全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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+/001+#""")$"!*+!"#$+#!+!%&$
收稿日期$
!"#$)",)!!
&修改稿收到日期$
!"#$)#")%#
基金项目$海南省自然科学基金"
%#$#!!
#&中央级公益性科研院所基本科研业务费专项基金"
2344#$"!"$
!
#-%""*!"#$""%
!
2344#$"!"-
#&
海南省重大科技专项"
5657!"#%"!%)#
#
作者简介$胡
!
伟"
#&(!
#!男!助理研究员!主要从事植物分子生物学研究
8)9:/;
$
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!
#!-+@A9
小麦
1$2!3$
基因克隆及表达分析
胡
!
伟!颜
!
彦!韦运谢!铁韦韦!候晓婉
"中国热带农业科学院 热带生物技术研究所!海口
*,##"#
#
摘
!
要$
BCD
转录因子在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用该研究利用
ECD8
技术从小麦
中克隆了
#
个
BCD
基因
!"#$%*
"
FG-*"##%+#
#序列分析显示!
!"#$%*
基因开放阅读框"
HEI
#
&!$J
K
!编码
%",
个氨基酸多序列比对和进化树分析显示!
!"#$%*
基因所编码的蛋白具有
BCD
家族蛋白的保守结构域!与
玉米
59BCD*
有较近的亲缘关系实时荧光定量
LDE
分析显示!
!"#$%*
基因的表达显著受渗透胁迫(低温胁
迫(乙烯和双氧水诱导!而受高盐胁迫和
C4C
抑制研究表明!
!"#$%*
参与非生物逆境胁迫及相关信号分子的
应答
关键词$小麦&
BCD
&克隆&表达
中图分类号$
G,(*
&
G,(-
文献标志码$
C
%&"()!*+
,
-(..#""/1$2!3$0((#12()3
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OCBO:1
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N82O=1P/?
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328N?/>?/
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K
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AR3SA
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0:1/9
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V
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V
0/0/1T/@:Q?TQ<:Q3:BCD*
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>/Q<59BCD*+E?:;)Q/9?
Y
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Q:Q/Z?
K
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V
9?S:0?@<:/1S?:@Q/A1
"
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#
:00:
V
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K
S?00/A1>:0/1T=@?T:RQ?SA0)
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K
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!
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V
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!
H
!
QS?:Q9?1Q0
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K
:SQ/@/
K
:Q?0/1QK
A10?AR:J/AQ/@0QS?00?0:1TS?;:Q?T
0/
U
1:;/1
U
9A;?@=;?0+
7(
8
9"-!.
$
>&
BCD
&
@;A1?
&
?P
K
S?00/A1
!!
非生物逆境胁迫是影响植物生长发育以及作物
产量和品质的重要环境因子)#*植物对逆境胁迫的
应答主要是通过对胁迫信号的感知和转导!促进胁
迫相关基因的表达和蛋白质的合成!导致生理生化
的变化和代谢物的合成!从而降低胁迫所导致的伤
害这些重要的功能蛋白包括$分子伴侣(渗透调节
蛋白(离子通道蛋白(转运蛋白(保护蛋白和解毒蛋
白等)!*这些功能蛋白的表达依赖特异的转录因子
对其调控所以!转录因子在植物对非生物逆境胁
迫的应答过程中起着至关重要的作用)!*
BCD
"
BC[
!
C3CI:1TDMD
#是植物中特有
的一类转录因子大多数
BCD
转录因子含有一个
保守的
B
端
6BC
结合域(一个核定位信号和一个
D
端可变结构域)!*
#&&-
年
WA=?S
等)%*从矮牵牛中
克隆到第一个
BCD
基因!随后在拟南芥(水稻(小
麦(大麦(马铃薯(油菜等物种中都有发现
BCD
是
一个具有较多成员的家族!在拟南芥中有
#"*
个成
员!在水稻中有
#$"
个成员
BCD
家族基因的功能
主要是参与调控植物生长发育(激素响应以及生物
与非生物胁迫的应答植物对非生物逆境胁迫的应
答是一个复杂的过程!涉及到转录水平(翻译水平(
翻译后水平等多个层次!多种信号转导途径的调
控)$*目前!
BCD
家族基因的功能在模式植物拟南
芥和水稻中的研究较为深入!但是在其它植物中对
非生物逆境胁迫应答过程中的作用及机理还有待于
进一步研究)!*虽然!小麦中多个
BCD
家族基因
已被克隆!但是小麦
BCD
家族基因对非生物逆境
胁迫及相关信号分子应答的机理尚不清楚)*)-*
本研究从小麦中克隆了一个
BCD
转录因子基
因!并对其在逆境胁迫以及多种信号分子处理下的
表达模式进行了探讨!为进一步研究
BCD
基因的
抗逆功能及其参与的信号转导途径奠定基础
#
!
材料和方法
:+:
!
材
!
料
实验所用小麦品种为+中国春,"
!&()*+",-.
(/*+\+@Z+DK
S/1
U
#!种子由中国热带农业
科学院热带生物技术研究所保存
:+;
!
方
!
法
:+;+:
!
目的基因的获得
!
小麦种子在无菌水中发
芽生长
#"T
后!提取叶片
EBC
!反转录
@6BC
后进
行基因克隆搜索
6ID2
小麦数据库
8W3
序列信
息"
K
$%%
@A9
K
J/A+TR@/+<:SZ:ST+?T=
%
Q
U
/
%#!发现
一个
@6BC
片段与
BCD
家族基因具有较高一致
性!但其
%]
端缺失为了从小麦中克隆该基因的
@6BC
全长!根据该
8W3
序列信息设计
%])ECD8
扩增引物"
*])3DC^ 3CC3CCDC^ 3^ DDC^ DCC)
DC)%]
#利用
ECD8
扩增试剂盒"
D;A1Q?@<
公司#
获得
%])ECD8
扩增片段!对
%])ECD8
扩增片段和
原
8W3
序列进行拼接!得到一个具有完整开放阅读
框的
@6BC
序列然后根据该
@6BC
序列设计
#
对引物"
*])^ 3^ 33DD3D3D3DC3D^ DC3DC)%]
!
*])33^ DD3C^ CC^ 3^ 3^3DDCC^ 3)%]
# 进 行
LDE
扩增
LDE
扩增产物回收(连接(转化(鉴定(
测序后!将该
@6BC
序列命名为
!"#$%*

LDE
扩
增反应程序为
&$_
预变性
*9/1
!
&$_
变性
%"0
!
*"_
退火
%"0
!
,!_
延伸
-"0
!循环
%*
次
:+;+;
!
生物信息学分析
!
序列比对和保守结构预
测利用
4\CW3
"
K
$%%
J;:0Q+1@J/+1;9+1/<+
U
AZ
%
4;:0Q+@
U
/
#&开放阅读框预测利用
HEII/1T?S
"
Q
K
$%%
>>>+1@J/+1;9+1/<+
U
AZ
%
U
ASR
%
U
ASR+#和
8^BWDCB
"
K
$%%
U
?1?0+9/Q+?T=
%
8^BWDCB+
#&多序列比对利用
6BC[CB
软件&进化树构
建利用
[8^ C
软件
:+;+<
!
基因表达分析
!
生长
#"T
的小麦幼苗!用
!"` L8^ )-"""
(
!""99A;
%
\B:D;
(
$_
低温(
#""
"
9A;
%
\C4C
(
#""
"
9A;
%
乙烯(
#"99A;
%
\F
!
H
!
分别处理"
L8^ )-"""
(
B:D;
(
C4C
(乙烯和
F
!
H
!
均
购自上海生工生物工程有限公司#!在处理后
!
(
-
(
#!
(
!$<
取叶片样品!利用
EBC0/9
K
;?3AQ:;EBC
a/Q
"
3/:1
U
?1
公司#提取叶片总
EBC
为避免基因
组
6BC
污染!在
EBC
提取过程中对基因组
6BC
进行消化利用
E?Z?SQC/TI/S0QWQS:1T@6BC
W
V
1Q"
I?S9?1Q:0
公司#将提取的总
EBC
反转录成
@6BC
!反转录反应程序为
-*_
预变性
*
9/1
!
$!_
变性
-"9/1
!
,"_
退火
*9/1
以
@6BC
第一链为模板
实时荧光定量
LDE
采用
WO4ELS?9/P01
!"
2
试剂盒"
3:E:a:
公司#!按照操作说明在
[P
%""*L
荧光定量
LDE
仪"吉泰生物科技有限公司#
上进行!以小麦
$)(3
基因为内参!引物为
3:CD3)
2BI
"
*])^ 3D^ 3^^ CC^ ^^ C^D33CDC)%]
#和
3:CD32BE
"
*])33DC3CDC^ DC^ D^CC^ DCD)
%]
#参考
3:a:E:
实时荧光定量标准说明书进行
引物设计!为了保证引物的特异性!引物设计在非保
守区域!
LDE
产物的长度维持在
%""J
K
以内!并进
行测序验证所用引物为
3:BCD*I
"
*])D^ DDCD)
3^ DDCDD3D3DC)%]
#和
3:BCD*E
"
*])^ DCDDC)
DD3DCDDCDDDC)%]
#!所有引物由上海生工生物
工程有限公司合成荧光定量
LDE
反应程序为
&*_
预变性
%9/1
&
*_
变性
,0
!
**_
退火
#"0
!
,!
_
延伸
!"0
!循环
$"
次定量分析采用
!

##
%
3
法),*$
##
%
3
b
"
%
3
!
3:S
U
?Q
%
3
!
C@Q/1
#
3/9?P

"
%
3
!
3:S
U
?Q

%
3
!
C@Q/1
#
3/9?"
实时荧光定量
LDE
反应在同一个反
应程序和反应体系下扩增目的基因和内参基因!每
样品
%
个重复!并在同样反应条件下进行一次生物
学重复验证
!
!
结果与分析
;=:
!
1$2!3$
基因的克隆及生物信息学分析
在
6ID2
小麦数据库中发现一个与小麦
BCD
家族基因具有较高一致性的
8W3
序列!但其
%])
端
缺失因此!首先利用
ECD8
技术从小麦中克隆了
其
%])@6BC
序列
!$-J
K
"图
#
!
C
#将扩增的
%])
端
序列与原序列拼接得到该基因
@6BC
全长序列!并
利用
LDE
扩增!扩增片段为
&,!J
K
"图
#
!
4
#!其
*&%!
#!
期
!!!!!!!!!!!!!!!
胡
!
伟!等$小麦
!"#$%*
基因克隆及表达分析
图
#
!
!"#$%*
基因的克隆
C+ECD8
产物电泳图$
[+6BC9:SX?S
&
#+%])ECD8
产物&
4+!"#$%*
基因的
@6BC
全长电泳图$
[+6BC9:SX?S
&
#+!"#$%*
基因的
@6BC
全长
LDE
扩增产物
I/
U
+#
!
D;A1/1
U
AR!"#$%*
C+3U
:SA0?
U
?;?;?@QSA
K
K
SAT=@Q0
$
[+6BC9:SX?S
&
#+%])ECD8
K
SAT=@Q
&
4+3U
:SA0?
U
?;
?;?@QSA
K
U
Q$
[+6BC
9:SX?S
&
#+C9
K
;/R/@:Q/A1ARR=;;?1
U
Q图
!
!
3:BCD*
与其它物种
BCD
家族
基因的氨基酸序列比对
C
$
8
表示
BCD
家族蛋白保守区&
3:BCD+
小麦"
C^ c"(%""
#&
CQBCD#+
拟南芥"
BL
-
#,*&&,
#&
H0BCD#+
水稻"
4C6!-!!#
#&
59BCD*+
玉米"
BL
-
""##$,,,"
#
I/
U
+!
!
DA9
K
:S/0A1ARQY
=?1@?0
AR3:BCD*:1TAQK
SAQ?/10
3U
<;
V
@A10?SZ?T:9/1A:@/T9AQ/R0
"
C8
#
:S?01+3:BCD+!&()*+",-(/*+
"
C^ c"(%""
#&
CQBCD#+$&"456
7
--(8"9"3"
"
BL
-
#,*&&,
#&
H0BCD#+:&
;
<"
-"(/"
"
4C6!-!!#
#&
59BCD*+=,"+"
;
-
"
BL
-
""##$,,,"
#
HEI&!$J
K
!编码
%",
个氨基酸保守结构域分析
表明该基因编码的蛋白具有一个
BC[
结构域!属
于
BC[
亚家族
4\CW37
分析表明该基因编码
的氨基酸序列与其它物种大麦"
C[*""(**+#
#(二
穗短柄草"
7L
-
""%*,,*$-
#(粗山羊草 "
8[3!!#&%
#
中
BCD
家族蛋白具有较高的一致性!分别为
&,`
(
(%`
(
#`
多序列比对分析表明!该基因编码的氨
基酸序列与其它物种中
BCD
蛋白氨基酸序列具有
较高一致性!并且含有
*
个保守结构域 "图
!
#进
化树分析表明!
3:BCD*
与小麦
3:BCD
(
3:B)
CD-4
(
3:BCD-D
聚在同一枝上!并与玉米
59)
BCD*
有较近的亲缘关系"图
%
#!因此将该基因命
名为
!"#$%*

;=;
!
1$2!3$
基因在非生物逆境胁迫下的表达分析
为了研究
!"#$%*
基因对非生物逆境胁迫的
图
%
!
3:BCD*
与其他物种中
BCD
家族成员系统发育进化树
标尺代表碱基替换率&分支上的数字表示
4AAQ0Q:S
K
验证中
#"""
次
重复计算的值&
3:BCD
"
C^ c"(%""
#(
3:BCD-D
"
C83#"$-"
#(
3:BCD-4
"
C83#"$*&
#(
3:BCD!#
"
8[W*!$!,
#
+
小麦&
59BCD*
"
BL
-
""##$,,,"
#(
59BCD!#
"
BL
-
""##$(!%#
#(
59BCD!
"
CD^ $!*-"
#
+
玉米&
H0BCD#
"
4C6!-!!#
#(
H0BCD!
"
4CD*%(##
#
+
水稻&
9^BCD%*
"
CDD--%#-
#(
9^BCD*
"
CC7(*&(!
#
+
大豆&
LZBCD#
"
CCa($((%
#
+
芸豆&
E@BCD!#
"
7L
-
""!*!&&*$
#
+
蓖麻&
<^BCD-
"
CD2#*%$%
#
+
棉花&
CQBCD,&
"
7L
-
""!(,#!(%
#(
CQBCD#
"
BL
-
#,*&&,
#(
CQBCD&!
"
7L
-
""!(-(,"-
#
+
拟南芥&
DQBCD
"
CD[&"#-!
#
+
橙子
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U
+%
!
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BCD
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SAQ?/10RSA9AQK
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3K
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K
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3:BCD
"
C^ c"(%""
#!
3:BCD-D
"
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#!
3:BCD-4
"
C83#"$*&
#!
3:BCD!#
"
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#
+
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&
59BCD*
"
BL
-
""##$,,,"
#!
59BCD!#
"
BL
-
""##$(!%#
#!
59BCD!
"
CD^ $!*-"
#
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"
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#!
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"
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#
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"
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#!
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"
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#
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LZBCD#
"
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#
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"
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-
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"
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#
+
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"
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-
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#!
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"
BL
-
#,*&&,
#!
CQBCD&!
"
7L
-
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#
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7
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DQBCD
"
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#
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B
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-&%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
!"#$%*
基因在不同非生物逆境
胁迫下的实时定量
LDE
分析
I/
U
+$
!
G=:1Q/Q:Q/Z?S?:;)Q/9?:1:;
V
0/0AR!"#$%*
U
?1?S?0
K
A1T/1
U
QAZ:S/A=0:J/AQ/@0QS?00?0
图
*
!
!"#$%*
基因在不同信号分子
处理下的实时定量
LDE
分析
I/
U
+*
!
G=:1Q/Q:Q/Z?S?:;)Q/9?LDE:1:;
V
0/0AR
!"#$%*
U
?1?S?0
K
A1T/1
U
QAZ:S/A=0
0/
U
1:;/1
U
9A;?@=;?0QS?:Q9?1Q0
响应!利用实时定量
LDE
检测
!"#$%*
基因在
L8^ )-"""
(低温(
B:D;
处理下的表达模式结果
"图
$
#表明!
L8^ )-"""
处理下
#!
和
!$<
!
!"#$%*
基因表达受到显著诱导&低温处理下
!
和
-<
!
!"#$%*
基因表达 被显著诱导&高盐处理
!
$
!$
<
!
!"#$%*
基因表达显著被抑制这些结果说明!
在渗透和低温胁迫下!
!"#$%*
基因能够被诱导上
调表达!而高盐胁迫抑制
!"#$%*
基因表达
;=<
!
1$2!3$
基因在信号分子处理下的表达分析
为了研究信号分子对
!"#$%*
基因表达的调
控!用
C4C
(乙烯(双氧水处理小麦幼苗!利用实时
荧光定量
LDE
分析检测
!"#$%*
基因表达结果
"图
*
#表明!在
C4C
处理
!
$
!$<
!
!"#$%*
基因
表达被显著抑制&在乙烯和双氧水处理
!
$
!$<
!
!"#$%*
基因表达被显著诱导这些结果说明!
C4C
能够抑制
!"#$%*
基因表达!而乙烯和双氧
水能够诱导
!"#$%*
基因表达
%
!
讨
!
论
BCD
转录因子是一个庞大的家族!在拟南芥(
水稻(大豆等物种中都被报道存在超过
#""
个成员
小麦遗传背景复杂"异源六倍体#(基因组大"
#, J^
!
是水稻基因组的
$"
倍#(基因组上重复序列多
"
(*`
#!严重限制了小麦功能基因的分离和鉴定)(*
所以!小麦中
#$%
家族基因的研究相对滞后!目前
小麦中
#$%
家族成员的数目尚不明确!小麦中
#$%
家族基因的报道也非常有限本研究从小麦
中克隆了
#
个
#$%
家族基因!该基因编码的氨基
酸序列具有
#$%
转录因子的基本特征!与其它物
种中
#$%
家族成员具有较高的一致性!与玉米
59BCD*
有较近的亲缘关系
#$%
家族基因被报道广泛地参与植物对非生
物逆境胁迫的应答!并且被认为是作物抗性育种较
为 重 要 的 候 选 基 因)&* 拟 南 芥
$#$%"#&
(
$#$%"**
和
$#$%",!
被报道能够被干旱(高盐
和
C4C
诱导!过表达
$#$%"#&
(
$#$%"**
和
$#$%",!
能够显著增强植物对干旱胁迫的耐受
性)#"*水稻
C#$%#
和
:-#$%-
能够被干旱(低
温(高盐和
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对小麦
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基因对非生物逆境胁迫及相关信号分子的应
答的分析表明!
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C4C
抑制这些结果暗示
着
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家族基因对非生物逆境胁
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境胁迫的耐受性还需要进一步的功能鉴定乙烯信
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号和双氧水信号能够诱导一系列信号转导途径!在
植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作
用)$*本研究发现
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受渗透(低温(乙烯和
双氧水诱导!因此可以推测!
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参与小麦对
渗透胁迫和低温胁迫的应答过程可能与乙烯信号和
双氧水信号有关本研究的结果为进一步鉴定
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基因在非生物逆境胁迫中的功能及其参
与的信号转导途径奠定了基础
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