全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(５): ４９７￣５０３(２０１４)
收稿日期: ２０１４￣０１￣０６ꎻ 修回日期: ２０１４￣０６￣１５
基金项目: 国家重点基础研究发展计划( ２０１３ＣＢ１２７７００)ꎻ国家自然科学基金资助项目( ３１２７１９８５)ꎻ高等学校学科创新引智计划资助
(Ｂ０７０４９)
通讯作者: 胡小平ꎬ教授ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｘｐｈｕ＠ｎｗｓｕａｆ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 王军娟ꎬ女ꎬ陕西太白人ꎬ博士研究生ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｉｘｕａｎ１１３９＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.００７
温度与条锈病菌双胁迫下小麦内参基因的选择
王军娟ꎬ 陶 飞ꎬ 安 菲ꎬ 徐向明ꎬ 胡小平∗
(旱区作物逆境生物学国家重点实验室 /西北农林科技大学植物保护学院ꎬ杨凌 ７１２１００)
摘要:选择合适的内参基因是采用实时定量 ＰＣＲ研究基因表达获得可信数据的关键ꎮ 以小麦在条锈病菌及温度双因素胁
迫为研究对象ꎬ采用实时荧光定量 ＰＣＲ评价了 ＣＤＣ、ＲＬＩ、ＡＣＴＩＮ和 ２６Ｓ基因的表达情况ꎬ采用 ｇｅＮｏｒｍ和 ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ软件
进行了比较分析ꎮ 结果表明ꎬ小偃 ６号小麦在常温(１５℃±１℃)未接种条锈病菌ꎬ以及接种条锈病菌并培育至花斑期分别在
高温(２０℃±１℃)、变温(２０℃到 １５℃)条件处理中ꎬ基因 ＲＬＩ表达不稳定ꎬ基因 ＡＣＴＩＮ在常温条件下以及在条锈病菌及高温
处理条件下的表达量相对稳定ꎬ但在变温条件下波动较大ꎮ 表达最稳定的基因是 ２６Ｓꎬ其次是 ＣＤＣ基因ꎬ它们可以作为小
偃 ６号￣ＣＹＲ３２￣温度互作体系中基因表达实时荧光定量 ＰＣＲ研究的内参基因ꎬ２６Ｓ和 ＣＤＣ是最佳内参基因组合ꎮ
关键词:内参基因ꎻ 小麦ꎻ 条锈病菌ꎻ 温度ꎻ 实时荧光定量 ＰＣＲ
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒ￣
ｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ　 ＷＡＮＧ Ｊｕｎ￣ｊｕａｎꎬ ＴＡＯ Ｆｅｉꎬ ＡＮ Ｆｅｉꎬ ＸＵ Ｘｉａｎｇ￣ｍｉｎｇꎬ ＨＵ Ｘｉａｏ￣ｐｉｎｇ　 (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｓｔｒｅｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ａｒｉｄ Ａｒｅａꎬ Ｙａｎｇｌｉｎｇ ７１２１００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｔ ｉｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｐｒｏｐｅｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｔｔｉｎｇ ｖａｌｉｄ ｄａｔａ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ (ｑＲＴ￣ＰＣＲ) . Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＣＤＣ)ꎬ ＲＮａｓｅ Ｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
(ＲＬＩ)ꎬ ＡＴＰ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ (２６Ｓ) ａｎｄ ａｃｔｉｎ (ＡＣＴＩＮ) ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ
ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｄｕｒｉｎｇ ｗｈｅａｔ ｗａｓ ｓｔｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｒ / ａｎｄ Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉ￣
ｃｉ (ＰＳＴ) ｔｈｒｏｕｇｈ ｑＲＴ￣ＰＣＲ. Ｔｈｅ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ ｇｅＮｏｒｍ ａｎｄ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ＲＬＩ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｕｎｓｔｅａｄｉｌｙ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｘｉａｏｙａｎ６ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (１５℃±１℃)ꎬ ａｓ
ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｗｈｅａｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＳＴ ｔｒｅａｔｅｄ ａｔ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (２０℃±１℃) ａｎｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (ｆｒｏｍ
２０℃ ｔｏ １５℃) ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｙｍｐｔｏｍ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｇｅ. Ｇｅｎｅ ＡＣＴＩＮ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ａ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ａｔ ｎｏｒ￣
ｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎬ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＰＳＴ ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎬ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ. Ｔｈｅ ２６Ｓ
ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｕｎｄｅｒ ａｌｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ＣＤＣ ｇｅｎｅ. Ｂｏｔｈ ｏｆ ｔｈｅｍ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｅｒｖｅｄ ａｓ
ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｑＲＴ￣ＰＣＲ ｄａｔａ ｉｎ Ｘｉａｏｙａｎ６￣ＰＳＴ￣ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ.
Ｔｈｅｙ ｃｏｕｌｄ ａｌｓｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｇｅｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅꎻ ｗｈｅａｔꎻ Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉꎻ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎻ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４３５.１２１.４２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０４９７￣０７
　 　 实时定量 ＰＣＲ(ｑＲＴ￣ＰＣＲ)是研究基因表达广
泛应用的方法之一ꎮ 在相对定量中ꎬ由于起始
ＲＮＡ的质量和数量、ｃＤＮＡ 合成效率以及 ＰＣＲ 的
扩增效率ꎬ在不同处理样品间存在的差异可能导致
　
植物病理学报 ４４卷
结果产生偏差[１]ꎮ 为了得到更准确的数据ꎬ需用
内参基因对实时定量 ＰＣＲ 数据进行均一化处理ꎮ
常用的内参基因为持家基因 ( ｈｏｕｓｅ￣ｋｅｅｐｉｎｇ
ｇｅｎｅｓ)ꎬ如 １８Ｓ核糖体 ＲＮＡ(１８Ｓ ｒＲＮＡ)、肌动蛋白
基因(ＡＣＴＩＮ)、微管蛋白基因(ＴＵＢＬＩＮ)、３￣磷酸甘
油醛脱氢酶基因(ＧＡＰＤＨ)等ꎮ 但一些持家基因在
不同的试验条件下表达不稳定ꎬ不是通用内参基
因[２]ꎮ 因此ꎬ筛选特定实验体系下的内参基因对
于准确分析目的基因的表达非常重要ꎮ 筛选内参
基因的研究已有诸多报道ꎬ如马铃薯[３]、拟南
芥[４]、水稻[５]、大豆[６]、杨树[７]、番茄[８]、鳉鱼[９]和
人[１０]等ꎮ 小麦在不同发育阶段、不同组织[１１]以及
受不同生物[１２ꎬ１３]和非生物胁迫[１１]过程中ꎬ表达最
稳定的内参基因各不相同ꎮ 关于小麦在条锈病菌
(生物)和温度(非生物)双胁迫下内参基因的筛选
尚未见报道ꎮ 本研究以 ＣＤＣ(Ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｐｒｏｔｅｉｎ )、 ＲＬＩ ( ＲＮａｓｅ Ｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ )、
ＡＣＴＩＮ 和 ２６Ｓ ( ＡＴＰ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ)基因作为小麦候选内参基因ꎬ通
过实时荧光定量 ＰＣＲ 技术ꎬ对小麦受高温和条锈
病菌双胁迫不同阶段候选内参基因的转录水平进
行检测ꎬ采用 ｇｅＮｏｒｍ [１]和 ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ[１４]软件对
检测结果进行分析ꎬ以期筛选出小麦在温度及条锈
病菌双重胁迫下的最佳内参基因ꎮ
　 　 小麦品种常因条锈病菌生理小种毒性变异而
丧失抗病性ꎬ沦为感病品种ꎬ给小麦生产造成重大
损失[１５]ꎮ 因此ꎬ选育非小种专化的持久抗病性品
种已成为解决小种专化抗性丧失问题的重要途
径[１６ꎬ１７]ꎮ 科学研究和生产实践证明ꎬ小偃 ６ 号是
一种典型的高温诱导且无小种专化性的持久性抗
条锈病品种[１６]ꎬ研究其高温诱导抗条锈病的分子
机制对于抗病品种培育具有重要的意义ꎮ 本研究
确定的温度及条锈病菌双重胁迫下基因表达量研
究用的内参基因ꎬ将为高温抗病性分子机制研究奠
定基础ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 小麦条锈病菌 ＣＹＲ３２由西北农林科技大学植
物病理研究所提供ꎮ 小麦品种小偃 ６ 号(Ｔｒｉｔｉｃｕｍ
ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ)由西北农林科技大学农学院提供ꎮ
１.２　 接种方法
　 　 选取饱满的小偃 ６号小麦籽粒ꎬ播种于直径为
１０ ｃｍ的营养钵中ꎬ每钵播种 １０ 粒ꎬ待麦苗长至一
叶一心期时ꎬ采用涂抹法接种条锈病菌新鲜夏孢
子ꎬ以涂抹蒸馏水为对照ꎮ 接种后ꎬ将小麦置于温
度为 １２℃±１℃ꎬ相对湿度 ８０％的保湿桶中ꎬ黑暗保
湿 ２４ ｈꎬ转移至人工气候培养箱(Ｐｅｒｃｉｖａｌ Ｅ￣３０:温
度 １５℃±１℃ꎬ光周期 １６ / ８ ｈꎬ相对湿度 ６０％－８０％、
光强度 ８ ０００－１０ ０００ Ｌｘ)培养ꎮ
１.３　 温度￣单因素胁迫试验
　 　 幼苗一直在常温下培养ꎬ涂抹蒸馏水ꎬ不接种
条锈病菌ꎮ 从接种植株转入高温(２０℃±１℃)开始
计时ꎬ分别在 ２、２４和 １２０ ｈ 剪取各处理的第一叶ꎬ
每个时间点每个处理随机剪取 ３张叶片ꎬ液氮速冻
后ꎬ于－８０ ℃冰箱保存备用ꎮ
１.４　 温度￣条锈病菌双因素胁迫试验
　 　 待条锈病菌侵染进入潜育后期(即花斑期)ꎬ
对接种植株开始进行不同温度处理ꎬ即将接种幼苗
先转入高温(２０℃±１℃)培养 ２４ ｈꎬ再转常温(１５℃
±１℃)培养ꎮ
１.５　 总 ＲＮＡ提取及 ｃＤＮＡ合成
　 　 按照试剂盒 ＰｕｒｅＬｉｎｋ® Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ( Ｉｎ￣
ｖｉｔｒｏｇｅｎꎬ ＵＳ)的步骤提取小麦叶片总 ＲＮＡꎬ１％琼
脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 的完整性ꎬ测定 ＲＮＡ
的浓度和纯度 (ＮａｎｏＤｒｏｐ ＲＮＤ￣２０００ꎬ ＵＳ)ꎮ 用
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ® ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ(ＴａＫａＲａꎬ Ｊａｐａｎ)试剂
盒提供的方法将总 ＲＮＡ反转录成 ｃＤＮＡꎮ
１.６　 引物设计与合成
　 　 根据 ＮＣＢＩ 上的小麦特异性数据库(Ｔｒｉｔｉｃｕｍ
ａｅｓｔｉｖｕｍ ＵｎｉＧｅｎｅ)公布的 ｃＤＮＡ 序列ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ
５.０分别设计了 ＣＤＣ(细胞分裂控制蛋白)、ＲＬＩ(类
ＲＮＡ酶抑制蛋白)、ＡＣＴＩＮ(肌动蛋白)及 ２６Ｓ(依赖
ＡＴＰ２６ｓ蛋白酶体调节亚基)特异性引物(表 １)ꎮ 引
物由上海生工生物工程有限公司合成ꎮ 用超纯水溶
解引物至 １０ μｍｏｌ / Ｌꎬ置于－２０℃保存备用ꎮ
１.７　 实时荧光定量 ＰＣＲ
　 　 利用 ＵｌｔｒａＳＹＢＲ Ｍｉｘｔｕｒｅ (康为世纪ꎬ北京)试
剂盒进行实时荧光定量ＰＣＲꎮＰＣＲ反应体系总体
８９４
　
　 ５期 王军娟ꎬ等:温度与条锈病菌双胁迫下小麦内参基因的选择
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ
Ｇｅｎｅ Ｕｎｉｇｅｎｅ ｎｕｍｂｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′)
Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓｉｚｅ / ｂｐ
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ / ℃
ＡＣＴＩＮ Ｔａ５４８２５
ＡＣＣＴＴＣＡＧＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＴ
ＣＡＧＡＧＴＣＧＡＧＣＡＣＡＡＴＡＣＣＡＧＴＴＧ
１００ ６０
２６Ｓ Ｔａ２２８４５
ＧＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＴＧ
ＧＧＡＣＣＡＡＧＣＧＴＴＣＴＧＡＴＴＡＣＴＣ
２０２ ６０
ＣＤＣ Ｔａ５４２２７
ＣＡＡＡＴＡＣＧＣＣＡＴＣＡＧＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣ
ＣＧＣＴＧＣＣＧＡＡＡＣＣＡＣＧＡＧＡＣ
２２７ ６０
ＲＬＩ Ｔａ２７７６
ＣＧＡＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＴＡＴＴＧＴＴＧ
ＡＧＴＴＧＧＴＣＧＧＧＴＣＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＧ
２４２ ６０
　
积为 ２５ μＬꎬ包含 １２.５ μＬ ２×ＵｌｔｒａＳＹＢＲ Ｍｉｘｔｕｒｅꎬ
上下游引物(１０ μｍｏｌ / Ｌ)各 ０.８ μＬ、ｃＤＮＡ 模板
２.０ μＬ、无菌超纯水 ８.９ μＬꎮ ＰＣＲ 反应在 ｉＱＴＭ ５
(Ｂｉｏ￣Ｒａｄꎬ ＵＳ)上完成ꎮ ＰＣＲ 反应程序为:９５℃预
变性 １０ ｍｉｎꎻ９５℃变性 １５ ｓꎬ６０℃退火 ３０ ｓꎬ７２℃延
伸 ３０ ｓꎬ读板ꎻ４０ 次循环ꎮ 共有 ３ 次生物学重复ꎮ
每个基因的实时定量 ＰＣＲ扩增均以未加模板的为
对照ꎬ以检验扩增的背景ꎮ
１.８　 标准曲线构建和引物扩增效率验证
　 　 利用标准曲线对各引物的扩增效率进行检测ꎮ
用 ４个候选内参基因的引物对所有样品 ｃＤＮＡ的混
合物进行扩增ꎬ设置 ５个梯度ꎬ即用原混合ｃＤＮＡ的
５１、５２、５３、５４和 ５５倍稀释液作为标准品进行荧光定量
ＰＣＲ扩增ꎮ 引物扩增效率(Ｅ)与标准曲线的斜率
(ｓｌｏｐｅ)相关ꎬ根据标准曲线的斜率ꎬ由方程式:
Ｅ＝(１０－１ / ｓｌｏｐｅ－１)×１００ 计算得出引物的扩增效率ꎮ
扩增效率在 ９５％~１１０％的引物符合要求ꎮ
１.９　 基因表达水平测定
　 　 以各样品 ｃＤＮＡ 的 ５ 倍稀释液作为实时荧光
定量 ＰＣＲ的反应模板ꎬ利用候选内参基因引物对
其进行扩增ꎮ 采用比较 Ｃｑ 值法ꎬ计算不同基因在
所有样品中的表达量ꎮ 对于每个基因ꎬ将其在所有
样品中最低表达量定义为 １ꎮ
１.１０　 内参基因的选择
　 　 利用候选内参基因引物对所有样品进行扩增ꎮ
将 Ｃｑ 值导入到 Ｅｘｃｅｌ 表格中ꎬ对于每个基因ꎬ找出
所有样品中 Ｃｑ 值最小的样品ꎬ计算其他样品与该
样品的 ΔＣｑ 值ꎬ定义该样品的表达量为 １ꎬ则其他
样品相对表达量为 ２－ΔＣｑꎮ 采用 ｇｅＮｏｒｍ 软件
(ｈｔｔｐ: / / ｍｅｄｇｅｎ.ｕｇｅｎｔ.ｂｅ / ｇｅｎｏｒｍ / )计算各基因与
其他候选基因所得配对变异值的平均值 Ｍꎬ去掉
Ｍ值最大的一个基因ꎬ再重新计算剩余的各基因
的 Ｍ值ꎬ再去除 Ｍ值最大的基因ꎻ依此类推ꎬ直到
剩下最后 ２个最稳定的基因为止ꎬ即可得出最优的
内参基因组合ꎮ 在此基础上ꎬ利用 ｇｅＮｏｒｍ 软件计
算 ｎ(２≤ｎ≤７)个基因作为内参基因得出的标准化
因子与 ｎ＋１ 个基因作为内参基因得出的标准化因
子的配对变异值 Ｖｎ / ｎ＋１ꎮ Ｖｎ / ｎ＋１<０.１５ 为选择
阈值ꎬ即当 Ｖｎ / ｎ＋１<０.１５ 时ꎬｎ 个基因即可满足内
参基因的要求ꎬ而如果 Ｖｎ / ｎ＋１>０.１５ꎬ则表明 ｎ 个
基因不足以满足内参基因的要求ꎬ需要增加内参基
因的数目ꎮ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ 是 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ 的一个
加载项ꎬ它是通过综合计算内参基因在组内和不同
组间表达的稳定性ꎬ以筛选最佳内参基因ꎮ 该软件
通过生成基因表达稳定值 Ｍ 来筛选内参基因ꎬＭ
值越小ꎬ内参基因越稳定ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 引物扩增效率及特异性
　 　 使用 ＣＤＣ、 ２６Ｓ、 ＡＣＴＩＮ和 ＲＬＩ ４ 个持家基因
的引物ꎬ可分别从小麦 ｃＤＮＡ 中扩增出大小依次
为 ２２７、２０２、１００和 ２４２ ｂｐ的特异性条带(图 １)ꎮ利
用实时荧光定量 ＰＣＲ的标准曲线对各引物的扩增
效率检测结果表明ꎬ４ 对引物扩增效率均在 ９５％ ~
１１０％之间ꎬ线性相关系数范围为 ０.９８３－０.９９３ꎬ初
始 ｃＤＮＡ模板量与 Ｃｑ值有很好的线性关系ꎬ符合
内参基因的要求(表 ２)ꎮ
９９４
　
植物病理学报 ４４卷
２.２　 内参基因在不同样品中的表达分析
　 　 利用比较 Ｃｑ值法ꎬ分析了 ４ 个内参基因在不
同样品中的表达量(图 ２)ꎮ ＲＬＩ 基因的表达量变
化很大ꎮ 在接菌条件下ꎬＲＬＩ 基因的表达量在转入
高温(２０℃±１℃)第 ２ ｈ 达到最高ꎬ在第 ２４ ｈ 接近
于 ０ꎬ在常温不接菌条件下ꎬ其表达量在第 ２４ ｈ 达
到最高水平ꎮ ＡＣＴＩＮ 基因在常温不接菌(１５℃ ±
１℃)及接菌转入高温处理的前 ２ ｈ 表达量比较稳
定ꎬ但在后续接菌经高温及变温处理条件下ꎬ其表
达量波动较大ꎬ在转入常温后第 ９６ ｈ 升到最高ꎮ
ＣＤＣ和 ２６Ｓ基因在条锈病菌和温度双重胁迫下的
表达量比较稳定ꎬＣＤＣ的表达量基本保持在 ０.５２ꎬ
２６Ｓ的表达量基本保持在 ０.２５ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｆｏｕｒ ｇｅｎｅｓ
Ｍ: ５０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒꎬ Ｌａｎｅ １￣４:ＣＤＣꎬ ２６Ｓꎬ ＡＣＴＩＮꎬ ＲＬＩꎻ Ｌａｎｅ ５￣８: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＣＤＣꎬ ２６Ｓꎬ ＡＣＴＩＮꎬ ＲＬＩ.
Ｆｉｇ. ２　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ６ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ
Ｔｈｅ ｃ２ꎬ ｃ２４ꎬ ａｎｄ ｃ１２０ꎬ ｗｈｅａｔ ｌｅａｆ ｓａｍｐｌｅｓ ａｔ ２ ｈꎬ ２４ ｈꎬ １２０ ｈ ｔｒｅａｔｅｄ ａｔ ｎｏｒｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (１５℃±１℃) . Ｔｈｅ ｃｇ２ ａｎｄ ｃｇ２４ꎬ
ｗｈｅａｔ ｌｅａｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ａｔ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (２０℃±１℃) ｆｏｒ ２ ｈ ａｎｄ ２４ ｈ ｉｎ ｌａｔｅｎｔ ｓｔａｇｅꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｃｇ１２０ꎬ ｗｈｅａｔ
ｌｅａｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ａｔ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (２０℃±１℃) ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓ ｉｎ ｌａｔｅｎｔ ｓｔａｇｅꎬ ｔｈｅｎ ｓｈｉｆｔｅｄ ｉｎｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ９６ ｈ.
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｆｏｕｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ
Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｅｑｕａｔｉｏｎ Ｓｌｏｐｅ Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ / ％
Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ
ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ＣＤＣ ｙ＝－３.１６９ｘ＋２７.７６１ －３.１６９ １０６.８ ０.９８３
ＲＬＩ ｙ＝－３.１２５ｘ＋３０.１３９ －３.１２５ １０８.９ ０.９９１
２６Ｓ ｙ＝－３.２４１ｘ＋２９.３３７ －３.２４１ １０３.５ ０.９９３
ＡＣＴＩＮ ｙ＝－３.４４８ｘ＋３４.１９６ －３.４４８ ９５.０ ０.９８３
００５
　
　 ５期 王军娟ꎬ等:温度与条锈病菌双胁迫下小麦内参基因的选择
　
２.３　 内参基因表达稳定性评价
　 　 采用 ｇｅＮｏｒｍ 和 ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ 软件对候选内参
基因的相对表达量进行统计分析ꎮ 结果表明ꎬ基因
表达稳定度由高到低的顺序为 ２６Ｓ ＝ ＣＤＣ>ＲＬＩ>
ＡＣＴＩＮ(图 ３)ꎮ 同时ꎬ利用 ｇｅＮｏｒｍ 软件分析内参
基因的配对变异值 Ｖｎ / ｎ＋１ꎬ以确定在某种条件下所
需内参基因的最适数目ꎮ 本研究中 Ｖ２ / ３的值为
０.１３６ꎬ小于 ０.１５ꎬ而 Ｖ３ / ４的值为 ０.１８５ꎬ大于０.１５(图
４)ꎬ表明 ２ 个基因(ＣＤＣ 和 ２６Ｓ)足以作为标准化
指标ꎬ不需要引入第 ３ 个基因ꎮ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ 分析
结果表明ꎬ基因 ２６Ｓ 为最稳定的内参基因ꎬ其次是
ＣＤＣꎬ此结果与 ｇｅＮｏｒｍ软件分析的结果一致ꎮ 综
合以上 ２个软件的统计分析ꎬ最佳内参基因组合为
基因 ＣＤＣ和 ２６Ｓ(表 ３)ꎮ
Ｆｉｇ. ３ 　 Ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｒａｎｋｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ
Ｆｉｇ. ４　 Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｎｏｒ￣
ｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
３　 讨论
　 　 基于单因素胁迫下小麦内参基因的研究结
果[１１ ~ １３]ꎬ本研究筛选出了 ４ 个候选内参基因 ２６Ｓ、
ＣＤＣ、ＲＬＩ 及 ＡＣＴＩＮꎬ通过实时荧光定量 ＰＣＲ 方
法ꎬ比较分析了小麦品种小偃 ６ 号在常温(１５℃ ±
１℃)未接条锈病菌条件下处理的样品ꎬ以及在条
锈病菌侵染潜育后期经高温(２０℃ ±１℃ )及变温
(高温 ２０℃ ±１℃转常温 １５℃ ±１℃ )处理的样品
中ꎬ４ 个内参基因表达量的变化ꎮ 结果表明ꎬ基因
２６Ｓ是表达最稳定的内参基因ꎬ基因 ２６Ｓ 和 ＣＤＣ
是最佳内参基因组合ꎬ可以用于小偃 ６ 号￣条锈病
菌￣温度互作体系中基因表达实时荧光定量 ＰＣＲ
研究ꎮ
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｒａｎｋｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ＧｅＮｏｒｍ ａｎｄ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ
Ｒａｎｋ
ＧｅＮｏｒｍ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ
Ｇｅｎｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ / Ｍ Ｇｅｎｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ / Ｍ
１ ２６Ｓ ０.１２５ ２６Ｓ ０.３７２
２ ＣＤＣ ０.１２５ ＣＤＣ ０.６０２
３ ＲＬＩ ０.５３０ ＲＬＩ ０.６５４
４ ＡＣＴＩＮ ０.７３４ ＡＣＴＩＮ ０.９２７
Ｂｅｓｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ２６Ｓ / ＣＤＣ ２６Ｓ / ＣＤＣ
１０５
　
植物病理学报 ４４卷
　 　 实时荧光定量 ＰＣＲ的准确性和灵敏性需要特
定的 ＰＣＲ条件和合适的内参基因ꎮ 理想的内参基
因表达水平不受研究条件的影响ꎬ且可以在多种样
本间恒定表达ꎮ 研究表明ꎬ小麦经高温(３３℃)与
低温( ４℃)处理后表达量最稳定的内参基因是
ＡＣＴＩＮ和 ２６Ｓ [１１]ꎻ小麦受条锈病菌侵染后表达量
最稳定的内参基因是 ＣＤＣ 和 ＲＬＩ [１２]ꎮ 本研究结
果表明ꎬ小麦在高温和条锈病菌双因素共同作用
下ꎬ表达量最稳定的内参基因是 ２６Ｓ 和 ＣＤＣꎮ
ＡＣＴＩＮ基因表达量不稳定ꎬ在常温未接种条锈病菌
条件下的第 ２ ｈ 到 ２４ ｈꎬ它的表达量上升幅度最
大ꎬ在条锈病菌和高温双因素作用下的第 ２４ ｈꎬ它
的表达量降到最低ꎬ随后又在变温条件下ꎬ即第
１２０ ｈꎬ表达量恢复到较高水平ꎮ 在同样的处理条
件下ꎬ基因 ２６Ｓ 表达量相对稳定ꎬＡｌｉ￣Ｂｅｎａｌｉ 等[１８]
证明 ２６Ｓ基因在小麦种子发育及干旱、低温和高盐
等非生物胁迫下表达量保持不变ꎬ与本研究结果一
致ꎮ 基因 ＲＬＩ 表达量极不稳定ꎬ在单因素￣温度作
用下的 ２４ ｈ和温度￣条锈病菌双因素作用下的２ ｈꎬ
它的表达量出现高峰值ꎬ随后又在双因素作用下的
２４ ｈ表达量降到最低ꎬ在变温处理后ꎬ它的表达量
又有所回升ꎬ与 Ｓｃｈｏｌｔｚ 等[１２]研究条锈病菌单因素
胁迫小麦的结果不一致ꎬ可能是由于高温和条锈病
菌双因素共同影响了 ＲＬＩ 基因的表达ꎮ 由图 ２ 也
可以看出ꎬＡＣＴＩＮ 和 ＲＬＩ 基因表达丰度相对较高ꎬ
但不稳定ꎬ而 ＣＤＣ和 ２６Ｓ在单因素温度胁迫、温度
和条锈病菌双因素胁迫下ꎬ它们的表达量都比较稳
定ꎬ是研究小麦￣条锈病菌￣温度互作体系的最佳内
参基因ꎮ
　 　 本研究确定的 ＣＤＣ 和 ２６Ｓ 基因适合用作小
麦￣条锈病菌￣温度互作研究的内参基因ꎬ为高温诱
导的抗病基因表达差异研究奠定了基础ꎬ有助于高
温诱导的小麦抗条锈病基因的表达研究ꎮ 同时为
其他作物内参基因ꎬ特别是在多因素胁迫下内参基
因的选择提供了重要的参考ꎮ
参考文献
[１] 　 Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ Ｊꎬ Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒ Ｋꎬ Ｐａｔｔｙｎ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｃｃｕ￣
ｒａｔｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｄａ￣
ｔａ ｂｙ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ａｖｅｒａｇｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｅｎｅｓ [ Ｊ] . Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００２ꎬ ３(７): ｒｅｓｅａｒｃｈ
００３４.１－００３４.１１.
[２] 　 Ｒａｄｏｎｉｃ Ａꎬ Ｔｈｕｌｋｅ Ｓꎬ Ｍａｃｋａｙ Ｉ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ
ｔｏ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ＰＣＲ [ Ｊ ] . Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ ２００４ꎬ ３１３(４): ８５６－８６２.
[３] 　 Ｎｉｃｏｔ Ｎꎬ Ｈａｕｓｍａｎ Ｊ Ｆꎬ Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｈｏｕｓｅ￣
ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｎｏｒｍａｌｉ￣
ｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ｄｕｒｉｎｇ ｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ [ Ｊ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙꎬ ２００５ꎬ ５６ ( ４２１ ):
２９０７－２９１４.
[４] 　 Ｈｏｎｇ Ｓ Ｍꎬ Ｂａｈｎ Ｓ Ｃꎬ Ａｒａｍ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ａ ｓｔａｒｔｉｎｇ
ｐｏｏｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ [ Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１０ꎬ ５１ ( １０): １６９４ －
１７０６.
[５] 　 Ｋｉｍ Ｂ Ｒꎬ Ｎａｍ Ｈ Ｙꎬ Ｋｉｍ Ｓ Ｕꎬ ｅｔ ａｌ. Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ￣ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｈｏｕｓｅ￣
ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｒｉｃｅ [ Ｊ ] . Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓꎬ
２００３ꎬ ２５(２１): １８６９－１８７２.
[６] 　 Ｈｕ Ｒꎬ Ｆａｎ Ｃ Ｍꎬ Ｌｉ Ｈ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ
ｓｏｙｂｅａｎ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ [ Ｊ] . ＢＭＣ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ １０(１): ９３－１０４.
[７] 　 Ｂｒｕｎｎｅｒ Ａ Ｍꎬ Ｙａｋｏｖｌｅｖ Ｉ Ａꎬ Ｓｔｒａｕｓｓ Ｓ Ｈ. Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ
ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｓｔｕｄｉｅｓ [Ｊ] . ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ １３４(１): ２２４
－２３６.
[８] 　 Ｌøｖｄａｌ Ｔꎬ Ｌｉｌｌｏ Ｃ. Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉ￣
ｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ
ｔｏ ｎｉｔｒｏｇｅｎꎬ ｃｏｌｄꎬ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ [ Ｊ] . Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ ２００９ꎬ ３８７(２): ２３８－２４２.
[９] 　 Ｚｈａｎｇ Ｚ Ｂꎬ Ｈｕ Ｊ Ｙ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ
Ｍｅｄａｋａ (Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ) ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｓｒｕｐ￣
ｔｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ [ Ｊ ] .
Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ ２００７ꎬ ９５(２): ３５６－３６８.
[１０] Ｃｉｃｉｎｎａｔｉ Ｖ Ｒꎬ Ｓｈｅｎ Ｑ Ｌꎬ Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｓ Ｇ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓ￣
ｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｕｓｉｎｇ
ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ [ Ｊ ] . ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒꎬ
２００８ꎬ ８: ３５０－３６１.
[１１] Ｐａｏｌａｃｃｉ Ａ Ｒꎬ Ｔａｎｚａｒｅｌｌａ Ｏ Ａꎬ Ｐｏｒｃｅｄｄｕ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ
２０５
　
　 ５期 王军娟ꎬ等:温度与条锈病菌双胁迫下小麦内参基因的选择
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｗｈｅａｔ [Ｊ] . ＢＭＣ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ １０: １１－３７.
[１２] Ｓｃｈｏｌｔｚ Ｊ Ｊꎬ Ｖｉｓｓｅｒ Ｂ. Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ
ｑＰＣＲ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｕｓｔ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｈｅａｔ
[ Ｊ ] . Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ
２０１３ꎬ ８１: ２２－２５.
[１３] Ｊａｒｏšｏｖǎ Ｊꎬ Ｋｕｎｄｕ Ｊ Ｋ. Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ
ａｓ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｅｒｅ￣
ａｌｓ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ [ Ｊ] . ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ
Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１０ꎬ １０: １４６－１５４.
[１４] Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｃ Ｌꎬ Ｊｅｎｓｅｎ Ｊ Ｌꎬ Ｏｒｎｔｏｆｔ Ｔ Ｆ. Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ￣ＰＣＲ
ｄａｔａ: ａ ｍｏｄｅｌ￣ｂａｓｅｄ ｖａｒｉａｎｃｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｇｅｎｅｓ ｓｕｉｔｅｄ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎꎬ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｂｌａｄ￣
ｄｅｒ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｄａｔａ ｓｅｔｓ [ Ｊ] . Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ
２００４ꎬ ６４(１５): ５２４５－５２５０.
[１５] Ｌｉ Ｚ Ｑꎬ Ｚｅｎｇ Ｓ Ｍ. Ｗｈｅａｔ ｒｕｓｔ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｍ] . Ｂｅｉｊｉｎｇ: Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｅｓｓ (北京: 中国
农业出版社)ꎬ ２００２. ３２０－３２１.
[１６] Ｓｈａｎｇ Ｈ Ｓ. Ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｔｏ
ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ) [ Ｊ ] . Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
Ｓｉｎｉｃａ (中国农业科学)ꎬ １９９８ꎬ ３１(４): ４６－５０.
[１７] Ｃｈｅｎ Ｘ Ｍ. Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ
Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ. ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ ｏｎ ｗｈｅａｔ [ Ｊ] . Ｃａｎａ￣
ｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００５ꎬ ２７(３): ３１４－
３３７.
[１８] Ａｌｉ￣Ｂｅｎａｌｉ Ｍ Ａꎬ Ａｌａｒｙ Ｒꎬ Ｊｏｕｄｒｉｅｒ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｍｐａｒａ￣
ｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｖｅ Ｌｅａ ｇｅｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ
ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ [Ｊ] . Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ￣
ｉｃａ Ａｃｔａꎬ ２００５ꎬ １７３０(１): ５６－６５.
责任编辑:于金枝　
　 　
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