全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（4）：681–686 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–11–04；修回日期：2014–01–10
基金项目：国家自然科学基金项目（C140601-31000875）；国家公派出国留学基金项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zqx817@126.com）
gacS 基因在荧光假单胞菌 FD6 防治番茄灰霉病
中的功能分析
常 琳，肖 琦，童蕴慧，徐敬友，张清霞*
（扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009）
摘 要：荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）FD6 可产生多种抗菌物质，对多种植物病原真菌
生长都有抑制作用。将 FD6 菌株感应激酶 gacS 基因部分保守区片段克隆到自杀载体中得到质粒 pBS-S，
将该质粒电击转化到 FD6 菌株中，利用同源重组构建了 gacS 基因插入突变体。经测定该突变体不产生抗
生素硝吡咯菌素、2,4–二乙酰基间苯三酚、藤黄绿脓菌素、蛋白酶和氢氰酸，与野生型菌株相比形成生
物膜和嗜铁素能力显著降低，并且丧失了对番茄灰霉病防病能力。gacS 基因互补试验结果表明，gacS 基
因表达可恢复产生次生抗菌物质的能力，且对番茄灰霉病的防治效果与野生型菌株接近。由此证明，gacS
基因是影响拮抗细菌 FD6 抗生素产生和对病害抑制能力的重要调控因子。
关键词：荧光假单胞菌；gacS；抗生素；番茄灰霉病菌
中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）04-0681-06

Functional Analysis of the gacS Gene in a Tomato Grey Mould Suppressive
Bacterium Pseudomonas fluorescens FD6
CHANG Lin，XIAO Qi，TONG Yun-hui，XU Jing-you，and ZHANG Qing-xia*
（College of Horticulture and Plant Protection，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）
Abstract：Pseudomonas fluorescens FD6 strain produces several antifungal metabolites and inhibits
mycelial growth of many plant pathogenic fungi. The partial sequence of sensor kinase gacS gene was
PCR-amplified and used to construct a suicide vector pBS-S，which was introduced into strain FD6 to
generate a gacS gene-insertion mutant FD6-MS by homologous recombinant. FD6-MS could not produce
pyrrolnitrin，2,4-diacetylphloroglucinol，pyoluteorin，proteinase and HCN，and the siderphore production
and biofilm formation were markedly reduced. The mutant FD6-MS failed to protect tomato fruits from
grey mould caused by Botrytis cinerea HY2-1. The gacS complementary strain could restore the
production of above antifungal compounds and protective effect against tomato grey mold. Our results
suggest that the gacS gene in strain FD6 act as an important regulatory element in antibiotic production
and disease suppression activity.
Key words：Pseudomonas fluorescens；gacS；antibiotics；Botrytis cinerea

假单胞菌（Pseudomonas spp.）是一类常见的根际革兰氏阴性细菌。这类细菌中许多是植物有益

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菌，具有促进植物生长和防治病害的作用，因而作为植物病害生防菌被广泛研究和应用。抗生素的
产生一直被认为是假单胞菌重要的生防机理之一。许多菌株能够产生一种或多种抗生素，如 2,4–
二乙酰基间苯三酚（2,4-diacetylphloroglucinol，2,4-DAPG 或 phl）、吩嗪（phenazine，PCA）、藤黄
绿脓菌素（pyoluteorin，plt）、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin，prn）和氢氰酸（HCN）（Raaijmakers et al.，
2002）。生防假单胞菌中，产生抗生素 phl 的菌株能够有效地防治子囊菌禾顶囊壳小麦变种
（Gaeumannomyces graminis var. tritici）引起的小麦全蚀病（Dwivedi & Johri，2003），产生藤黄绿
脓菌素和吩嗪–1–羧酸的菌株能防治甜瓜蔓枯病（Hu et al.，2005），产生硝吡咯菌素的可防治棉花
立枯病（Hill et al.，1994）和番茄灰霉病（Chernin et al.，1996），另外，产生氢氰酸和嗜铁素的对
防治土传病害也有一定作用。在革兰氏阴性细菌中，这些抗菌次生代谢物的合成和分泌通常由许多
调控基因控制。GacS/GacA 双组分调控系统（two-component regulatory system）就是一个重要的调
控因子。GacS/GacA 的调控步骤大致为，感受激酶 GacS 首先识别信号，识别后进行磷酸化，磷酸
化的 GacS 将磷酸基团转移至反应调控因子 GacA，磷酸化的 GacA 激活或阻遏调控元件的转录，从
而控制目标基因的表达（Heeb & Haas，2001）。荧光假单胞菌 2P24 菌株，其 GacS 是抗菌代谢物
2,4–二乙酰基间苯三酚、氢氰酸、蛋白酶产生的调控元件，GacS 缺失突变体对小麦全蚀病的生防
能力显著下降（魏海雷和张力群，2005）；GacA 也可正调控 2,4–二乙酰基间苯三酚、氢氰酸、蛋
白酶的产生和生物膜的形成，但对嗜铁素产生起负调控作用（闫小雪 等，2004）。荧光假单胞菌 FD6
分离自福建闽侯青口青菜根围土壤，该菌株抑菌谱广，能抑制多种土传、气传病原真菌生长。该菌
株的抑菌机理主要是产生 2,4–二乙酰基间苯三酚、藤黄绿脓菌素和硝吡咯菌素，尤其硝吡咯菌素
可直接抑制番茄灰霉病菌生长（常琳 等，2011）。为明确 gacS 基因在荧光假单胞菌 FD6 中的生物
学功能，本研究中通过构建 gacS 基因插入突变体，比较突变体产生抗菌物质的能力及其对番茄灰霉
病的生防效果，揭示 gacS 基因的调控作用。以上研究结果为进一步解析菌株 FD6 生防机制提供基础。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒和培养条件
所用菌株、质粒及其来源见表 1。荧光假单胞菌 FD6 在 LB 培养基中 28 ℃培养 36 ~ 48 h，大
肠杆菌 37 ℃培养 12 ~ 16 h。所用抗生素使用浓度分别为：氨苄青霉素（Ap）50 μg · mL-1，卡那霉
素（Km）50 μg · mL-1，四环素（Tc）20 μg · mL-1。
表 1 本研究中的菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株和质粒 Strain and plasmid 特征 Character 来源 Source
菌株 Strain
荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens
FD6 Apr，Cmr，wild type 常琳 等，2011
FD6-MS Apr，Cmr，Kmr，FD6 inserted Km gene in gacS 本研究 This study
FD6-S Apr，Cmr，Kmr，Tcr，FD6-MS containing pME_S 本研究 This study
FD6-MS6032 Apr，Cmr，Kmr，Tcr，FD6-MS containing pME6032 本研究 This study
大肠杆菌 Escherichia coli DH5α supE44△lacU169 (Φ80 lacZ△M15) hdsR17 recA1 endA1 gyrA96
thi-1 relA1
Hanahan，1983
根癌农杆菌 Agrobacterium
tumefaciens NTL4（pZLR4）
A. tumefaciens NT1 derivative carrying a traG-lacZ reporter fusion Cha et al.，1998
番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea HY2-1 The fungal pathogen causing tomato grey mould Hanahan，1983
质粒 Plasmid
pBS-Km Kmr，ColE1 origin Hanahan，1983
pBS-S Kmr，pBluescript containing a 1 kb BamHⅠ-SacⅠ fragment of gacS 本研究 This study
pME6032 Tcr，lacI q_Ptac expression vector Heeb et al.，2002
pME_S pME6032 containing a 3 kb BamHⅠ fragment of gacS ORF 魏海雷和张力群，2005
4 期 常 琳等：gacS 基因在荧光假单胞菌 FD6 防治番茄灰霉病中的功能分析 683

1.2 gacS 基因插入突变
根据 GenBank 中已发布的 gacS 基因核苷酸序列，在 gacS 基因保守区设计引物。gacS1731：
5′-AAGGATCCCAGCACAGCATCGACCAGG-3′（下划线为 BamHⅠ位点），gacS2797：5′-TTGAGCTC
CAGGTGTTCGAGGTCC-3′（下划线为 SacⅠ位点）。以 FD6 基因组 DNA 为模板，进行 PCR 扩增。
PCR 条件为：94 ℃变性 5 min，94 ℃变性 40 s，60 ℃复性 40 s，72 ℃延伸 1 min，循环 35 次。经
琼脂糖凝胶电泳检测，扩增得到约 1 kb 的片段，产物经相应酶切后连接到自杀载体 pBS-Km，得到
重组质粒 pBS-S。利用电击法将该质粒导入 FD6 菌株中，以卡那霉素为标记筛选重组菌，即为 gacS
基因插入突变体，将其命名为 FD6-MS。
1.3 生长曲线测定
将待测菌株在 LB 培养液中振荡培养 28 h，各取 5 µL 转接于 5 mL 的 LB 培养液中，28 ℃培养
24 h。用新鲜的 LB 培养液将各菌株稀释至 OD600 = 0.5，以 1︰1 000（体积比）的比例，将各个相同
浓度的菌株接种于 100 mL 的 LB 培养液中，28 ℃ 140 r · min-1 培养，每隔 2 h 同时测定各菌株在 600
nm 的吸光值。试验重复测定 2 次。
1.4 抑菌相关性状检测
抗生素、氢氰酸、蛋白酶和嗜铁素的检测方法见常琳等（2011）的文献报道。
生物膜测定依据 O’Toole 等（1999）的方法。将 50 μL 过夜培养的新鲜待测菌液接种于盛有 500
μL LB 培养液的离心管（1.5 mL）中，28 ℃静止培养过夜，弃菌液，无菌水冲洗，加入 1 mL 1%的
结晶紫染液染色 15 min，用无菌水清洗干净，在培养液面位置的管壁上形成一圈紫环，即生物膜。
将待测管置于室温下吹干，每管用 2 mL 95%的乙醇将紫环洗下，分光光度计测定 OD570。每个处理
重复 3 次，以空白离心管作为阴性对照。
1.5 对植物病原真菌的拮抗作用和防治番茄灰霉病试验
在 PDA 平板中央接入直径为 5 mm 的病原真菌菌饼，病原真菌培养 2 d 后再接种待测生防菌。
22 ℃培养，当对照病原真菌长至培养皿边缘时测量各菌株抑菌带大小。
将大小均匀一致的番茄用 2%次氯酸钠溶液表面消毒 2 min 后，无菌水冲洗，晾干。用打孔器在
番茄果实最大截面处打 4 个直径 5 mm 对称的孔。每个孔内分别接种细菌 FD6、FD6-MS 和 FD6-S
菌悬液 20 μL，对照接种 LB 培养液。每处理 4 次重复，每重复 3 个番茄。果实于 28 ℃下保湿 12 h，
在伤口处接种直径 5 mm 的番茄灰霉病菌菌饼，置 22 ℃光照培养箱中（12 h 光照）培养。定期观察
并测量病斑直径。
2 结果与分析
2.1 gacS 基因片段克隆与序列分析
将从 FD6 菌株中 PCR 扩增得到的 gacS 基因约 1 kb 的部分保守区片段送交上海生工生物工程技
术服务有限公司测序，测得序列大小为 1 085 bp。核酸序列 BLAST 比对分析结果显示，该段序列与
荧光假单胞菌 P. fluorescens Pf5 感应激酶 GacS 相似性最高，可达 92%，其次与绿针假单胞菌 P.
chlororaphis PA23、荧光假单胞菌 P. fluorescens 2P24、恶臭假单胞菌 P. putida CA-3 和铜绿假单胞菌
P. aeruginosa PAO1 中的 GacS 也表现较高的相似度，相似性分别为 89%、88%、86%和 83%。序列
登录号为 JQ763407.1。
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图 1 FD6 及其衍生菌在管壁形成的生物膜定量检测
Fig. 1 Quantification of bacteria in biofilms formed on PVC by
strain FD6 and its derivates
2.2 gacS 基因插入突变体与互补菌株构建
将扩增到的片段用 BamHⅠ和 SacⅠ酶切后，连到相应酶切的 pBS-Km 质粒，挑选阳性克隆进
行酶切验证。将正确的重组质粒 pBS-S 电击转化到细菌 FD6 中，一次同源重组后获得插入 Km 抗生
素 gacS 插入突变体 FD6-MS，经测定突变体可以稳定遗传。将含有完整 gacS 基因的互补质粒 pME_S
电击转化到 FD6-MS 中，Tc 平板筛选到 gacS 互补菌 FD6-S。
2.3 gacS 对菌体生长的影响
为明确 gacS 基因对 FD6 及其衍生菌生长的影响，将穿梭载体 pME6032 电击转化到 FD6 和
FD6-MS 中，分别命名为 FD6-6032 和 FD6-MS6032，通过 LB 培养液摇培的方法检测 FD6-6032、
FD6-MS6032 和 FD6-S 生长速率。根据测定结果绘制生长曲线，结果表明，在测定的 24 h 内各个菌
株生长速率相似（曲线未列出），由此可见 gacS 基因对菌株生长影响极小。
2.4 gacS 对抑菌相关性状的影响
为明确 gacS 基因对抗菌代谢物产生的影响，同时检测 FD6 及其突变菌株生防相关性状变化。
结果表明 gacS 突变菌株 FD6-MS 不能产生硝吡咯菌素、2,4–二乙酰基间苯三酚、藤黄绿脓菌素、
氢氰酸和蛋白酶等抗菌物质，产嗜铁素的能力与野生菌 FD6 相比显著降低（表 2）。而互补菌 FD6-S
可恢复产生以上抗菌代谢产物能力。

表 2 荧光假单胞菌 FD6 及其衍生菌表型特征
Table 2 Phenotypic characterization of P. fluorescens FD6 and its derivatives
次生代谢物的产生 Secondary metabolites production 菌株
Strain
特征
Character prn phl plt HCN 蛋白酶 Proteinase 嗜铁素 Siderophore
FD6 Wild type ++ ++ ++ ++ ++ ++
FD6-MS gacS - – – – – – +
FD6-S gacS + ++ ++ ++ ++ ++ ++
注：++. 可检测到代谢物；+. 代谢物显著减少；–. 检测不到代谢物。
Note：++. Metabolite detected；+. Reduce significantly；–. No metabolite detected.

野生菌株 FD6 可形成生物膜，gacS 突变株
FD6-MS 形成生物膜的能力显著降低，而互补
菌株 FD6-S 又恢复了这一能力。生物膜产生能
力的量化结果（图 1）也证实以上结论。因此，
gacS 基因在荧光假单胞 FD6 的生物膜形成中
也起到重要作用。
2.5 gacS 对 FD6 抑制番茄灰霉病菌效果的影
响
平板拮抗试验（图 2）显示，FD6 菌株对
番茄灰霉病菌有明显的抑制作用，抑菌带宽达
0.63 cm，FD6-MS 不能产生抑菌带，说明突变
菌株完全丧失了对病菌的拮抗作用，而互补菌株 FD6-S 可恢复拮抗能力。
防病试验结果表明，FD6 和 FD6-S 处理的果实表面病斑较小，甚至不发病，而 FD6-MS 和对照
果实病斑扩展速度快，FD6-MS 处理病斑直径 1.98 cm，对照为 2.2 cm（图 3，图 4），而且在病斑处
可见浓密的白色菌丝。以上试验说明，gacS 是荧光假单胞菌 FD6 中一个控制生防因子并影响生防效
果的重要调控基因。
4 期 常 琳等：gacS 基因在荧光假单胞菌 FD6 防治番茄灰霉病中的功能分析 685

图 2 FD6 及其衍生菌对 HY2-1 拮抗作用
Fig. 2 Antagnistic effect of FD6 and its derivates on HY2-1
图 3 FD6 及其衍生菌对病斑扩展的影响
Fig. 3 Effect of FD6 and its derivates on lesion diameter



图 4 FD6 及其衍生菌对番茄灰霉病生防效果
Fig. 4 The biocontrol effect of strain FD6 and its derivates to B. cinerea
3 讨论
生防假单胞菌抗菌代谢产物的产生受到各种调控基因与环境因子的控制。GacS/GacA 双组分调
控系统是假单胞菌中重要调控因子，可控制许多与生防能力相关的抗生素和酶的产生。GacA 或 GacS
基因被突变后，突变体通常会丧失抑菌能力（Heeb et al.，2002）。GacS/GacA 系统可调控多种抗菌
物质合成，尤其是 phl、plt 和 HCN 的合成（Lapouge et al.，2007）。但葛宜和等（2008）推测 GacS
对不同代谢物的调控具有特异性，在其试验菌株中，该基因正调控抗生素吩嗪–1–羧酸的合成，但
对吲哚乙酸分泌没有影响。本试验中，gacS 基因插入突变体不能合成 prn、phl、plt、HCN 和蛋白酶，
失去对病原真菌的拮抗作用，说明 FD6 菌株中 GacS/GacA 是这几种抗菌物质合成的必需调控因子。
另外，gacS基因突变并不能使FD6菌株完全丧失产生嗜铁素能力，说明产生嗜铁素不仅受GacS/GacA
系统调控，可能还存在其它调控方式。葛宜和等（2008）分析 GacS/GacA 有调控特异性，但在 FD6
中，GacS/GacA 对嗜铁素调控不应该是特异性问题，可能是调控方式或调控系统问题。Poritsanos
等（2006）研究绿针假单胞菌（P. chlororaphis）时观察到，gacS 突变体产嗜铁素能力增强，其它抗
菌代谢物如吩嗪–1–羧酸、1–羟基吩嗪，蛋白酶、脂酶和氢氰酸都显著减少或延迟产生，同时突
变体丧失对油菜菌核病的防病能力。可见，GacS/GacA 双组分调控系统在不同微生物中所控制的性
状及其对下游基因的调控方式不尽相同。
假单胞菌中同时存在另一种群体感应（Quorum-Sensing）调控系统。该系统可控制细菌许多重
要的生理功能，包括抗生素产生、根瘤形成、Ti 质粒接合转移、生物膜形成、致病相关基因表达及
抗菌代谢产物产生（吴红 等，2003）。本研究中以 A. tumefaciens NTL4（pZLR4）为报告菌，采用
琼脂条法检测，FD6 不能产生 AHL（acyl-L-homoserine lactones）信号，因此该菌株不具有群体感应
调控系统（数据未列出）。除以上两种调控系统外，有些细菌抗生素产生还受特异性转录调控因子的
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影响，因此，有必要深入了解拮抗细菌 FD6 中次生抗菌代谢物产生的调控网络，为提高生防菌 FD6
防病效果挖掘更多资源。

References
Cha C，Gao P，Chen Y C，Shaw P D，Farrand S K. 1998. Production of acyl-homoserine lactone quorum-sensing signals by gram-negative
plant-associated bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions，11 (11)：1119–1129.
Chang Lin，Li Qian，Tong Yun-hui，Xu Jing-you，Zhang Qing-xia. 2011. Identification of the biocontrol bacterial strain FD6 and antimicrobial study
of this bacterium against tomato grey mould pathogen Botrytis cinerea. Acta Phytophylacica Sinica，38 (6)：487–492. (in Chinese)
常 琳，李 倩，童蕴慧，徐敬友，张清霞. 2011. 生防细菌 FD6 的鉴定及其对番茄灰霉病菌的作用机制. 植物保护学报，38 (6)：487–492.
Chernin L，Brandis A，Ismailov Z，Chet I. 1996. Pyrrolnitrin production by an Enterobacter agglomerans strain with a broad spectrum of antagonistic
activity towards fungal and bacterial phytopathogens. Current Microbiology，32 (4)：208–212.
Dwivedi D，Johri B N. 2003. Antifungals from fluorescent pseudomonads：Biosynthesis and regulation. Current Science，85 (12)：1693–1703.
Ge Yi-he，Chen Li-juan，Wang Lei，Su Hong-yan，Zhou Jin-feng，Cheng Xian-hao. 2008. Effect of insertional inactivation of gacS on two secondary
metabolites in Pseudomonas chlororaphis G-05. Acta Microbiologica Sinica，48 (12)：1595–1601. (in Chinese)
葛宜和，陈丽娟，王 磊，宿红艳，周金凤，程显好. 2008. gacS 基因插入失活对绿针假单胞菌 G-05 的两种胞外次生代谢物合成的影
响. 微生物学报，48 (12)：1595–1601.
Hanahan D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology，166：557–580.
Heeb S，Blumer C，Haas D. 2002. Regulatory RNA as mediator in GacA/RsmA-dependent global control of exoproduct formation in Pseudomonas
fluorescens CHA0. J Bacteriol，184 (4)：1046–1056.
Heeb S，Haas D. 2001. Regulatory roles of the GacS/GacA two-component system in plant-associated and other gram-negative bacteria. Molecular
Plant-Microbe Interactions，14 (12)：1351–1363.
Hill D S，Stein J I，Torkewitz N R，Morse A M，Howell C R，Pachlatko J P，Becker J O，Ligon J M. 1994. Cloning of genes involved in the synthesis
of pyrrolnitrin from Pseudomonas fluorescens and role of pyrrolnitrin synthesis in biological control of plant disease. Applied and
Environmental Microbiology，60 (1)：78–85.
Hu H B，Xu Y Q，Chen F，Zhang X H，Hur B. 2005. Isolation and characterization of a new fluorescent Pseudomonas strain produced both
phenazine-1-carboxylic acid and pyoluterorin. J Microbiol Biotechnol，15 (1)：86–90.
Lapouge K，Sineva E，Lindell M，Starke K，Baker C S，Babitzke P，Haas D. 2007. Mechanism of hcnA mRNA recognition in the Gac/Rsm signal
transduetion pathway of Pseudomonas fluorescens. Mol Microbiol，66 (2)：341–356.
O’Toole G A，Pratt L A，Watnick P I，Newman D K，Weaver V B，Kolter R. 1999. Genetic approaches to study of biofilms. Methods Enzymol，
310：91–109.
Poritsanos N，Selin C，Fernando W G，Nakkeeran S，de Kievit T R. 2006. A GacS deficiency does not affect Pseudomonas chlororaphis PA23 fitness
when growing on canola，in aged batch culture or as a biofilm. Can J Microbiol，52 (12)：1177–1188.
Raaijmakers J M，Vlami M，de Souza J T. 2002. Antibiotic production by bacterial biocontrol agents. Antonie van Leeuwenhoek，81 (1–4)：
537–547.
Wei Hai-lei，Zhang Li-qun. 2005. Cloing and functional characterization of the gacS gene of the biocontrol strain Pseudomonas fluorescens 2P24.
Acta Microbiologica Sinica，45 (3)：368–372. (in Chinese)
魏海雷，张力群. 2005. 荧光假单胞杆菌 2P24 中 gacS 基因的克隆和功能分析. 微生物学报，45 (3)：368–372.
Wu Hong，Song Zhi-jun，Niles H，Michael G. 2003. Information communication among bacteria and bacteria–gram negative bacterial
Quorum-Sensing system. Progress in Natural Science，13 (7)：679–687. (in Chinese)
吴 红，宋志军，Niels H，Michael G. 2003. 细菌与细菌之间的信息交流——革兰氏阴性细菌的 Quorum-Sensing 系统. 自然科学研究进
展，13 (7)：679–687.
Yan Xiao-xue，Zhang Li-qun，Yang Zhi-wei，Tang Wen-hua. 2004. The role of regulatory gene gacA in the suppression of soil-borne diseases by
Pseudomonas fluorescens 2P24. Acta Phytopathologica Sinica，34 (3)：272–279. (in Chinese)
闫小雪，张力群，杨之为，唐文华. 2004. 调控基因 gacA 在荧光假单胞菌 2P24 防治土传病害中的作用. 植物病理学报，34 (3)：272–279.