅａｒ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. Ｇｒｏｕｐｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
Ａ１ Ａｌｌｉａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｉｔａｔｙ １９６８ ＡＢ０９３５９８ ｂａｓａｌ￣Ｂ [１３]
ＲＵＳ２ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｒｕｓｓｉａ Ｕｎｋｎｏｗｎ ＡＢ０９３６０７ ｗｏｒｌｄ￣Ｂ [１３]
Ｃａｌ１ Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｉｔａｌｙ １９７９ ＡＢ０９３６０１ ｂａｓａｌ￣ＢＲ [１０]
ＣＰ８４５Ｊ Ｃ. ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｊａｐａｎ １９９７ ＡＢ０９３６１４ ｂａｓａｌ￣ＢＲ [１０]
ＳＧＤ３１１Ｊ Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｊａｐａｎ １９９８ ＡＢ０９３６１９ Ａｓｉａｎ￣ＢＲ [１０]
Ｓｔ４８ Ｌｉｍｏｎｉｕｍ ｓｉｎｕａｔｕｍ Ｉｔａｌｙ １９９３ ＡＢ０９３５９６ ｂａｓａｌ￣Ｂ [１０]
ＵＳＡ１ Ｂ. ｏｌｅｒａｃｅａ ＵＳＡ １９９３ ＡＢ０９３６０９ ｗｏｒｌｄ￣Ｂ [１０]
ＰＶ３７６￣Ｂｒ Ｂ. ｎａｐｕｓ Ｇｅｒｍａｎｙ １９７０ ＡＢ０９３６０４ ｗｏｒｌｄ￣Ｂ [１０]
ＮＺ２９０ Ｂ. ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ １９９８ ＡＢ０９３６１２ ｗｏｒｌｄ￣Ｂ [１０]
ＣＺＥ１ Ｂ. ｏｌｅｒａｃｅａ Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ １９９４ ＡＢ０９３６０８ ｗｏｒｌｄ￣Ｂ [１０]
ＩＳ１ Ａｌｌｉｕｍ ａｍｐｅｌｏｐｒａｓｕｍ Ｉｓｒａｅｌ １９９３ ＡＢ０９３６０２ ｂａｓａｌ￣Ｂ [１０]
ＨＲＤ Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｃｈｉｎａ (Ｚｈｅｊｉａｎｇ) １９９８ ＡＢ０９３６２７ Ａｓｉａｎ￣ＢＲ [１０]
ＣＨ６ Ｒ. ｓａｔｉｖｕｓ Ｃｈｉｎａ (Ｊｉａｎｇｓｕ) １９９９ ＡＢ２５２１０３ Ａｓｉａｎ￣ＢＲ [１１]
ＴＡＮＸ２ Ｒ. ｓａｔｉｖｕｓ Ｃｈｉｎａ (Ｓｈａｎｄｏｎｇ) ２００７ ＥＵ７３４４３３ ｂａｓａｌ￣ＢＲ [１２]
ＷＦＬＢ０６ Ｒ. ｓａｔｉｖｕｓ Ｃｈｉｎａ (Ｓｈａｎｄｏｎｇ) ２００６ ＥＵ７３４４３４ ｂａｓａｌ￣ＢＲ [１２]
ＪＣＲＲ０１ Ｒ. ｓａｔｉｖｕｓ Ｃｈｉｎａ (Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ) ２０１２ ＫＰ１６５４２７ ｂａｓａｌ￣ＢＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＪＣＲ０２ Ｒ. ｓｓａｔｉｖｕｓ Ｃｈｉｎａ (Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ) ２０１２ ＫＰ１６５４２１ ｂａｓａｌ￣ＢＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＪＣＲ０３ Ｒ. ｓｓａｔｉｖｕｓ Ｃｈｉｎａ (Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ) ２０１２ ＫＰ１６５４２２ ｂａｓａｌ￣ＢＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＪＣＲ０４ Ｒ. ｓａｔｉｖｕｓ Ｃｈｉｎａ (Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ) ２０１２ ＫＰ１６５４２３ ｂａｓａｌ￣ＢＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＪＣＲ０５ Ｒ.ｓａｔｉｖｕｓ Ｃｈｉｎａ (Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ) ２０１２ ＫＰ１６５４２４ ｂａｓａｌ￣ＢＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＪＣＲ０６ Ｒ. ｓａｔｉｖｕｓ Ｃｈｉｎａ (Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ) ２０１２ ＫＰ１６５４２５ ｂａｓａｌ￣ＢＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＪＣＣ０７ Ｂ. ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｉｎａ (Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ) ２０１２ ＫＰ１６５４１８ ｂａｓａｌ￣ＢＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＪＣＣ０８ Ｂ. ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｉｎａ (Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ) ２０１２ ＫＰ１６５４１９ ｂａｓａｌ￣ＢＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＪＣＲａ０９ Ｂ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｃｈｉｎａ (Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ) ２０１２ ＫＰ１６５４２６ ｂａｓａｌ￣ＢＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＪＣＭ１０ Ｂ. ｊｕｎｃｅａ Ｃｈｉｎａ (Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ) ２０１２ ＫＰ１６５４２０ ｂａｓａｌ￣ＢＲ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
　
　 　 经 ＩＰＴＧ诱导表达 ４ ｈ后ꎬ大量收集菌体ꎬ用缓
冲液( ２５ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬｐＨ ６.８ꎻ８％ ＳＤＳ) 重
悬浮ꎬ超声裂解 ５ ｍｉｎꎬ获得总蛋白提取物ꎬ５ ０００ ｒ /
ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎꎬ取上清加入 １５ ｍＬ 的 Ｎｉ２＋ ￣ＮＴＡ
Ａｇａｒｏｓｅꎬ经 Ｎｉ２＋ ￣ＮＴＡ亲和层析柱纯化得到融合的
目的蛋白ꎮ
１.５　 抗血清制备与效价测定
　 　 蛋白纯化产物用适量生理盐水稀释后ꎬ加入等
体积的福氏不完全佐剂(１.５ ｇ 羊毛脂＋８ ｍＬ 石蜡
油)进行乳化ꎬ免疫注射家兔ꎮ 采用肌肉注射并结
合皮下注射ꎬ每隔 ７ ｄ 注射 １ 次ꎬ每次免疫剂量约
为 ２~ ５ ｍｇꎬ共注射 ４ 次ꎮ 最后一次注射 ７ ｄ 后采
血ꎬ制备的抗血清分装后－２０℃保存[１５]ꎮ
　 　 以 ＴｕＭＶ 侵染的萝卜叶片为抗原ꎬ采用间接
ＥＬＩＳＡ 对制备的抗血清进行效价测定ꎬ系列倍比
稀释(１ ∶ １２８、１ ∶ ２５６、１ ∶ ５１２、１ ∶ １ ０２４、１ ∶ ２ ０４８、
１ ∶ ４ ０９６、１ ∶ ８ １９２)的抗血清作为一抗ꎬ辣根过氧
化物酶标记的羊抗兔 ＩｇＧ 为二抗ꎬ待检样品 /阴性
对照吸光值(Ｐ / Ｎ)大于 ２.０为阳性ꎮ
７８５
　
植物病理学报 ４５卷
１.６　 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析
　 　 分别收集 ｐＥＴ￣２８ａ(＋)诱导产物、含重组表达质
粒 ｐＥＴ２８ａ￣ＪＣＲ０６的诱导产物ꎬ加入 １５ ｍＬ 裂解缓
冲液进行悬浮ꎬ超声裂解ꎬ获得总蛋白提取物ꎬ离心ꎬ
收集上清ꎮ 含重组表达质粒的诱导产物离心所得到
的上清ꎬ用 Ｎｉ２＋￣ＮＴＡ亲和层析柱纯化目的蛋白ꎮ 制
备 １２％ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ凝胶ꎬ电泳后转印 ＰＶＤＦ膜进行
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析ꎮ 转印后的 ＰＶＤＦ 膜用含 ５％
脱脂奶粉的 Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ 缓冲液(ＴＢＳＴ)室温摇床封闭
１ ｈꎬＴＢＳＴ缓冲液洗涤 ３次后ꎬ制备的抗血清作为一
抗(１ ∶ ２ ０００稀释)室温孵育 １ ｈꎬＴＢＳＴ缓冲液洗涤
３次后ꎬ用碱性磷酸酶标记的 Ａ 蛋白作为二抗
(１ ∶ ２ ０００稀释)室温孵育 １ ｈꎬＴＢＳＴ 再洗涤 ３ 次
后ꎬ用 ＮＢＴ / ＢＣＩＰ充分显色后观察结果ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＴｕＭＶ ｐ３基因的扩增及克隆
　 　 从侵染 ＴｕＭＶ的十字花科蔬菜叶片中提取总
ＲＮＡꎬ经 ＲＴ￣ＰＣＲ扩增获得大小约为 ２.１ ｋｂ 目的
片段(图 １)ꎮ 将纯化后的扩增产物克隆到 ｐＭＤ１８￣
Ｔ载体ꎮ 经菌液 ＰＣＲ 验证ꎬ得到含有目的片段的
重组质粒ꎮ
Ｆｉｇ. １ 　 ＲＴ￣ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇ￣
ｍｅｎｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐ３ ｇｅｎｅ
Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＬ５０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: ＲＴ￣ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ
ＪＣＲ０６ ｉｓｏｌａｔｅ.
２.２　 ＴｕＭＶ ｐ３基因序列分析
２.２.１　 一致率比较　 序列测定发现ꎬＲＴ￣ＰＣＲ 扩增
产物长度为 ２ １００ ｂｐꎬ包含 １ ０６５ ｂｐ的 ｐ３基因ꎬ推
测编码 ３５５个氨基酸ꎮ 经 ＤＮＡＳＴＡＲ软件分析ꎬ本
研究获得的 １０ 个 ｐ３ 基因核苷酸序列一致率为
９８.８％~９９.６％ꎬ从不同寄主上获得的病毒分离物
在核苷酸水平上一致率没有明显差异ꎮ 与
ＧｅｎＢａｎｋ中其他 １５ 个 ＴｕＭＶ 分离物核苷酸序列一
致率为 ８０.９％ ~ ９９.４％ꎮ 其中ꎬ与山东泰安 ＴＡＮＸ２
(登录号为 ＥＵ７３４４３３)分离物核苷酸序列一致率最
高ꎬ达 ９９.４％ꎻ与意大利 Ａ１(登录号为 ＡＢ０９３５９８)分
离物核苷酸序列一致率最低ꎬ为 ８０.９％ꎮ
２.２. ２ 　 系统进化树分析 　 在与 ＧｅｎＢａｎｋ １５ 个
ＴｕＭＶ分离物 ｐ３ 基因构建的系统进化树中ꎬ２５ 个
ＴｕＭＶ分离物在系统进化树上形成 ４ 个组:ｂａｓａｌ￣
ＢＲ、Ａｓｉａｎ￣ＢＲ、ｗｏｒｌｄ￣Ｂ 和 ｂａｓａｌ￣Ｂ 组ꎬ本研究获得
的 １０个长春分离物均属于 ｂａｓａｌ￣ＢＲ组(图 ２)ꎮ １０
个长春分离物与 ｂａｓａｌ￣ＢＲ 组、Ａｓｉａｎ￣ＢＲ 组、ｗｏｒｌｄ￣
Ｂ组和 ｂａｓａｌ￣Ｂ组各分离物核苷酸序列一致率分别
为 ９１.６％ ~ ９９.４％、８４.５％ ~ ８５.１％、８１.３％ ~ ８４.４％、
８０.９％~８２.５％ꎮ
２.３　 重组质粒的 ＰＣＲ验证和酶切验证
　 　 本研究获得的 ＴｕＭＶ 分离物 ｐ３ 基因大小为
１ ０６５ ｂｐꎬ编码 ３５５ 个氨基酸ꎬ推测蛋白大小为
４０ ｋＤａꎮ 根据 ｐ３基因 Ｎ端 ６６３ ｂｐ片段序列设计特
异性引物[１４]ꎬ对重组质粒 ｐＥＴ２８ａ￣ＪＣＲ０６ 用引物
ＴｕＪＣＲ０６￣Ｆ和 ＴｕＪＣＲ０６￣Ｒ 进行扩增ꎬ得到大小约
６６３ ｂｐ的条带ꎻ用 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 进行双酶切验
证并进行序列测定ꎮ 测序结果证明阅读框架正确ꎮ
２.４　 融合蛋白的原核表达与纯化
　 　 将验证正确的重组质粒 ｐＥＴ２８ａ￣ＪＣＲ０６ 和
ｐＥＴ￣２８ａ(＋)空载体转化到大肠杆菌 ＢＬ２１(ＤＥ３)
ｐＬｙｓＳ中ꎬ并用 １ ｍｍｏｌ / Ｌ的 ＩＰＴＧ诱导表达ꎬ表达
得到的融合蛋白用 Ｎｉ２＋ ￣ＮＴＡ 亲和层析柱进行纯
化ꎮ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳检测结果表明ꎬ含重组表达质
粒的菌液粗提物和经纯化的蛋白在 ２８ ｋＤａ 处均出
现一条特异性条带ꎬ与预测大小一致ꎬ未经诱导含重
组质粒的菌液粗提物和经诱导含空载体的菌液粗提
物相应位置无明显条带(图 ３)ꎬ表明目标蛋白在大
肠杆菌 ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐＬｙｓＳ中得到了正确表达ꎮ
８８５
　
　 ６期 张雅琦ꎬ等:芜菁花叶病毒长春分离物 ｐ３基因的克隆、序列分析及 Ｐ３蛋白抗血清的制备
Ｆｉｇ. ２　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＴｕＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐ３ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
Ｔｈｅ Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅ >５０％ ｉｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ. Ｎｏｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ５０％ ａｒｅ ｈｉｄｄｅｎ.
Ｅａｃｈ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ｌｉｓｔｅｄ ｂｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ￣ｉｓｏｌａｔｅ ｎａｍｅ￣ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｒｉｇｉｎ.
Ｆｉｇ. ３ 　 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＬ２１(ＤＥ３)
ｐＬｙｓＳꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＴ￣２８ａ(＋)ꎻ Ｌａｎｅ ３:Ｎｏｎ￣ｉｎ￣
ｄｕｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｐＥＴ２８ａ￣ＪＣＲ０６ꎻ Ｌａｎｅ ４￣７: Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｐＥＴ２８ａ￣ＪＣＲ０６ ａｔ ２ꎬ ４ꎬ ６ ａｎｄ ８ ｈ.
２.５　 抗血清制备与检测
　 　 用纯化蛋白作为抗原免疫家兔ꎬ４ 次免疫后采
血获得 ＴｕＭＶ Ｐ３蛋白的抗血清ꎮ 以感病的萝卜叶
片为抗原ꎬ进行间接 ＥＬＩＳＡ 检测(表 ２)ꎮ 结果表
明抗血清稀释至 １ ∶ ２ ０４８ 时ꎬＰ / Ｎ 值为 ２.０６９ꎬ而
抗血清稀释至 １ ∶ ４ ０９６ 时ꎬＰ / Ｎ 值为 １.７８０ꎬ因此
其效价至少是 １ ∶ ２ ０４８ꎮ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 结果表
明ꎬ含重组表达质粒的菌液粗提物和经纯化的蛋白
在 ２８ ｋＤａ 处均出现一条特异性条带ꎬ而经诱导含
ｐＥＴ￣２８ａ(＋)空载体的菌液粗提物相应位置无特异
性条带出现ꎬ表明原核表达制备的 ＴｕＭＶ Ｐ３ 抗血
清能够与诱导产物产生特异性反应ꎬ而与菌体自身
产生的蛋白无反应(图 ４)ꎮ
９８５
　
植物病理学报 ４５卷
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｉｔｅｒ ｏｆ ａｎｔｉ￣ ＪＣＲ０６￣Ｐ３ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｎｄｉｒｅｃｔ￣ＥＬＩＳＡ
Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ / Ａ４０５
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
１２８ ２５６ ５１２ １ ０２４ ２ ０４８ ４ ０９６ ８ １９２
ＴｕＭＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ (Ｐ) ０.５８７ ０.４５９ ０.３７７ ０.２７４ ０.１４９ ０.０７３ ０.０１５
Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (Ｎ) ０.１９６ ０.１７８ ０.１６１ ０.１３３ ０.０７２ ０.０４１ ０.０１１
Ｐ / Ｎ ２.９９５ ２.５７９ ２.３４２ ２.０６０ ２.０６９ １.７８０ １.３６４
　
Ｆｉｇ. ４　 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＴ２８ａ￣ＪＣＲ０６
(ｐｕｒｉｆｉｅｄ)ꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＴ２８ａ￣ＪＣＲ０６ (ｃｒｕｄｅ ｂａｃｔｅ￣
ｒｉｕｍ ｅｘｔｒａｃｔ)ꎻ Ｌａｎｅ ３: Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＴ￣２８ａ(＋) .
３　 讨论
　 　 利用生物学和血清学研究手段表明ꎬＴｕＭＶ分
离物存在着广泛的变异[１６]ꎮ ＴｕＭＶ 寄主范围广、
变异类型多是因为 ＴｕＭＶ 基因组容易发生变
异[１７ꎬ１８]ꎮ 根据 ＴｕＭＶ基因组的全序列及部分基因
的核苷酸序列ꎬ将其分离物分为 ｂａｓａｌ￣ＢＲ、Ａｓｉａｎ￣
ＢＲ、ｗｏｒｌｄ￣Ｂ 和 ｂａｓａｌ￣Ｂ ４ 个组[１３]ꎮ ＣＰ 的 Ｎ￣端区
域和 Ｐ１、Ｐ３蛋白是最易变异的 ３个区域[１１]ꎮ 本研
究依据 ｐ３ 基因序列对 ２５ 个 ＴｕＭＶ 分离物进行分
组ꎬ其分组结果与依据 ＴｕＭＶ 基因组全序列或部
分 ＴｕＭＶ 基因序列进行分组的结果一致ꎮ 由此可
见ꎬ根据 ｐ３基因对 ＴｕＭＶ 分离物进行分组是可行
的ꎮ 本研究得到的 １０ 个 ＴｕＭＶ 分离物均属于
ｂａｓａｌ￣ＢＲ组ꎬ继 Ｔｉａｎ 等[１９]在中国发现 ＴｕＭＶ 的
ｂａｓａｌ ＢＲ组分离物后ꎬ又一次证实 ｂａｓａｌ￣ＢＲ 组分
离物在中国的存在及不同的地理分布ꎮ
　 　 相比 ＴｕＭＶ 编码的其他蛋白ꎬＰ３ 具有高度变
异性ꎬ结构和功能上的保守区域鲜有报道ꎬ在大肠
杆菌中表达产生毒性ꎬ很难复性ꎬ所以对其结构和
功能了解较少[４~９]ꎮ 进一步了解 ＴｕＭＶ Ｐ３ 蛋白的
功能ꎬ对深入研究该病毒的致病机制具有重要意
义ꎮ Ｐ３蛋白在受病毒侵染的植株体内含量很低ꎬ
一般 Ｐ３ 蛋白抗体难以检测到[１４]ꎬ本研究利用
ＴｕＭＶ侵染的萝卜为抗原测定的抗血清效价仅为
１ ∶ ２ ０４８ꎬ推测可能是因为 Ｐ３ 蛋白在感病寄主体
内表达量低ꎮ 本研究最初利用全长 ｐ３基因构建原
核表达载体ꎬ但未能成功表达出 Ｐ３蛋白ꎬ因此参考
Ｎｏｖáｋｏｖá等[１４]的方法ꎬ选用 ＴｕＭＶ ｐ３ 基因 Ｎ 端
６６３ ｂｐ片段进行原核表达ꎬ克服了全长 ｐ３ 基因在
大肠杆菌中表达产生毒性的缺点ꎬ利用纯化的融合
蛋白制备了多克隆抗体ꎬ用此抗体能够检测感病植
物中 Ｐ３蛋白的表达ꎬ为下一步研究 Ｐ３蛋白亚细胞
和组织表达定位、筛选与其互作的寄主蛋白等提供
了基础ꎬ从而进一步明确 ＴｕＭＶ Ｐ３ 蛋白在病毒致
病过程中的功能ꎮ
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责任编辑:于金枝
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