全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(5): 556-560(2013)
收稿日期: 2012-08-15; 修回日期: 2013-07-02
基金项目: 国家自然科学基金(31101411);江苏省农业科技自主创新基金(CX(12)5045);转基因抗大豆花叶病毒病高蛋白大豆新品种
的培育(2010ZX08004-004-004)
通讯作者: 陈 新,研究员,主要从事豆类病害和豆类育种的研究; Tel:025-84391362, E-mail: cx@ jaas. ac. cn
智海剑,教授,主要从事大豆花叶病毒的研究; Tel:025-84396463, E-mail: zhj@njau. edu. cn。
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췍研究简报
大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母
双杂交的大豆 cDNA文库构建
崔晓艳1, 陈 新1*, 栾鹤翔2, 智海剑2*
( 1江苏省农业科学院蔬菜研究所, 南京 210014; 2 南京农业大学农学院, 南京 210095)
Construction of Soybean mosaic virus -induced soybean cDNA library for mem-
brane-based yeast two-hybrid system 　 CUI Xiao-yan1, CHEN Xin1, LUAN He-xiang2, ZHI
Hai-jian2 　 ( 1 Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2 College of
Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing, 210095, China)
Abstract: Membrane-baesd yeast two-hybrid system is an effective method for research on interaction between
Soybean mosaic virus-encoded membrane-associated proteins and host factors, while the Gateway technology
without the use of restriction enzyme cloning techniques is easier for construction of virus-induced host cDNA li-
brary. In this study, both membrane-based yeast two-hybrid system and GatewayTM systems were used. With
TRIZOL regent, total RNA was extracted from soybean leaves infected with soybean mosaic virus. SMV-in-
duced soybean primary cDNA library constructed by Gateway technology was recombined into a reconstructed
prey vector for membrane-based yeast two-hybrid system. The capacity and quality tests showed that the library
titer was 1. 7 × 106cfu / mL and the length of inserted cDNA fragments ranged from 0. 5 to 2 kb. It is available
for research on interaction between the virus-encoded membrane protein and host.
Key words: Soybean mosaic virus ( SMV); cDNA library; Membrane-based yeast two-hybrid system
(MbY2H); Gateway technology
文章编号: 0412-0914(2013)05-0556-05
　 　 前言 大豆花叶病毒 ( Soybean mosaic virus,
SMV)是大豆上最普遍的病害之一,严重影响大豆
的产量和品质,通过筛选与病毒互作的寄主蛋白,
根据互作蛋白的功能和两者的作用机制可揭示病
毒侵染的分子机制。 对于病毒编码的膜蛋白或者
膜相关特性的蛋白,由于具有膜结合特性,在生物
体内的互作多发生在膜上。 传统的酵母双杂交系
统发生在核内,试剂盒的载体上加了核定位信号
肽,可以把基因都锚定到酵母核内;这与细胞内自
然状态下的互作情况是有差异的,而且翻译后修饰
过程等都无法完成。 目前已经有专门适用于膜蛋
白的泛素酵母双杂交系统[1],直接在膜系统上发
生互作,解决了这些难题。
由于膜蛋白酵母双杂交系统必须购买对应的
文库或定制,成本较高,且程序复杂。 而已经商业
化的美国 Invitrogen 公司开发的 Gateway 技术可
　
　 5 期 崔晓艳,等:大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆 cDNA文库构建
将 cDNA 片段定向且快速转移至各种目的载体
上,大大提高单次构建文库的利用率;且在后续的
目的基因研究工作中可直接通过 BP 和 LR 双向反
应进行载体构建,无需 PCR 与重复测序过程,明显
提高后续研究工作效率[2]。 因此我们将膜蛋白酵
母双杂交系统与 GatewayTM 系统相融合,利用
Gateway高效文库构建系统构建大豆花叶病毒诱
导的大豆叶片初级 cDNA 文库,然后将初级文库
重组到泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统载体上,
为从中筛选与 SMV 编码的膜蛋白相互作用的寄
主因子奠定了基础。
1　 材料与方法
1. 1　 材料及试剂
本实验所用菌株 DH10B、DH5α,载体 pPR3-
N、pDEST22 为江苏省农科院蔬菜所实验室保存,
大豆品种南农 1138-2 和 SMV 强毒株系 SC15 由南
京农业大学大豆改良中心提供,菌株 ccdB survival
strain、CloneMiner文库构建试剂盒等购自 Invitro-
gen 公司,其他常规酶、培养基、生化试剂等购自大
连 TaKaRa 公司。 引物合成及测序由 Invitrogen 公
司完成。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 Total RNA的提取及 mRNA的分离　 鉴于
所构建文库主要用于大豆对大豆花叶病毒侵染反
应分子机制研究,取 SMV 侵染发病的大豆叶片,
参照 Trizol 操作说明书提取总 RNA,用 RNase-free
H2O 溶解并检测质量。 参照 FastTrack ® 2. 0 Kit
说明书分离 mRNA。
1. 2. 2　 cDNA初级文库的构建及质量鉴定　 取上
步骤中得到的 mRNA 3 μg,参照 CloneMiner 文库
构建说明书进行 cDNA 第一链的合成及 ds cDNA
的合成,然后将 ds cDNA与三框 attB1 重组接头连
接并用色谱柱分级法进行片段分级及收集,再将含
attB1 接头的 cDNA文库通过 BP 反应构建到入门
载体 pDONR222 上,最后导入大肠杆菌 DH10B 宿
主细胞中,得到文库菌液。 进行初级文库质量鉴
定。
(1)库容量的鉴定 取转化后细菌原液(1 mL)
10 μL 稀释 1 000 倍后,从中取出 50 μL 涂布 LB
平板,第二天计数。 总克隆数 CFU = 平板上的克
隆数 / 50 μL ×1 000 倍 ×1 ×103 μL。
(2) 重组率和插入片段长度鉴定 随机挑取 32
个克隆进行菌落 PCR 鉴定(M13 引物),电泳鉴定
插入片段大小及多态性,分析文库的重组率。
1. 2. 3 　 猎物载体 pPR3-gateway 的构建 　 设计引
物扩增 pDEST22 上 attR1 与 attR2 之间的序列,引
物 5′端带 Sfi Ⅰ酶切位点(根据载体 pPR3-N 上两
个中间序列不同的 SfiⅠ,分别命名为 SfiA 和
SfiB)
attR1sfiA: 5′-agtggccattacggccACAAGTTTG-
TACAAAAAAGCTGAACGAGAAACG-3′
attR2sfiB: 5′-agaggccgaggcggccACCACTTTG-
TACAAGAAAGCTGAACGA-3′
将 Sfi Ⅰ分别酶切 pPR3-N和以上引物所扩得
的 PCR产物( attR1-Cmr-ccdB-attR2),进行连接反
应,构建好的载体 pPR3-gateway转化 ccdB survival
strain 感受态细胞,用引物 pPR3-NF ( 5′-GTCG-
AAAATTCAAGACAAGG-3′) 和 pPR3-NR ( 5′-
AAGCGTGACATAACTAATTAC-3′)测序鉴定插
入片段序列的正确性。 将载体分别转化菌液
(ccdB survival strain)和 DH5α 感受态细胞,根据
菌落是否长出判断插入片段是否正常表达。
1. 2. 4　 酵母双杂交 cDNA文库的构建　 将上步验
证合格的初级文库,采用肉汤培养基扩大培养,提
取入门文库质粒。 将入门文库质粒稀释到 300 ng /
μL,与构建好的目的载体 pPR3-gateway 进行 LR
重组反应并电转化 DH10B 感受态细胞,得到酵母
文库菌液。 评价目的文库质量(方法同 1. 2. 2),
PCR 鉴定引物为: pPR3-NF,pPR3-NR。
2　 结果与分析
2. 1　 大豆叶片总 RNA 的提取及mRNA的分离
经测定,大豆叶片总 RNA OD260 / OD280 =
1． 87,OD260 / OD230 = 2. 50,浓度为:2 μg / μL,结果
表明 RNA的纯度较高,蛋白、盐分已去除。 从 1%
琼脂糖凝胶电泳结果看,28S 和 18S 两条 RNA 条
带清晰(图 1A),表明提取的总 RNA 完整性较好。
总 RNA 经 mRNA 纯化后,电泳图呈弥散状,可以
用于文库构建(图 1B)。
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植物病理学报 43 卷
Fig. 1　 Total RNA and mRNA analyzed on 1% agarose gel
A: Total RNA; B: mRNA; M: 1 kb DNA ladder.
2. 2　 初级 cDNA文库的构建及质量鉴定
经检测,初级 cDNA 文库滴度为 6. 84 × 106
cfu / mL。 随机挑取 32 个克隆进行 PCR 鉴定,结
果表明文库重组率为 96% ,插入片段大小范围为
0. 5 ~ 2. 0 kb,平均片段大小为 1 kb(图 2),表明大
豆叶片初级 cDNA 文库质量较高。
2. 3　 猎物载体 pPR3-Gateway 的构建
pPR3-N载体经 Sfi Ⅰ双酶切得到 6 kb 产物,
PCR扩增得到 pDEST22 上 attR1 与 attR2 之间的
片段 1. 8 kb,电泳检测片段大小均符合(图 3)。
将从 pDEST22 上扩增得到的片断(含 Gate-
way ccdB 致死基因及氯霉素抗性位点),经 Sfi Ⅰ
酶切,连接到 pPR3-N 的 2 个 Sfi Ⅰ酶切位点中间
(图 4),构建得到载体 pPR3-Gateway。 该载体经
测序表明含有 SfiA、attR1 site和 SfiB、attR2 site,序
列结果符合设计;且转化 DH5α感受态细胞无转化
子生长,表明 ccdB 致死基因起了作用;在正确克
隆菌液(ccdB survival strain)能在含氯霉素(Cm)
的培养基上生长,表明载体构建成功。
2. 4　 酵母双杂文库质量鉴定
根据在 SD / -trp 稀释平板上重组子的数目
(图 5),文库滴度 = 平板上的克隆数 / 0. 5 μL ×
1 000倍 = 850 / 0. 5 μL × 1 000 倍 = 1. 7 × 106 cfu /
mL,插入的 cDNA片段大小在 0. 5 ~ 2. 0 kb 之间,
平均片段大小为 1 kb(图 6),重组率为 94% 。 说
明本研究所构建的目的 cDNA 文库是一个高质量
目的文库,文库中 cDNA 片段大小适合直接应用
于后续的膜蛋白酵母双杂交筛选。
Fig. 2　 PCR detection of insert from primary cDNA Library
M: 1 kb DNA ladder; Lane 1 -16: inserted cDNA fragments.
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　 5 期 崔晓艳,等:大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆 cDNA文库构建
Fig. 3　 Digestion products of pPR3-N and PCR product of the insert
M: 1 kb DNA ladder; Lane 1-2: Digestion products of pPR3-N; Lane 3-4: PCR product of the inserted size.
Fig. 4　 Strategies of construction of the prey vector pPR3-Gateway vector
Fig. 5　 Determination titer of the library
The dilution ladder was 1:100, 50 μL bacterial, 850 clones.
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植物病理学报 43 卷
Fig. 6　 PCR detection o f insert from cDNA library for yeast two hybrid
M: 1 kb DNA ladder; Lane 1-16: inserted cDNA fragments.
3　 讨论
膜相关蛋白约占细胞总蛋白质中的 1 / 3,它们
大都参与了细胞的诸多生理、病理过程和抗病反应
机理。 研究膜蛋白的相互作用对于揭示细胞的生
命活动规律及寻找作用靶标都有重要的意义。 植
物病毒的生命过程涉及到生物体内膜系统的参与,
如内质网膜、叶绿体膜、胞间连丝等,病毒诱导的内
膜系统的改变帮助病毒完成复制、细胞间运动等生
命活动。 本研究涉及的大豆花叶病毒编码的 6K2、
P3、P3-PIPO蛋白均含有一到两个疏水区,属于膜
相关蛋白,因此若研究这些病毒编码蛋白与寄主的
互作机制,哪些寄主因子与病毒蛋白互作参与了病
毒的侵染,利用膜蛋白酵母双杂交系统是最为有效
的方法。 通过研究病毒编码的膜蛋白与寄主的互
作关系,将有助于我们深入理解 SMV 与寄主互作
机理,逐渐阐明了 SMV 病毒的侵染、复制和传播
机理。
参考文献
[1] 　 Snider J, Kittanakom S, Curak J, et al. Split-ubiquitin
based membrane yeast two-hybrid (MYTH) system: a
powerful tool for identifying protein-protein interactions
[J] . Journal of Visualized Experiments, 2010, 36.
pii: 1698. doi: 10. 3791 / 1698.
[2] 　 Qiu A L, Liu L L, Cai H Y, et al. Construction of a
cDNA Library of Pepper for Yeast Two-hybrid Analy-
sis Using Gateway Technology ( in Chinese) [J] . Ac-
ta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis (江西农业大
学学报), 2010, 32(4) : 0791 -0796.
责任编辑:张宗英
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