全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(4): 361鄄370(2011)
收稿日期: 2010鄄09鄄24; 修回日期: 2011鄄05鄄04
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30971879); 浙江省自然科学基金资助项目(Y304211)
通讯作者: 卢建平,植物病理学博士,副教授,主要从事真菌分子生物学研究; Tel: 0571鄄86971185, E鄄mail: jplu@zju. edu. cn
第一作者: 厉晓东(1985 - ),男,山东日照人,在读硕士,主要从事真菌分子生物学研究; E鄄mail: 13868023903@163. com。
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的凋亡诱导和检测
厉晓东1, 卢建平1*, 刘小红2, 林福呈2
( 1浙江大学生命科学学院, 杭州 310058; 2浙江大学生物技术研究所, 杭州 310058)
摘要: 使用低浓度 H2O2 和高浓度 NaCl诱导稻瘟病菌的凋亡,检测了产生的凋亡特征。 结果显示:诱导后稻瘟病菌具有典
型的凋亡特征,如胞内活性氧累积、磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内表面转移到外表面、染色体浓缩和 DNA断裂。 进一步研究
发现:凋亡关键性酶类 caspase的抑制剂 Z鄄VAD鄄FMK能够显著影响稻瘟病菌的孢子萌发和附着胞形成过程。 典型的稻瘟
病菌孢子由 3 个细胞组成;在 Z鄄VAD鄄FMK的作用下,2 个以上细胞同时萌发产生芽管的比例由 34. 1%增加到 66. 0% ,同
时形成附着胞的源细胞也以顶端细胞为主转变为以基部细胞为主。 这些结果说明凋亡参与了稻瘟病菌的孢子萌发和附着
胞形成过程。
关键词: 稻瘟病菌; 凋亡; metacaspase; 孢子萌发; 附着胞形成
Induction and detection of apoptosis in rice blast fungus, Magnaporthe oryzae
LI Xiao鄄dong1, LU Jian鄄ping1, LIU Xiao鄄hong2, LIN Fu鄄cheng2 摇 (1College of Life Sciences, Zhejiang University,
Hangzhou 310058, China; 2Biotechnology Institute, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)
Abstract: The response of apoptotic phenotype of Magnaporthe oryzae was analyzed against low dose of
H2O2 and high concentration of NaCl. Typical apoptotic markers including chromatin condensation, nuclear
DNA degradation, flipping of phosphatidylserine (PS) of the plasma membrane from inside to outside surface
and intracellular reactive oxygen species (ROS) were induced in the treated fungus. The caspase inhibitor (Z鄄
VAD鄄FMK) 鄄treated fungus showed increased rate of conidial germination (66. 0% ) compared with the un鄄
treated (34. 1% ), from two or three cells of three鄄celled conidia simultaneously. Furthermore, the cells form鄄
ing appressoria in most of the spores shifted from the apical to the basal cells. These results implied that apop鄄
tosis was involved in appressorial formation and conidial germination.
Key words: Magnaporthe oryzae; apoptosis; metacaspase; conidial germination; appressorium formation
中图分类号: S432. 41; S435. 661摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)04鄄0361鄄10
摇 摇 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是一种严重危
害水稻产量的植物病原真菌;估测国内每年超过
3. 8 伊 106 hm2 的水稻受到稻瘟病的侵害。 稻瘟病
菌也是研究病原真菌鄄植物相互作用的模式生物之
一,是目前研究最为深入的植物病原真菌之
一[1,2],已经获得了许多关于该菌孢子的形成和萌
发、定殖、附着胞形成和穿透以及侵入后生长等各
方面的遗传和分子生物学信息[3 ~ 12]。
近来的研究显示自噬性程序性细胞死亡是附
着胞介导的稻瘟病菌侵染所必需的[13,14]。 细胞自
噬是一种降解细胞内源性物质的过程:细胞在氮饥
饿情况下通过自噬过程降解蛋白质、脂肪和细胞
器,循环利用细胞内营养物质以适应生存的需
要[15]。 稻瘟病菌自噬缺陷突变子的附着胞膨压显
著减低,从而丧失穿透能力;然而,突变子的附着胞
形成能力并没有受到影响[14]。 凋亡是另一种类型
摇
植物病理学报 41 卷
的程序性细胞死亡。 在多细胞生物中,比如动植
物,凋亡导致细胞死亡;凋亡一般发生在细胞受到
损伤时,多细胞生物维持细胞动态平衡过程中[16]
以及发育过程中[17],和淋巴细胞互作过程中[18]。
在单细胞生物酵母中,凋亡也导致细胞死亡[19 ~ 21]。
酵母细胞的衰老死亡也具有凋亡特征,如氧自由基
的累积、caspase活性增加等[22]在酵母种群发展过
程中,凋亡具有通过消除衰老等不适细胞而清洁种
群的作用[23],是种群长期生存必需的[24]。
与哺乳动物细胞一样,酵母凋亡细胞具有同样
的凋亡特征:DNA 断裂、染色体浓缩和边缘化、磷
脂酰丝氨酸外翻到细胞膜外表面和细胞色素 C 渗
漏到线粒体外等[25,26]。 活性氧(ROS)是酵母凋亡
调控过程的中心,说明酵母和多细胞动物的凋亡过
程不仅表型相同,而且也具有同样的调控机
制[19,27]。 丝状真菌中也存在凋亡现象,凋亡细胞
也具有类似于酵母凋亡的特征,并对一些主要的凋
亡同源蛋白(如 Aif1、Nuc1、Metacaspase 等)进行
了研究[28]。 尽管已经在稻瘟病菌中发现存在凋亡
同源蛋白[29],然而还没有报道过稻瘟病菌的凋亡
现象;凋亡在稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成中的
作用还未知。 本文报道了使用低浓度 H2O2 和高
浓度 NaCl诱导稻瘟病菌的凋亡过程,并用几种方
法检测了其凋亡特征;还使用凋亡调控关键酶类半
胱天冬酶(caspase)的抑制剂 Z鄄VAD鄄FMK 研究了
metacaspase(caspase的同源蛋白)对于孢子萌发和
附着胞形成的作用。
1摇 材料与方法
1. 1摇 菌株和培养基
使用的稻瘟病菌菌株为 Guy鄄11;培养基为完
全培养基(CM培养基) [4];培养环境 25益、光周期
14 h光照 / 10 h黑暗的光照培养箱。
1. 2摇 氯化钠或过氧化氢诱导稻瘟病菌的凋亡
发生
收集 10 d 龄的稻瘟病菌孢子,在 CM 液体培
养基中培养 3 d (25益,150 r / min)。 菌丝体收集
后分成 3 份:1 份继续培养在 CM 液体培养基中,
另 1 份培养在含有 0. 7 mol / L NaCl的 CM液体培
养基中,第 3 份培养在含有 10 mmol / L H2O2 的
CM培养基中。 在 25益、150 r / min 的摇床上培养
4 h后,收集菌丝体进行凋亡检测或制备原生质体
后再进行凋亡检测。 制备原生质体的菌丝体用山
梨醇缓冲液 (1. 2 mol / L 山梨醇, 0. 5 mmol / L
MgCl2, pH 6. 8)或蔗糖缓冲液(0. 8 mol / L 蔗糖,
35 mmol / L磷酸钾,pH 6. 8)冲洗,再用细胞壁裂
解酶(7. 5 mg / mL) (Glucanex lyticase,Novo Nor鄄
disk, UK)酶解 2 ~ 3 h(30益,80 r / min)。 酶解液
过滤收集、离心,重悬于山梨醇缓冲液或其他相应
缓冲液。 用来检测凋亡的方法有:活性氧检测、
Annexin V鄄FITC 染色、 TUNEL 染色和染色体
染色。
1. 3摇 活性氧检测
使用碧云天生物研究所的活性氧检测试剂盒,
DCFH鄄DA法染色检测胞内 ROS。
原生质体悬浮于山梨醇缓冲液,然后在含有
10 滋mol / L 2忆, 7忆鄄dichlorofluorescein diacetate
(DCFH鄄DA ) 的山梨醇缓冲液中于黑暗温育
20 min(30益);用山梨醇缓冲液洗 3 次后,荧光显
微镜观察。
菌丝在含有 10 滋mol / L DCFH鄄DA 的 CM 液
体培养基中培养 45 min(28益,80 r / min),然后用
磷酸缓冲液(0. 01 mol / L,pH 7. 2)洗 3 次,荧光显
微镜观察。
孢子(5 伊104 个 / mL,CM液体培养基)点接种
于玻璃载玻片上,25益培养 24 h。 玻片上的菌丝用
不含或含有 0. 7 mol / L NaCl 或 10 mmol / L H2O2
的 CM液体培养基培养 4 h;用 CM 液体培养基洗
3 次后,再在含有 10 滋mol / L DCFH鄄DA 的 CM 液
体培养基中培养 45 min(28益,80 r / min);用磷酸
缓冲液(0. 01 mol / L,pH 7. 2)洗 3 次,荧光显微镜
观察。
1. 4摇 磷脂酰丝氨酸检测
采用晶美生物公司的 Annexin V鄄FITC 凋亡试
剂盒,FITC耦合的 Annexin V 法检测外翻的磷脂
酰丝氨酸( phosphatidylserine)。 原生质体悬浮于
含有 1. 2 mol / L 山梨醇(或 0. 8 mol / L 蔗糖)的结
合缓冲液 ( 10 mmol / L Hepes / NaOH, pH 7. 4,
140 mmol / L NaCl, 2. 5 mmol / L CaCl2),离心收集
后重悬于上述山梨醇 (或蔗糖)结合缓冲液;把
2. 5 滋L Annexin V鄄FITC 和 2 滋L 碘化丙锭 (20
滋g / mL)加入 38 滋L的细胞悬浮液中,室温黑暗孵
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摇
摇 4 期 摇 摇 厉晓东,等:稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的凋亡诱导和检测
育 20 min;离心收集细胞,重悬于山梨醇(或蔗糖)
结合缓冲液,滴到载玻片上,荧光显微镜观察。
1. 5摇 DNA断裂检测
采用碧云天生物研究所的一步法 TUNEL 凋
亡分析试剂盒;利用 FITC 耦合的 dUTP 标记断裂
的 DNA的 3忆鄄OH 末端。 原生质体悬浮于山梨醇
缓冲液,4%甲醛固定 60 min。 离心收集原生质体,
重新收集和悬浮于磷酸缓冲液(0. 01 mol / L PBS,
pH 7. 2),冰上放置 2 min。 用磷酸缓冲液洗 2 次,
用 50 滋L TUNEL反应液(200 U / mL 末端脱氧核
苷酸转移酶, 10 mmol / L FITC鄄labeled dUTP, 25
mmol / L Tris / HCl, 200 mmol / L 二甲胂酸钠, 5
mmol / L氯化钴)37益黑暗温育 60 min;磷酸缓冲
液洗 2 次,滴在载玻片上于荧光显微镜下观察。
1. 6摇 染色体染色
原生质体用 70%乙醇固定 15 min,磷酸缓冲
液洗 2 次,涂抹到载玻片上,晾干;滴加 Hoechst
33258,染色 5 min,用磷酸缓冲液洗 2 次,荧光显微
镜观察。
1. 7摇 caspase 抑制剂(Z鄄VAD鄄FMK)对孢子萌发
的影响
收集 10 d 龄的稻瘟病菌孢子,无菌水洗涤,调
整成孢子浓度为 1 伊 105 个 / mL。 caspase 抑制剂
(Z鄄VAD鄄FMK)添加在孢子悬浮液中,终浓度为
100 滋mol / L。 孢子液(20 滋L)滴在塑料载玻片上,
25益保湿培养。 接种后 2 h 和 24 h 显微镜观察。
统计 300 个以上孢子的萌发率、附着胞形成率。 试
验重复 5 次。 用无菌水(不加 Z鄄VAD鄄FMK)处理
组作为对照。
2摇 结果与分析
2. 1摇 H2O2 和 NaCl 诱发稻瘟病菌细胞活性氧的
累积
在酵母和哺乳动物中,ROS 是凋亡早期和晚
期的关键调控因子[19,27]。 DCFH鄄DA 染色法检测
了稻瘟病菌菌丝细胞和原生质体的 ROS变化。 当
孢子在 CM培养基中萌发而新形成的菌丝暴露在
低浓度的 H2O2 时,29%的芽管细胞出现内源性的
ROS爆发(图1鄄A) ,而对照中没有观察到ROS爆
Fig. 1摇 H2O2 鄄 and NaCl鄄 triggered ROS in Magnaporthe oryzae
A: Germ tube germinated from conidia treated with 10 滋mol / L H2O2 . B: Germ tube germinated from conidia of untreated
control. C: 3鄄day鄄old hyphae treated with 0. 7 mol / L NaCl. D: 3鄄day鄄old hyphae of untreated control. E: Protoplast cells
treated with 0. 7 mol / L NaCl. F: Protoplast cells of untreated control. G: 7鄄day鄄old hyphae of untreated control.
Left: Under fluorescence microscope; Right: Under light microscope. When intracellular ROS burst, the FITC is
activated and emits green fluorescence in the cells. Bar, 10 滋m.
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发(图 1鄄B)。 当培养在 CM 液体培养基中的新鲜
菌丝经 0. 7 mol / L NaCl诱导后,很多菌丝细胞(图
1鄄C)和由菌丝制备的原生质体也出现内源性的
ROS爆发(图 1鄄E);而未处理的菌丝和原生质体缺
乏 ROS爆发(图 1鄄D、图 1鄄F)。 在培养较长时间
后,真菌菌丝会出现自溶现象。 而菌丝自溶具有凋
亡样特征,也是一种凋亡现象[30]。 在培养 7 d 且
未经凋亡诱导处理的菌丝中,也发现具有自发性的
ROS爆发(图 1鄄G)。
2. 2摇 H2O2 和 NaCl 诱发稻瘟病菌细胞膜的磷脂
酰丝氨酸外翻
磷脂酰丝氨酸外翻是凋亡发生早期的一个灵
敏的指标。 当凋亡发生时,磷脂酰丝氨酸从细胞膜
的内表面反转到外表面[25,31]。 在检测真菌细胞膜
外表面的磷脂酰丝氨酸时,先酶解去除菌丝细胞
壁,然后原生质体同时用 FITC鄄标记的 annexin V
和碘化丙锭染色。 统计发荧光的原生质体发现:经
10 mmol / L H2O2 诱导后,38%的稻瘟菌原生质体
在细胞膜四周发出强烈的绿色荧光,说明这些原生
质体的磷脂酰丝氨酸位于细胞膜外侧;49%的原生
质体的整个细胞发出强烈的红色荧光,说明细胞膜
已经破裂,细胞质吸收了碘化丙锭(图 2鄄A、图 2鄄
B)。 经 0. 7 mol / L NaCl 诱导的菌丝也具有与
H2O2 同样的诱导效果。 对于培养在不含 10
mmol / L H2O2或 0. 7 mol / L NaCl的 CM培养基中
的菌丝,只有 10%的原生质体显示很弱的绿色荧
光和 40%的原生质体发出强烈的红色荧光(图 2鄄
C),说明磷脂酰丝氨酸不在细胞膜外表面,而原生
质体制备过程造成 40%的原生质体细胞膜受损。
在原生质体制备中改用蔗糖缓冲液(0. 7 mol / L 蔗
糖, 0. 5 mmol / L MgCl2, 35 mmol / L 磷酸钾, pH
6. 8)作为渗透压稳定剂后,发现具有红色荧光的
细胞很少(图 2鄄D、图 2鄄E),说明细胞膜受损的原
生质体数量较少。 另外,发绿色荧光的凋亡细胞在
普通光显微镜的黑白照片中显得较小,反差也较
小,不易观察到(图 2鄄B、图 2鄄D)。
Fig. 2摇 H2O2 鄄triggered flipping of phosphatidylserine from inner to outer plasma membrane
of protoplasts of Magnaporthe oryzae shown by Annexin V鄄FITC staining
A, B, D: Protoplasts treated with 10 滋mol / L H2O2 . C, E: Untreated protoplasts control. A鄄C, E: Left, under fluorescence
microscope; Right, under light microscope. D: Left, under fluorescence microscope; Middle, under light microscope;
Right, merged. When a cell shows a strong green fluorescence around the whole circumference of the cell (marked
by arrows) and without red fluorescence in the cell, it means phosphatidylserine locates in the outer phase of the
plasma membrane. However, when a cell shows a red fluorescence (marked by triangle) in the whole cell,
it means the plasma membrane was disrupted. A鄄C protoplasts are rinsed in sorbitol
buffer and D鄄E protoplasts in sucrose buffer. Bar, 10 滋m.
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摇 4 期 摇 摇 厉晓东,等:稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的凋亡诱导和检测
2. 3摇 H2O2 和 NaCl 诱发稻瘟病菌细胞染色体浓
缩和 DNA降解
在酵母和动物细胞中,染色体浓缩、边缘化和
DNA降解是凋亡发生晚期的典型的特征[25]。 在
含有 0. 7 mol / L NaCl的 CM培养基中培养 4 h后,
稻瘟病菌菌丝制备获得的原生质体经 DNA 和
TUNEL染色后显示具有显著的凋亡特征,包括染
色体浓缩(图 3鄄A)和 DNA 片段化(图 3鄄B)。 经
Hoechst 33258 染色后,部分原生质体的细胞核发
出强烈的白色荧光(图 3鄄A),显示染色体出现浓
缩;经过 FITC鄄耦合的 TUNEL检测,原生质体显示
绿色荧光,表示 DNA出现断裂现象(图 3鄄B)。
2. 4 摇 caspase 抑制剂对稻瘟病菌孢子萌发和附
着胞形成的干扰作用
动物的 caspases和酵母的 metacaspase 在凋亡
的调节中起着关键的作用[32 ~ 34]。 在酵母中,meta鄄
caspase 基因 (MCA1 / YCA1 ) 敲除后,凋亡被抑
制[32]。 鹅掌柄孢壳 metacaspase 基因(PaMCA1 和
PaMCA2)敲除突变体表现为细胞存活时限增加
80%到 148% [35]。 在检索稻瘟病菌数据库 ( ht鄄
tp: / / www. broad. mit. edu)后,发现稻瘟病菌基因
组具有 2 个MCA1 的同源基因。 稻瘟病菌的Mca1
同源蛋白(MGG_13530. 6 和 MGG_04926. 6)与酵
母 Mca1 蛋白分别具有 47% 和 48%序列相似性。
capase抑制剂(Z鄄VAD鄄FMK)能够抑制动物、植物
和酵母中各种 caspase 或 metacaspase 的活性。 我
们用 Z鄄VAD鄄FMK抑制稻瘟病菌 metacaspase 的活
性,借以初步了解 metacaspase 在稻瘟病菌孢子萌
发和附着胞形成过程中的作用。 在含有 100
滋mol / L Z鄄VAD鄄FMK的无菌水中培养时,稻瘟病
菌的孢子萌发和附着胞形成受到明显的影响(表
1、图 4)。 与对照组相比,Z鄄VAD鄄FMK 处理组同
时从 2 个细胞或 3 个细胞萌发形成芽管的比率增
加了 2 倍,从 34. 1%增加到 66. 0% (P臆0. 05)。
而且Z鄄VAD鄄FMK处理后孢子形成附着胞的细胞
Fig. 3摇 Chromatin condensation and DNA fragmentation of Magnaporthe oryzae
in protoplasts from 3鄄day鄄old hyphae treated with 0. 7 mol / L NaCl
A ( treated) &B (untreated): Chromatin stained with Hoechst 33258. Arrows indicate condensated chromatin, which
shows strong white fluorescence in nucleus. C ( treated) &D (untreated): DNA fragmentation stained for TUNEL assay.
The cells emitting strong green fluorescence (marked by an arrow) indicate that its DNA was fragmentated.
Left: Under fluorescence microscope; Right: Under light microscope. Bar, 10 滋m.
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Table 1摇 Effect of caspase inhibitor Z鄄VAD鄄FMK on conidial germination and
appressorial formation of Magnaporthe oryzae
Germination
rate / % 1
Germination
rate / % 2
Appressorial
formation rate / % 3
Cell location of appressorial
formation / % 4
Apical Mid Basal
Treatment 94. 1 依 4. 5 66. 0 依 6. 8 97. 1 依 1. 2 38. 8 依 14. 4 0. 6 依 0. 9 60. 6 依 13. 9
Control 97. 1 依 2. 0 34. 1 依 13. 2 96. 6 依 2. 0 76. 2 依 8. 4 0. 9 依 2. 0 22. 9 依 6. 9
The conidia of M. oryzae strain Guy鄄11 were incubated to germinate and to form appressoria on plastic coverslips with 100
滋mol / L Z鄄VAD鄄FMK ( treatment) or without (control) . 1, the rate of conidia emerged germ tubes at 2 h post incuba鄄
tion; 2, the rate of conidia emerged germ tubes from two cells or three cells of three鄄celled conidia at 24 h post incuba鄄
tion. 3, the rate of appressorial formation from emerged conidia at 24 h post incubation. 4, percent distribution in three
cells of conidia, which formed appressoria at 24 h post incubation.
Fig. 4摇 Conidial germination and appressorial formation of Magnaporthe oryzae
on plastic coverslips under treated with Z鄄VAD鄄FMK
A: Control (without Z鄄VAD鄄FMK) . B: Treated with 100 滋mol / L Z鄄VAD鄄FMK. Arrow indicated an appressorium
formed from a basal cell and triangle arrow indicated the second germ tube from a conidium. Bar, 10 滋m.
位置也发生了变化。 典型的稻瘟病菌孢子含有 3
个细胞,通常由孢子的顶端细胞萌发形成附着胞。
经过 Z鄄VAD鄄FMK 处理后,孢子的顶端细胞形成
附着胞的比例由 76. 2%减少到 38. 8% ,而从柄部
细胞形成附着胞的比例从 22. 9%增加到 60. 6%
(P臆0. 05)。 然而,孢子的附着胞形成率并没有发
生变化(表 1)。
3摇 讨论
凋亡是一种复杂的程序性细胞死亡现象,由
多个不同的信号途径调节,依赖于死亡细胞的积
极参与[36] 。 凋亡在多细胞生物的内环境平衡、发
育、消除外来病原菌侵入的防御机制中具有重要
的作用[37,38] 。 最近,酵母和丝状真菌中也发现了
凋亡现象和类似多细胞凋亡蛋白的同源蛋
白[19,21,28,39,40]。 丝状真菌凋亡常发生在细胞衰老、
繁殖的过程中[28,30,41],如:真菌异核体不亲和
性[42]、四子囊锥毛壳菌(Coniochaeta tetrasperma)
子囊孢子的发育(含有 8 个子囊孢子的子囊在成
熟过程中,其中 4 个孢子凋亡,最终产生含 4 个孢
子的子囊) [43]、灰盖鬼伞(Coprinopsis cinereus)有
性生殖过程中由凋亡引起的“白帽突变冶 (white鄄
cap mutant)现象[44]、菌丝自溶也具有类似高等多
细胞动物具有的凋亡特征[30]。 Phytoshingolipids
和抗菌蛋白 PAF 可以引起构巢曲霉(Aspergillus
nidulans)出现凋亡样特征,如 DNA 降解、磷脂酰
丝氨酸外翻和活性氧累积[45,46]。 生物信息学研究
发现丝状真菌基因组(包括稻瘟病菌)具有 100 多
个程序性细胞死亡蛋白,其中有一些蛋白同源于哺
乳动物的程序性细胞死亡组份,但在酵母中不存
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摇 4 期 摇 摇 厉晓东,等:稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的凋亡诱导和检测
在;而目前这些基因的功能还未知[29]。
酵母和丝状真菌的凋亡表型类似于多细胞生
物,包括:DNA降解,磷脂酰丝氨酸外翻,细胞内活
性氧累积,染色体浓缩和边缘化[25]。 胞内 ROS 可
以通过 dihydrorhodamine 123、 dihydroethidium 或
DCFH鄄DA对菌丝或原生质体染色而进行检测。
染色体浓缩和边缘化也可以通过 DAPI 或 Hoechst
33258 对菌丝细胞和原生质体进行染色而检测。
试验中发现 ROS 染色剂能够轻易透过真菌细胞
壁;而染色体荧光染料的真菌细胞壁穿透性稍差一
点,细胞壁处往往残留强烈的荧光,影响细胞核的
荧光观察。 TUNEL检测和 Annexin V染色物质则
很难穿透稻瘟病菌细胞壁,在染色前必须除去细胞
壁。 制备真菌原生质体需要耗费数个小时和经过
多个步骤,如酶解、反复的离心和重悬浮过程。 这
些操作过程往往会造成原生质体的损坏,如碘化丙
锭染色发现有 40% ~ 50%的稻瘟病菌原生质体的
细胞膜破裂。 由于高渗透压也是诱导很多真核生
物发生凋亡的一种重要条件[47, 48],因而在原生质
制备过程中长达数小时的酶解阶段也有可能诱发
凋亡。 在诱导条件下一般只有部分细胞凋亡,因而
知道凋亡细胞的比例是必要的,流式细胞仪可能是
未来研究真菌细胞凋亡的首要手段。 而目前原生
质体制备过程中的细胞破裂影响流式细胞仪在真
菌细胞凋亡检测中的应用。 DNA ladder 检测和电
子显微镜观察也是多细胞生物凋亡研究的重要手
段。 尽管 DNA ladder是多细胞动物凋亡的一个重
要特征,酵母中还没有发现该现象[49],而丝状真菌
也仅发现构巢曲霉细胞凋亡时发生所谓大尺度
DNA断裂( large鄄scale DNA fragmentation) [50],即
DNA断裂成 20 kb 左右大小的片段,而不是数百
碱基大小的 DNA 小片段。 然而凋亡还可引起酵
母细胞核糖体 RNA 的特异性降解[51]。 经低浓度
的 H2O2 或高浓度的 NaCl 诱导后,稻瘟病菌细胞
显示出典型的凋亡特征,如 ROS累积、磷脂酰丝氨
酸从质膜内表面外翻到外表面,染色体浓缩和
DNA降解。 稻瘟病菌胞内 ROS 爆发也是其具有
致病性必需的[52]。 这些诱导的稻瘟病菌凋亡表型
以及稻瘟病菌基因组具有凋亡同源蛋白[29]说明凋
亡现象也存在于稻瘟病菌。
一个典型的稻瘟病菌孢子由 3 个细胞组成,一
般由其中 1 个细胞萌发、形成附着胞、然后穿透水
稻表皮,并形成侵染菌丝。 由 3 个细胞的孢子形成
2 个附着胞的情形比较少见,而一个附着胞的 3 个
细胞都形成附着胞的现象更是非常罕见。 这一现
象意味着在稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成过程
中发生了程序性细胞死亡现象。 细胞自噬在稻瘟
病菌的孢子萌发和附着胞形成过程中起了很重要
的作用[13,14],自噬缺陷的稻瘟病菌菌株缺乏足够
的膨压而不能侵入水稻表皮,然而自噬缺陷的菌株
的一个孢子中萌发的细胞数和形成的附着胞数目
与野生型没有差异[14,53]。 有意思的是 caspase 抑
制剂使同时由孢子的 2 个细胞或 3 个细胞萌发形
成芽管的比例大幅度增加,而且在孢子中形成附着
胞的细胞位置从由顶端细胞为主转变为以基部细
胞为主。 这说明 caspase依赖性的凋亡参与了稻瘟
病菌孢子萌发和附着胞形成过程。 虽然 caspase抑
制剂 Z鄄VAD鄄FMK 使 1 个孢子萌发形成的芽管数
目增加,但是最终形成的附着胞数目并没有增加。
这可能是因为 metacaspase 活性并没有被 Z鄄VAD鄄
FMK完全抑制,或者 caspase非依赖性的凋亡继续
发挥着作用[54],而且附着胞的形成受到许多外界
环境因子和细胞内信号传导系统的影响,而这些因
素不受 Z鄄VAD鄄FMK 的作用。 metacaspase 蛋白是
多种外界刺激诱导酵母凋亡所必需的。 吟Yca1 突
变体活性氧累积减少,对于氧化胁迫具有更高的抗
性,而 YCA1 的过表达对凋亡刺激更加敏感[31]。
烟曲霉(Aspergillus fumigatus)基因组中仅发现 2
个 metacaspase 蛋白,但双敲除突变体 (吟CasA /
吟CasB)仍具有 caspase 活性,这表明存在其他具
有 caspase活性蛋白酶[55]。 因此,关于凋亡在稻瘟
病菌的孢子萌发和附着胞形成中的作用和稻瘟病
菌的凋亡分子机制还需要更多的实验工作(如凋
亡基因的敲除或过表达等)来证实。
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