全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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,
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收稿日期$
!"#$)"*)"(
&修改稿收到日期$
!"#$)"0)#1
基金项目$
1*%
计划"
!"##22#""!"1
#&云南省应用基础研究计划"
!"#!34#10
!
"#!35"&!
#&云南省科技计划"
!"#!44"##
#&国家观赏园艺
工程技术研究中心"
!"#!36#!(7#"
#&云南省农业科学院创新团队"
8229!"#$:5""!
#
作者简介$杨嫦丽"
#011
#!女!在读硕士研究生!主要从事花卉分子育种研究
;)<=->
$
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@>
(
ABC=<#!%
!
#*%+@D<
"
通信作者$马璐琳!博士!副研究员!主要从事花卉遗传育种及植物分子生物学
;)<=->
$
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!
.DFE+@D<
镰刀菌诱导的泸定百合
$$%
文库
构建及抗病相关基因筛选
杨嫦丽#!!王有国#!王祥宁!!张艺萍!!崔光芬!!
段
!
青!!贾文杰!!杜文文!!马璐琳!"
"
#
云南农业大学!昆明
*("!"#
&
!
云南省农业科学院花卉研究所%云南省花卉育种重点实验室!昆明
*("!"(
#
摘
!
要$该研究以泸定百合"
!"#"$%&(
)
*+,"* G->.D/
#为材料!构建其组培苗经百合尖孢镰刀菌侵染后的叶片
99H
文库!从中筛选镰刀菌枯萎病抗病相关基因从正向
99H
文库中随机挑取
%""
个单克隆测序后得到
!1"
条
;9:.
!进行功能比对分析后!除去未知功能)沉冗蛋白以及无同源序列!得到有功能的
;9:.
共
#*1
条!其功能涉及
信号传导)蛋白质合成与代谢)抗病与防御)物质与能量代谢)转录相关等多种途径!其中有
%#
条
;9:.
与抗病防御
相关从抗病防御相关基因中选取
1
条
;9:.
$过氧化氢酶)
2:I
结合盒转运蛋白"
24JKB=/.
L
DBKCB
#)
ME/-KN
型胰
蛋白酶抑制剂
$
"
ME/-KNKB
?L
.-/-/F-O-KDB$
#)丝氨酸乙醛酸氨基转移酶)多聚泛素)脂氧合酶
P
"
Q-
L
DR
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C/=.CP
#)丝
氨酸%苏安酸蛋白激酶"
9CB-/C
%
:FBCD/-/C)
L
BDKC-/T-/=.C
#)抗坏血酸过氧化物酶"
-(."/0
1
&"&,2#"+
#!通过
U:)
IJU
对其表达情况进行分析!发现经镰刀菌诱导后均为上调表达!推测它们可能参与了泸定百合镰刀菌枯萎病的
抗病反应途径
关键词$泸定百合&镰刀菌枯萎病&
99H
文库&抗病基因
中图分类号$
V&10
文献标志码$
2
&"()*+,)#""-1-*-234$(
5
)/#-$)$$%.#/*0*
1
2!+,3!/
1
624$(-23&7
8
4
9
&(230!$,*33#
4
"-)5363(#()0,36370)3!833(
82WXJF=/
S
>-
#
!
!
G2WX8DE
S
ED
#
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G2WX7-=/
S
/-/
S
!
!
YH2WX8-
L
-/
S
!
!
J6PXE=/
S
ZC/
!
!
562WV-/
S
!
!
[P2 GC/
,
-C
!
!
56 GC/\C/
!
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!
"
"
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DZ2
S
B-@E>KEB=>9@-C/@C
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ME/<-/
S
*("!"(
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JF-/=
#
9/()*0,)
$
P/DBACBKD.@BCC/-/
S
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S
C/C.=
S
=-/.KQ->
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!
\C@D/.KBE@)
KCA=.E
LL
BC..-D/.EOKB=@K-^CF
?
OB-A-N=K-D/
"
99H
#
@5W2>-OB=B
?
ZBD<>C=^C.DZK-..EC)@E>KEBC.CCA>-/
S
DZ
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5
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1
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L
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\CBC
L
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_
EC/@CA
!
=/AKFC/!1"
_
E=>-Z-CA.C
_
EC/@CK=
S
.
"
;9:.
#
\CBCDOK=-/CA+
2ZKCBZE/@K-D/=>=//DK=K-D/
!
#*1;9:.\CBCZDE/A
L
EK=K-^C>
?
C/@DA-/
S
ZE/@K-D/=>
?
T/D\/
L
BDKC-/+:FC
ZE/@K-D/)T/D\/;9:.BC>=KCAKD.-
S
/=>KB=/.AE@K-D/
!
L
BDKC-/.
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/KFC.-.=/AKB=/.
L
DBKCB.
!
A-.C=.CBC.-.K=/@C
=/AACZC/.C
!
C/CB
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L
K-D/
!
CK@+2S
KFC<
!
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L
D/.C
S
C/C.
!
=/A1ACZC/.CBC.
L
D/.C;9:.
"
J=K=>=.C
!
24JKB=/.
L
DBKCB
!
ME/-KNKB
?L
.-/-/F-O-KDB$
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9CB-/C)
S
>
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DR
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>=KC=<-/DKB=/.ZCB=.C
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EO-
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L
DR
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C/=.CP
!
9CB-/C
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KFBCD/-/C)
L
BDKC-/T-/=.C
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1
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+
#
\CBC=/=>
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NCAO
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KFC.C<-)
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KFCBC.E>K..FD\CAKFC
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S
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37046
5
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1
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D.CAKD-/^D>^CA-/KFCA-.C=.CBC.-.K=/@CBC=@K-D/ZDBQ->
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1
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99H>-OB=B
?
&
BC.-.K=/@CBC>=KC
S
C/C.
!!
百合"
!"#"$%.
LL
+
#为百合科"
Q->-=@@=C
#百合
属"
!"#"$%
#多年生球根花卉!花姿优美!色彩艳丽!
深受人们喜爱百合既能作切花)盆花!又能在园林
绿地中应用!在全球花卉产品中的产值占到第三位!
在中国已居于第一位近年来!百合切花的销售量
在国际)国内花卉市场上都名列前茅!市场需求量已
跃居世界五大切花之列然而随着百合种植面积的
不断扩大!百合病害也日益严重!造成百合切花和种
球的产量)品质下降
由百合尖孢镰刀菌"
3$&("$%04
5
&
1
0($%Z+
.
L
+#"#""
#引起的百合镰刀菌枯萎病是目前百合生产
中危害最为严重的病害百合镰刀菌枯萎病"
Q->
?
3$&("$% G->K
#又称百合根腐病)茎腐病!该病不
仅会造成百合切花产量下降!品质降低!还可侵染百
合鳞茎基部!造成基盘坏死!鳞片腐烂)散落!种球质
量下降!而镰刀菌是一种在许多作物上引起严重病
害的土传真菌!很难进行有效控制利用抗镰刀菌
枯萎病百合种质资源!筛选发掘抗病基因!培育抗病
品种是防治百合镰刀菌枯萎病最经济有效的方
法*#+目前百合目标基因克隆及利用的研究多见于
其观赏性状以及无症病毒等方面*!)1+在百合抗镰
刀菌枯萎病研究方面!
9KB==KFDZ
等*0+运用
U2I5
分
子标记对亚洲百合杂种系的镰刀菌抗性进行了遗传
分析!筛选出
%
个与镰刀菌抗性显著相关的标记
9F=F-/
等*#"+运用
%
种不同的分子标记系统"
52B:
)
23QI
和
W49
L
BDZ->-/
S
#构建了亚洲百合回交群体
的遗传图谱!并将
$
个抗镰刀菌
V:Q
位点进行了
定位马璐琳等*#+通过构建并筛选
99H
文库!从大
花卷丹中筛选到
$
个镰刀菌诱导后上调表达的抗病
相关基因同样!
U=D
等*##+在镰刀菌诱导的闽江百
合
99H
文库中也筛选到一批抗病相关基因
泸定百合"
!"#"$%&(
)
*+,"*G->.D/
#为中国特
有!花型优美!花色洁白并具芳香!适应性好!对百合
镰刀菌枯萎病有较强的抗性*#!+泸定百合是非常
好的野生鲜切花材料!也是现代百合品种"如喇叭百
合系和
:`
杂种系#重要育种亲本以及优良基因供
体材料*#%)#1+
抑制差减杂交"
.E
LL
BC..-D/.EOKB=@K-^CF
?
OB-A)
-N=K-D/
!
99H
#技术是由
5-=K@FC/TD
等建立的减法
分离差异表达基因的方法该技术具有假阳性率低
的突出优点!现已广泛应用于差异表达基因的筛选
克隆等研究方面!目前在棉花)马铃薯)小麦)玉米)
水稻)拟南芥等多种植物上得到了很好的应用*#0)!!+
在百合上!马璐琳等*#+和
U=D
等*##+将该技术分别用
于镰刀菌诱导的大花卷丹百合和岷江百合
99H
文
库构建中本研究针对泸定百合的镰刀菌抗性性
状!构建泸定百合经镰刀菌诱导的
99H
文库!通过
筛选文库来分离候选功能基因!对候选基因进行
U:)IJU
表达分析!这将为百合镰刀菌抗病育种分
子育种提供一定研究基础!对培育中国生产上急需
的具有良好抗病性的自主知识产权优良品种具有一
定实际应用价值和理论意义
#
!
材料和方法
<+<
!
实验材料及处理
野生泸定百合由云南省农业科学院花卉研究所
球宿根花卉中心收集保存并组培扩繁百合尖孢镰
刀菌病原菌为田间百合枯萎病植株上分离得到的尖
孢镰刀菌致病菌株
3D>!
?
.@
菌株!由农业部花卉产
品质量监督检验测试中心"昆明#分离纯化!于马铃
薯葡萄糖琼脂培养基"
I92
#上保存待用
泸定百合组培生根苗在
!(a
)
#"F
光照%
#$F
暗培养条件下培养
!"A
!选取植株高度)叶片数和大
小基本一致的组培生根苗!经百合尖孢镰刀菌"孢子
悬浮液#诱导做为处理组!以无菌水处理做为对照组
"菌液诱导和水处理时间段均分别为
"
)
*
)
#!
)
!$
)
$1
和
&!F
#!剪取材料叶片于液氮中速冻后!置于
1"
a
冰箱保存备用
<=>
!
百合尖孢镰刀菌诱导的
$$%
文库构建
UW2
L
>=/K
植物
UW2
提取试剂盒购自北京天
为时代科技有限公司!
9E
L
CB9]2U:
:]
IJU@5)
W29
?
/KFC.-.M-K
)
IJU)9C>C@K@5W2 9EOKB=@K-D/
M-K
)
2A^=/K=
S
C!ID>
?
购自
J>D/KC@F
公司"
2#!
VP2
_
E-@TIJUIEB-Z-@=K-D/M-K
购
自
V-=
S
C/
公司"
XCB<=/
?
#!
5Q!"""5W2<=BTCB
)
2]b
反转录酶)
8
9
酶)
AW:I
)
L
]5)#1):
载体购
自
:=M=U=
公司"
[=
L
=/
#
取经百合尖孢镰刀菌诱导
*
)
#!
)
!$
和
$1F
后
#&#!
##
期
!!!!!!!!!!
杨嫦丽!等$镰刀菌诱导的泸定百合
99H
文库构建及抗病相关基因筛选
的泸定百合组培苗叶片!提取其总
UW2
构建
99H
文库百合叶片总
UW2
提取按照
UW2
L
>=/K
植物
UW2
提取试剂盒"购自北京天为时代科技有限公
司#说明书进行!提取的各时段总
UW2
经琼脂糖凝
胶电泳检测后进行下一步
99H
文库的构建工作
双链
@5W2
合成参照
9E
L
CB9]2U:
:]
IJU@5W2
9
?
/KFC.-.M-K
"
J>D/KC@F
公司#说明书完成!然后按
照
IJU)9C>C@K@5W29EOKB=@K-D/M-K
"
J>D/KC@F
公
司#说明书进行抑制消减杂交两次差减
IJU
扩增
产物按照
VP2
_
E-@TIJUIEB-Z-@=K-D/M-K
"
V-=
S
C/
公司#说明书进行纯化回收!回收产物与
L
]5#1):
连接后转化大肠杆菌感受态宿主菌!培养过夜后挑
取白色单克隆菌落扩大培养并制备甘油菌于
1"
a
保存从正向
99H
文库随机挑取
%""
个单克隆
扩大培养后作为扩增模板进行
IJU
扩增!对插入目
标基因片段大小进行鉴定!扩增产物进行琼脂糖凝
胶电泳检测后送交上海欧易生物科技有限公司进行
测序!对测序结果在
WJ4P
"
FKK
L
$%%
\\\+/@O-+
/><+/-F+
S
D^
%
4Q29:
#上进行比对分析!并进行功
能注释和归类
<=?
!
抗病相关基因半定量
6@AB&6
表达分析
5Q!"""5W2 <=BTCB
)
2]b
反转录酶)
8
9
酶)
AW:I
均购自
:=M=U=
公司"
[=
L
=/
#
在正向文库推测的抗病相关基因
;9:.
中选择
相关研究报道较多的
1
条
;9:.
$过氧化氢酶
"
J2:
#)
24J
转运蛋白"
24JKB=/.
L
DBKCB
!
24J:
#)
ME/-KN
型胰蛋白酶抑制剂
$
"
ME/-KNKB
?L
.-/-/F-O-)
KDB$
!
M:P
#)丝氨酸乙醛酸氨基转移酶"
.CB-/C)
S
>
?
DR
?
>=KC=<-/DKB=/.ZCB=.C
!
9X:
#)多 聚 泛 素
"
L
D>
?
EO-
_
E-K-/
!
64P
#)脂氧合酶
P
"
>-
L
DR
?S
C/=.CP
!
Q` 7P
#)丝氨酸%苏安酸蛋白激酶"
.CB-/C
%
KFBCD)
/-/C)
L
BDKC-/T-/=.C
!
9
%
:IM
#)抗坏血酸过氧化物酶
"
=.@DBO=KC
L
CBDR-A=.C
!
2I7
#!根据
;9:
序列用
IB-软件分别设计引物"表
#
#!对其表达情
况进行
U:)IJU
分析!
U:)IJU
所用内参基因为百
合
-:,"+
基因*!%+引物由上海捷瑞生物工程有限
公司合成
对经镰刀菌诱导
*
个不同时间段的泸定百合组
培苗叶片分别提取总
UW2
!再按
2]b
反转录酶
"
:=M=U=
公司#说明书分别逆转录成
@5W2
后进行
U:)IJU
验证
U:)IJU
反应条件为
0$a
预变性
%<-/
&
0$a
变性
%".
!
$$
"
(%a
退火
%".
!
&!a
延
伸)
#<-/
!
1
"
%"
个循环&
!a
延伸
#"<-/
其中!
上)下游引物浓度为
#"
L

,
Q
#
!
AW:I
浓度为
#"<
,
Q
#
!
8
9
5W2
聚合酶浓度
#6

IJU
产物进行琼脂糖凝胶电泳!凝胶成像仪拍照!观察并
分析结果
!
!
结果与分析
>=<
!
百合尖孢镰刀菌诱导的泸定百合
$$%
文库
构建
利用
9]2U:
技术构建了中国野生泸定百合
组培苗经百合兼并镰刀菌诱导后
*
)
#!
)
!$
和
$1F
的叶片混合
99H
文库!在正向
99H
文库中随机挑
选了
%""
个单克隆进行
IJU
检测并测序
IJU
产
物电泳检测结果"图
#
#显示!绝大部分克隆中检测
到含有插入片段!插入片段大小集中在
!""
"
#"""
O
L
之间!且大部分为单片段插入!说明文库构建过
程中
;&
#
酶切较为彻底!连接和转化效果理想
随机挑选
%""
个单克隆进行测序后!共得到
!1"
条高质量有效
;9:.
序列!通过同源比对和功
能查询!除序列太短无法匹配)无同源性或同源性太
低和假定蛋白外!得到有一定功能的
;9:.
总
#*1
条!占有效序列的
*"c
!其功能主要涉及信号转导)
表
<
!
引物列表
:=O>C#
!
IB--.K
引物
IB-上游引物"
(d
#
%d
#
3DB\=BA
L
B-下游引物"
(d
#
%d
#
UC^CB.C
L
B-退火温度
]C>K-/
S
KC<
L
CB=KEBC
%
a
J2: 22J:2J22::JXJJX::J: JX2XX:2J:JJ:XX:XJ (#
24J: X:XXXJ2:2J:JJ:X22 J2XJ2::XJ:J2:2X22 $*
M:P X2:::JJX::X2X:X:J 2X2:X:J:X:XX:XJ:X $$
9X: J:J2X2J22JJJ2XJ22 JX:XX22XJX2:2J22: $1+&
64P 22XJ2XJ::X2XX2:XX :JJ2XXX:X2:JX:::: (#
Q` 7P 2JJJ2X2:X2:XX:2X:XJ X2XX:X:JXJJX2X22X (%
9
%
:IM 2X222X22X:XXXJX:22 X2J:XX:XX2X:X::XX: ("
2I7 :J2XX2JJJ2XX222XJ XX222:XJXX:XX222: (%
2@K-/ 2:XX22J:XX22:XX::22X 2:2XJ22J2:2J2:2XJ2XX (#
!&#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
#
!
99H
文库插入片段
IJU
检测
]+5Q!"""<=BTCB
&
#
"
!$+99H
文库中随机挑选的克隆
3-
S
+#
!
5CKC@K-D/DZKFC-/.CBKZB=
S
D/C.-/99H>-OB=B
?
O
?
IJU=<
L
>-Z-@=K-D/
]+5Q!"""<=BTCB
&
#
"
!$+U=/AD<>
?
.C>C@KCA.-/
S
>C@>D/C-/99H>-OB=B
?
表
>
!
部分阳性克隆"抗病防御相关基因#
C70()
比对结果
:=O>C!
!
2/=>
?
.-.DZ.DL
D.-K-^C@>D/C.
"
A-.C=.C
%
ACZC/.C
S
C/C
#
O
?
4>=.K
样品序列号
9=<
L
>CWD+
匹配长度
PAC/K-Z-@=K-D/
同源序列
HDD
S
DE.
S
C/C
次数
:-]:# !*1
过氧化氢酶
J=K=>=.C #
]:% !$( 24J
转运蛋白
24JKB=/.
L
DBKCB !
]:& !!* ME/-KN
型胰蛋白酶抑制剂
$TE/-KNKB
?L
.-/-/F-O-KDB$ #
]:* !#(
丝氨酸乙醛酸氨基转移酶
9CB-/C)
S
>
?
DR
?
>=KC=<-/DKB=/.ZCB=.C #
]:0 %*!
多聚泛素
ID>
?
EO-
_
E-K-/ #
]:$ !0!
脂氧合酶
PQ-
L
DR
?S
C/=.CP !
]:
(
10 *("
丝氨酸%苏氨酸蛋白激酶
9CB-/C
%
KFBCD/-/C)
L
BDKC-/T-/=.C #
]:
(
#! !%(
抗坏血酸过氧化氢酶
2B=O-AD
L
.-.KF=>-=/= #
]:
(
%% $0*
胰蛋白酶抑制因子
ME/-KNKB
?L
.-/-/F-O-KDB #
]:
(
#"" 1$#
钙调磷酸酶
4J=>@-/CEB-/4)>-TC
L
BDKC-/ #
]:
(
0" %&&
锌结合蛋白
Y/)O-/A-/
SL
BDKC-/ #
]:
(
11 (## OHQH
转录因子
OHQHKB=/.@B-
L
K-D/Z=@KDB #
]:
(
&# *1*
泛素结合酶
;!6O-
_
E-K-/)@D/
,
E
S
=K-/
S
C/N
?
]:
(
*! *"# 3)ODR
%
TC>@F
蛋白
3)ODR
%
TC>@F
L
BDKC-/ #
]:
(
% %(!
丝氨酸羧基肽酶
9CB-/C@=BODR
?L
C
L
K-A=.C #
]:
(
#0 !!"
细胞色素
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共
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!
#
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!
部分抗病相关基因
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的
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分析
U:)IJU
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!
#显示!
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因
;9:.
在经百合镰刀菌诱导后均显示不同程度上
调表达!且表达趋势相近!具体表现为$在
"F
时段
表达均为最小!从
*F
后逐渐上升!在一定时间段达
到高峰表达量后逐渐下降!在
&!F
时下降到最低
其中!
M:P
在
*F
段表达量达到最高!
$F
段后逐渐
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##
期
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99H
文库构建及抗病相关基因筛选
图
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!
部分抗病相关基因
;9:.
的
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U:)IJU
分析
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均在
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段表达量达到最高峰&
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和
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在
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开始就表现出很低
的表达量!而后者在
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段才有明显的低表达量!
但
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在
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段表达量最高!
但
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"
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!
讨
!
论
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!
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文库构建及抗病相关
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本研究利用
9]2U:
技术构建了泸定百合
99H
文库!对泸定百合经百合尖孢镰刀菌诱导后叶
部组织基因表达谱进行检测分析!发现泸定百合在
镰刀菌诱导后有大量差异表达的基因出现从基因
作用角度来分析!直接参与或控制抗病作用的基因
可能更易受镰刀菌的诱导而表现为上调表达!因此
应优先考虑正向
99H
文库中上调"差异#表达较明
显的基因有研究表明!镰刀菌在侵染植物时通常
会产生一定的毒素!如禾谷镰刀菌产生的脱氧雪腐
镰刀菌烯醇"
ACDR
?
/-^=>C/D>
!
5` W
#毒素!这些毒素
可能会损伤植物的细胞膜!并抑制植物体内蛋白质
的合成!从而可能会使镰刀菌处理的正向文库中的
部分基因表现为下调表达*!$+然而本研究中!没有
对
99H
文库克隆进行斑点杂交!只是随机挑取了
%""
个单克隆进行了测序!尽管完成
U:)IJU
表达
分析的
1
个抗病相关基因
;9:.
均表现为镰刀菌诱
导后上调表达!但其它基因是否也表现为上调表达
还不得而知另外!本研究只对正向文库中的部分
克隆进行了测序比对!没有挑取反向文库中的克隆
进行测序比对!反向文库的差异表达基因是否与抗
病相关!还有待进一步探究
此外!本研究从
99H
文库中筛选得到的多种抗
病相关基因与前人的百合同类研究结果有很多相
似*#!##+$马璐琳等*#+从大花卷丹百合镰刀菌诱导的
正向
99H
文库构建中也筛选到
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)
92]
等抗病
相关基因
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99H
文
库中!
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等*##+也筛选到
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泸定百合抗镰刀菌基因的表达分析
U:)IJU
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2I7
#均受到镰刀菌一定时间段的
诱导而上调表达!推测这
1
条
;9:.
可能都参与了
百合对镰刀菌枯萎病的抗病过程在表达趋势上!
不同
;9:.
表达量高峰值存在异同!但表达量均随
着侵染时间均先升高后降低的趋势本研究中!部
分基因在不同时间段病菌诱导后的表达趋势与前人
的报道存在一定差异!这种表达上的差异可能是由
于物种的抗病基因自身存在的异同!还可能与植物
材料)病菌种类和诱导处理时的浓度)侵染部位和方
式以及实验环境等存在差异有关因为关于百合镰
刀菌抗性基因的研究鲜见报道!所以以上这些基因
是否与百合镰刀菌枯萎病抗性直接相关还待进一步
研究此外!
99H
文库筛选及
U:)IJU
分析结果表
明有多个抗性相关基因参与了百合的镰刀菌抗病反
应!因此推测泸定百合对镰刀菌枯萎病的抗性途径
可能是一个多基因控制的复杂过程
参考文献!
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文库构建及抗病相关基因筛选