全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)"1)!*
基金项目$中央级公益性科研院所基本科研业务费专项基金"
2344#$"!"$
#&海南省重大科技专项"
5657!"#%"!%)#
#
作者简介$胡
!
伟"
#&1!(
#!博士!助理研究员!主要从事植物分子生物学研究
8)9:.;
$
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!
#!+@A9
小麦
1$2!34$
基因的克隆及表达分析
胡
!
伟#!颜
!
彦#!马占兵!
"
#
中国热带农业科学院 热带生物技术研究所!海口
*,##"#
&
!
宁夏医科大学 医学遗传与细胞生物学系!银川
,*"""$
#
摘
!
要$该研究从小麦中克隆了
#
个
!"#$
基因
%&!"#$!
序列分析表明!
%&!"#$!
基因的
BCD
为
###"
E
F
!编码
%&
个氨基酸序列比对分析表明!该基因所编码的蛋白与粗山羊草(水稻(谷子等
GHIJ
蛋白具有较高
的一致性!分别为
&&K
(
&$K
(
&$K
进化树分析表明!
3:GHIJ!
与水稻
B/GHIJ!
的亲缘关系最近实时荧光
定量
ILC
分析表明!该基因的表达显著受渗透胁迫(低温胁迫(高盐胁迫(乙烯和双氧水诱导!受
H4H
抑制研究
表明!
%&!"#$!
可能参与非生物逆境胁迫及相关信号分子应答
关键词$小麦&
GHIJ
&克隆&表达
中图分类号$
M,1*
&
M,1
文献标志码$
H
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(
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1
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07/6-)86
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GHIJ
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#
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&$K
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X
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S
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X
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B
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9?0T+3SS
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F
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F
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A0/?AU:E.AT.@/TV?//?/:0WV?;:T?W
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S
0:;.0
S
9A;?@=;?/+
9.
1
:"-!/
$
>&
GHIJ
&
@;A0.0
S
?F
V?//.A0
!!
蛋白质的磷酸化在植物对逆境胁迫的信号转导
过程中发挥着重要作用底物蛋白质被磷酸化的氨
基酸残基主要是丝氨酸(苏氨酸(酪氨酸等少数几个
氨基酸因此!根据磷酸化靶蛋白的氨基酸残基种
类的不同!蛋白激酶被分为丝氨酸%苏氨酸激酶(酪
氨酸激酶(组氨酸激酶(色氨酸激酶和天冬氨酰基%
谷氨酰基蛋白激酶等
*
类促分裂素原活化蛋白激
酶"
9.TA
S
?0):@T.]:T?W
F
VAT?.0Z.0:/?
!
GHIJ
#属于
丝氨酸%苏氨酸蛋白激酶!其功能主要是参与调控细
胞生长(分化(对环境的适应(炎症反应等多种重要
的细胞生理和病理过程)#*
在植物中!根据
GHIJ
编码蛋白序列的
3\Q
基
序的不同!将
GHIJ
蛋白分为
38Q
类和
36Q
类!根
据系统发生关系将
38Q
类进而划分为
H
(
4
(
L
组!
36Q
类单独列为
6
组)!*每一组中的
GHIJ
成员
都被报道能够参与逆境胁迫应答和激素信号转导
HTGIJ
"
H
组#(
HTGIJ$
"
4
组#(
59GIJ,
"
L
组#(
4PGJ#
"
6
组#能被逆境胁迫和相关信号分子
激活)%)**
!"#$
是一个高度保守的基因家族!在
拟南芥以及其它物种中多个
!"#$
家族成员都被
报道能够赋予植物对生物及非生物逆境胁迫的耐受
性所以!
!"#$
家族基因在植物对逆境胁迫的应
答及相关信号转导过程中发挥着重要作用然而!
小麦的
!"#$
家族基因的研究较少
JA9./
等)*
报道!小麦
F
%1);.Z?GHIJ
蛋白的表达可能与高渗
胁迫诱导的相关生理过程有关
C=WW
等),*研究表
明!真菌侵染能够在转录水平和翻译水平诱导
3:GIJ%
上调表达!但抑制
3:GIJ
表达所以!
小麦
!"#$
家族基因对非生物逆境胁迫及相关信
号分子研究非常有限!小麦
!"#$
家族基因在非
生物逆境胁迫中的功能值得进一步研究
本研究从小麦中克隆了一个
%&!"#$!
基因!
并对其在逆境胁迫以及多种信号分子处理下的表达
模式进行了考察!为进一步探讨
%&!"#$!
基因的
功能奠定基础
#
!
材料和方法
;+;
!
材
!
料
实验所用小麦品种为+中国春,"
%3).)0/8&-9
.)6/8_+@]+L<.0?/?Y
F
V.0
S
#!种子由中国热带农业
科学院热带生物技术研究所保存
;+$
!
方
!
法
;+$+;
!
目的基因的获得
!
小麦种子在无菌水中发
芽生长
#"W
后!提取叶片
CRH
!反转录成
@6RH
后
进行基因克隆根据
6DL2
小麦数据库中的信息
"
F
$%%
@A9
F
E.A+WU@.+<:V]:VW+?W=
%
T
S
.
%#设计
%`)
CHL8
扩增引物"
*`)H[L[LHLLL3L33[LLH3)
3[HL)%`
#利用
CHL8
扩增试剂盒"
L;A0T?@<
公
司#从小麦幼苗叶片中克隆得到该基因的
%`
端扩
增反应程序为$
&$a
预变性
*9.0
!
&$a
变性
%"/
!
**
a
退火
%"/
!
,!a
延伸
"/
!循环
%*
次获得
%`)
CHL8
扩增片段后对序列进行拼接得到
%&!"#$!
@6RH
全长序列然后根据
@6RH
全长序列设计
#
对引物"
*`)[LL[HL[L3[3L3[L3[L)%`
&
*`)H3L)
LH3HL[LL[333H33[3[L)%`
#扩增
%&!"#$!
@6RH
全长序列扩增反应程序为
&$a
预变性
*
9.0
!
&$a
变性
%"/
!
*"a
退火
%"/
!
,!a
延伸
"
/
!循环
%*
次
ILC
扩增产物回收(连接(转化后!
挑取单克隆在
_4
液体培养基中培养并进行
ILC
鉴定对已鉴定的阳性克隆进行测序分析
;+$+$
!
生物信息学分析
!
序列比对和保守结构域
预测利用
4_HY3
"
F
$%%
E;:/T+0@E.+0;9+0.<+
S
A]
%
4;:/T+@
S
.
#&开放阅读框预测利用
BCDD.0W?V
"
F
$%%
>>>+0@E.+0;9+0.<+
S
A]
%
S
AVU
%
S
AVU+#
和
[8RYLHR
"
F
$%%
S
?0?/+9.T+?W=
%
[8R)
YLHR+#&多序列比对利用
6RHGHR
软件&进
化树构建利用
G8[H
软件
;+$+<
!
基因的表达分析
!
生长
#"W
的小麦幼苗分
别用
!"KI8[)"""
(
!""99A;
%
_R:L;
和
$a
低温
进行胁迫处理!以及
#""
"
9A;
%
_H4H
(
#""
"
9A;
%
_
乙烯和
#"99A;
%
_N
!
B
!
进行信号分子处理"
I8[)
"""
(
R:L;
(
H4H
(乙烯和
N
!
B
!
均购自上海生工生物
工程有限公司#!在处理后
!
(

(
#!
(
!$<
!分别取样!利
用
CRH/.9
F
;?3AT:;CRHJ.T
"
3.:0
S
?0
公司#提取叶
片总
CRH
!再用
#+!K
的琼脂糖凝胶电泳检测总
CRH
的完整性!利用
C?]?VTH.WD.V/TYTV:0W@6RH
Y
X
0T"
D?V9?0T:/
公司#将提取的总
CRH
反转录成
@6RH
反转录反应程序为
*a*9.0
&
$!a"9.0
&
,"a*9.0
以反转录的
@6RH
第一
链为模板为避免基因组
6RH
的污染!在
CRH
提
取过程中进行了基因组
6RH
消化
实时荧光定量
ILC
采用
YQ4C[V??0
#
试剂
盒"
3:C:J:
公司#!按照操作说明在
G\%""*I
荧
光定量
ILC
仪"吉泰生物科技有限公司#上进行
所用引物为
3:GHIJ!D
"
*`)L[LLHL3[LLHL)
L3L3LH)%`
#和
3:GHIJ!C
"
*`)[LHLLHLL3L)
HLLHLLLH)%`
#&
3:HL32RD
"
*`)L33[3L333[)
HLLL33LL)%`
#和
3:HL32RC
"
*`)H3[33LH3)
3LL3[L33[3)%`
#参考
3:J:C:
实时荧光定量
标准说明书进行引物设计为了保证引物的特异
性!引物设计在非翻译区!
ILC
产物的长度维持在
%""E
F
以内!并进行了测序分析实时荧光定量
ILC
引物均由上海生工生物工程有限公司合成
以小麦
"0.):
基因为内参荧光定量
ILC
反应程
序为
&*a
预变性
%9.0
&
*a
变性
,/
!
**a
退火
#"/
!
,!a
延伸
#*/
!循环
$"
次定量方法为
!
(
$$
LT
法$
$$
;Tb
"
;
3
!
3:V
S
?T
(;
3
!
H@T.0
#
3.9?(
"
;
3
!
3:V
S
?T
(
;
3
!
H@T.0
#
3.9?"
)
1
*

!
!
结果与分析
$=;
!
1$2!34$
基因的克隆及生物信息学分析
根据
6DL2
小麦数据库中的序列信息!发现
#
%&#
#"
期
!!!!!!!!!!!!!!
胡
!
伟!等$小麦
%&!"#$!
基因的克隆及表达分析
个
8Y3
序列与小麦
GHIJ
家族基因具有较高的一
致性!但是其
%`)
端缺失随后!利用
CHL8
技术从
小麦中克隆了其
%`)@6RH
序列
%&$E
F
将扩增的
%`)
端序列与原序列拼接得到该基因的
@6RH
全长
序列"图
#
#!并利用
ILC
扩增!扩增片段为
#!1&
E
F
!分析表明其包含
#
个
###"E
F
的
BCD
!编码
%&
个氨基酸保守结构域分析表明该基因编码的
蛋白具有激酶活性位点(
H3I
结合位点和底物结合
位点!属于
IJL
超家族"图
!
#
4;:/T分析表明该
基因编码的氨基酸序列与粗山羊草"
8G3#1&!,
#(
水稻"
RI
-
""#"*1$,#
#(谷子"
7I
-
""$&#!"
#的
GHIJ
家族蛋白具有较高的一致性!分别为
&&K
(
&$K
(
&$K
多序列比对分析表明
%&!"#$!
编码
的氨基酸序列与其它物种的
!"#$
氨基酸序列具
有较高的一致性"图
%
#!将其命名为
%&!"#$!

进化树分析表明!
%&!"#$!
与水稻
!"#$
家族
基因具有较近的亲缘关系!其中与
2-!"#$!
的进
化关系最近"图
$
#
$=$
!
1$2!34$
基因在非生物逆境胁迫下的表达
分析
为了研究
%&!"#$!
基因对非生物逆境胁迫
的响 应!利 用 实 时 定 量
ILC
的 方 法 检 测 了
%&!"#$!
基因在
I8[
(低温(
R:L;
处理下的表达
模式"图
*
#结果表明!在
I8[
处理下!
%&!"#$!
基因的表达在处理后
!
%
!$<
被显著诱导&在低温处
图
#
!
%&!"#$!%`)CHL8ILC
扩增电泳图
D.
S
+#
!
3S
:VA/?
S
?;?;?@TVA
F
%&!"#$!%`)CHL8ILC
G+6RH9:VZ?V
&
#+%&!"#$!
理下!
%&!"#$!
基因的表达在处理后

%
!$<
被显
著诱导&在高盐处理下!
%&!"#$!
基因的表达在处
理后
!
%
<
显著被诱导这些结果表明!
%&!"#$!
基因受渗透(低温和高盐胁迫诱导上调表达
$=<
!
1$2!34$
基因在信号分子处理下的表达分析
为了研究信号分子对
%&!"#$!
基因表达的调
控!用
H4H
(乙烯(双氧水分别处理小麦幼苗!利用实
时荧光定量
ILC
检测
%&!"#$!
的表达"图
*
#结
果表明!在
H4H
处理
!
%
#!<
该基因的表达被抑制&
在乙烯和双氧水处理
!
%
!$<
!该基因的表达显著被
图
%
!
%&!"#$!
与其它物种中
!"#$
家族基因的氨基酸序列比对
B/GHIJ!
"
4H6*%&&,
#
+
水稻&
HTGHIJ,
"
RI
-
#,&$"&
#(
HTGHIJ#$
"
7I
-
""!1,"#$
#
+
拟南芥
D.
S
+%
!
LA9
F
:V./A0AUT^
=?0@?/
AU%&!"#$!:0WATF
VAT?.0/
B/GHIJ!
"
4H6*%&&,
#
+2<-&.)6&
&
HTGHIJ,
"
RI
-
#,&$"&
#!
HTGHIJ#$
"
7I
-
""!1,"#$
#
+"<.1&*)&:&
图
!
!
3:GHIJ!
蛋白的保守特征预测
D.
S
+!
!
LA0/?V]?W@<:V:@T?V/AU3:GHIJ!
F
VAT?.0
$&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
3:GHIJ!
与其它物种中
GHIJ
家族
成员的系统发育进化树
标尺代表碱基替换率&分支上的数字表示
4AAT/TV:
F
验证中
#"""
次
重复计算的值
B/GHIJ!
"
4H6*%&&,
#(
B/GHIJ%
"
LH6*$,$#
#(
B/GHIJ,
"
H4N"##&#
#(
B/GHIJ$
"
LH4#11&
#(
B/GHIJ#$
"
HL6,$$"
#
+
水稻&
59GHIJ,
"
HL[%*"1
#(
59GHIJ#$
"
RI
-
""##,,
#
+
玉米&
IVGHIJ
"
LHN"*"!$
#!虞美人&
HTGHIJ#
"
RI
-
#,!$&!
#(
HTGHIJ!
"
RI
-
*$,$
#(
HTGHIJ,
"
RI
-
#,&$"&
#(
HTGHIJ#$
"
7I
-
""!1,"#$
#
+
拟南芥&
LVGHIJ!
"
H4B1$1$"
#
+
长春花&
C/GHIJ!
"
HLD$&,"*
#
+
琵琶柴&
I/GHIJ!
"
HHD,%!*,
#
+
豌豆&
C@GHIJ#
"
7I
-
""!*#"$%$
#(
C@GHIJ!
"
88D$",&%
#
+
蓖麻&
["
H4H""*!
#
+
棉花&
I:GHIJ
"
HH6%!!"$
#
+
杏
D.
S
+$
!
I<
X
;A
S
?0?T.@TV??AU3:GHIJ!:0W
GHIJ
F
VAT?.0/UVA9ATF
?@.?/
3&
3F
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S
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F
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"
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#!
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B/GHIJ$
"
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#!
B/GHIJ#$
"
HL6,$$"
#
+23
4
5&-&.)6&
&
59GHIJ,
"
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#!
59GHIJ#$
"
RI
-
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#
+=&8&
4
-
&
IVGHIJ
"
LHN"*"!$
#
+
#&
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&6331+&-
&
HTGHIJ#
"
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#!
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"
RI
-
*$,$
#!
HTGHIJ,
"
RI
-
#,&$"&
#!
HTGHIJ#$
"
7I
-
""!1,"#$
#
+"<.1&*)&:&
&
LVGHIJ!
"
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&
C/GHIJ!
"
HLD$&,"*
#!
C@GHIJ!
"
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#
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(
&3)0&
&
I/GHIJ!
"
HHD,%!*,
#
+#)-/8-&.)6/8
&
C@GHIJ#
"
7I
-
""!*#"$%$
#
+
>)0):/-0+88/:)-
&
["
H4H""*!
#
+?+--
4,
)/8
1)3-/./8
&
I:GHIJ
"
HH6%!!"$
#
+#3/:/-&38:)&0&
诱导这些结果表明!
H4H
能够抑制
%&!"#$!
表
达!而乙烯和双氧水能够诱导
%&!"#$!
表达
%
!
讨
!
论
!"#$
是一个相对保守的家族!在植物适应逆
境胁迫过程中起着重要作用一些模式植物"拟南
芥和水稻#
!"#$
家族基因的功能及其介导的信号
转导途径已经被鉴定小麦遗传背景复杂"异源六
倍体#(基因组大"
#,"""[E
!是水稻基因组的
$"
倍#(基因组上重复序列多"
1*K
#!严重限制了小麦
功能基因的分离和鉴定)&*所以!小麦中
!"#$
家族基因的研究相对滞后!目前小麦中
!"#$
家
族基因的报道也非常有限本研究克隆了
#
个小麦
%&!"#$!
基因!该基因编码的氨基酸序列具有
GHIJ
家 族 蛋 白 的 基 本 特 征!与 其 它 物 种 中
GHIJ
家 族 成 员 具 有 较 高 的 一 致 性!与 水 稻
GHIJ
家族成员具有较近的进化关系
!"#$
家族基因的表达受环境胁迫影响)#"*
一些
!"#$
基因是非生物逆境胁迫的正调控因
子如在拟南芥中过表达
=8!#$,
和
7
,
!#$%
能够增强植物对渗透胁迫的耐受性)$!##*&在烟草中
过表达
=87@!$#
能够增强植物对干旱胁迫的耐
受性)#!*&在烟草中过表达
?1!#$!
能够增强植物
对干旱和高盐胁迫的耐受性)#%*然而!也有证据表
明!
!"#$
家族基因是非生物逆境胁迫的负调控因
子如在烟草中过表达
?1!#$&
能够降低植物
对渗透 胁 迫 的 耐 受 性)#$*&在 拟 南 芥 中 过 表 达
?1!#$#
能够降低植物对干旱胁迫的耐受性)#**
所以!不同
!"#$
家族成员在植物对非生物逆境
胁迫的应答过程中发挥着不同的作用!这也暗示着
图
*
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