全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４６(１): １３１￣１３４(２０１６)
收稿日期: ２０１４￣１０￣２３ꎻ 修回日期: ２０１５￣０７￣２６
基金项目: 广东省科技计划(２０１３Ｂ０２０３０９０１１)ꎻ海洋公益性行业项目(２０１３０５０２１)
通讯作者: 何红ꎬ教授ꎬ主要从事植物病害及其生物防治研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｈｅｈｏｎｇ８９３＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１６.０１.０１６
研究简报
红树植物—白骨壤黑斑病病原菌的分离与鉴定
苏会荣ꎬ何 红∗ꎬ林巧玲ꎬ凌东海ꎬ朱拥军
(广东海洋大学 农学院ꎬ湛江 ５２４０８８)
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｏｎ Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ
ＳＵ Ｈｕｉ￣ｒｏｎｇꎬ ＨＥ Ｈｏｎｇꎬ ＬＩＮ Ｑｉａｏ￣ｌｉｎｇꎬ ＬＩＮＧ Ｄｏｎｇ￣ｈａｉ ꎬ ＺＨＵ Ｙｏｎｇ￣ｊｕｎ (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ
Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４０８８ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ２０１４ꎬ ａ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｏｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ (ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｎｇｒｏｖｅｓ) ｉｎ
Ｄｏｎｇｈａｉ ｉｓｌａｎｄ ｏｆ Ｚｈａｎｊｉａｎｇꎬ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ. Ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔꎬ ｗｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｉｓｏｌａｔｅ ｂｇｒ１. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａ￣
ｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ａｎｄ ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ￣３￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ (ｇｐｄ) ｇｅｎｅꎬ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ
Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ. Ｔｈｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｌｅａｆ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｏｎ Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ ｉｎ Ｃｈｉｎａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａꎻ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１６)０１￣０１３１￣０４
红树林是生长在热带、亚热带海岸潮间带ꎬ可海
陆两栖的特殊木本植物群落ꎬ具有防风御浪、净化环
境、维护沿海湿地生物多样性等生态功能ꎬ为珍稀植
物群落ꎮ 有报道认为红树植物生长在海边又富含抗
菌等活性物质ꎬ不利于病害发生ꎬ但近年来本实验室
在广东雷州半岛等地红树林发现有多种病害发
生[１ꎬ２]ꎬ仅白骨壤(Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ)上就发现有黑茎
病、灰斑病等病害ꎮ ２０１４年我们在该区白骨壤小苗
上又发现一种零星发生的黑斑病(目前未见相关文
献报道)ꎬ为此本文对其病原菌进行了分离鉴定ꎬ以
期为病害的预报和防控提供理论依据ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 病原菌分离
采用常规组织分离法分离病原菌ꎬ单孢分离纯
化菌株ꎬ保存备用[１]ꎮ
１.２ 致病性测定
按照柯赫氏法则ꎬ分别用单孢纯化菌株的菌丝
块(直径为 ８ ｍｍ)和分生孢子悬浮液(浓度为约
１０４个孢子ｍＬ￣１)进行室内离体和盆栽活体接种ꎬ
方法见方中达«植病研究方法»ꎮ
１.３ 病原菌形态观测
将病原菌接种到 ＰＤＡ 培养基上ꎬ于 ２７℃培养
箱中黑暗培养 ４~７ ｄꎬ观测并统计菌落、菌丝、分生
孢子等形态特征及大小ꎮ
１.４ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 和 ｇｐｄ 基因片段 ＰＣＲ 扩增与序
列分析
采用 ＣＴＡＢ 法提取病原菌的 ＤＮＡ[３]ꎬ用病原
真菌核糖体 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 区段通用引物 ＩＴＳ４ / ＩＴＳ５
( ＩＴＳ５ ５’ ￣ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ￣３’ꎬ
ＩＴＳ４ ５’ ￣ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３’)和 ｇｐｄ
植物病理学报 ４６卷
(三磷酸甘油醛脱氢酶基因)通用引物 ｇｐｄ Ｆ / ｇｐｄ
Ｒ( ｇｐｄ Ｆ ５’ ￣ＧＣＡＣＣＧＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣ￣３’ꎬｇｐｄ
Ｒ ５’ ￣ＧＧＧＣＣＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣ￣３’)分别扩增病
原菌 ＩＴＳ 和 ｇｐｄ 基因片段ꎮ ＰＣＲ 反应体系 ( ２５
μＬ):１０×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ２.５ μＬꎬｄＮＴＰ ２ μＬꎬ引物
(１０ μｍｏｌ)各 １.０ μＬꎬ模板 ＤＮＡ １ μＬꎬＴａｑ ＤＮＡ
聚合酶(５ ＵμＬ￣１)０.２ μＬꎬ双蒸水补充至 ２５ μＬꎮ
ＰＣＲ反应条件:９５℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９５℃变性 ３０ ｓꎬ
５８℃退火 ３０ ｓꎬ７８℃延伸 １ ｍｉｎꎬ共 ３５ 个循环ꎮ
ＰＣＲ产物经 １％琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ委托广州
立菲生物进行测序ꎬ将测得序列在 ＧｅｎＢａｎｋ 中进
行 ＢＬＡＳＴ 同源性分析ꎬ利用 ＭＥＧＡ４.０ 等软件进
行系统发育分析ꎬ采用邻接(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇꎬ ＮＪ)
构建系统发育树ꎬ自举法(ｂｏｏｔｓｔｒａｐ)对系统树进行
１ ０００次重复检验ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 病原菌分离
白骨壤黑斑病主要危害白骨壤幼苗叶片ꎬ发病
初期为水渍状褐色小点ꎬ边缘有黄色晕圈ꎬ病斑为
圆形、椭圆形或不规则形ꎬ随后逐渐向叶脉扩大直
至整张叶片变黑腐烂掉落(图 １￣Ａ)ꎮ 经组织分离
纯化得 ８ 个菌株( ｂｇｒ１ ~ ｂｇｒ８)ꎬ经观测各菌株菌
落、菌丝和分生孢子等特征均基本相似ꎬ因此ꎬ本文
以 ｂｇｒ１菌株为代表开展研究ꎮ
２.２ 致病性测定
致病性测定结果表明ꎬ离体叶片创伤与无创伤
以及盆栽活体创伤接种均可发病ꎬ空白培养基或清
水对照和盆栽活体无创伤接种未发病ꎻ离体叶片创
伤接种发病速度较快ꎬ接种 ２ ｄ 后即开始出现病
斑ꎬ而离体叶片无创伤及盆栽活体创伤接种后发病
速度较慢ꎬ接种后 ３ ~ ５ ｄ 才出现病斑ꎬ发病病斑症
状与田间基本相似(图 １￣Ｂ)ꎬ从接种发病病斑上再
分离的病菌与接种病原菌 ｂｇｒ１ 相同ꎬ证明菌株
ｂｇｒ１为白骨壤黑斑病的致病菌ꎮ
２.３ 病原菌形态特征
病原菌在 ＰＤＡ培养基上ꎬ菌落初期淡褐色ꎬ菌
丝绒毛状ꎬ２７℃黑暗培养 ６ ｄꎬ菌落直径大小为 ６４.１
ｍｍ~７０.０ ｍｍꎻ５ ~ ６ ｄ 后ꎬ颜色逐渐加深为红褐色
或褐色ꎻ分生孢子梗圆柱状ꎬ有分枝ꎬ产孢处形成膨
大的囊状体ꎬ大小约为 １１０ μｍ×４ μｍꎻ分生孢子呈
长椭圆形、椭圆形或不规则形等多种形态ꎬ褐色ꎬ有
纵横隔膜ꎬ横膈膜处有明显隘缩ꎬ成熟分生孢子顶
端细胞尖细ꎬ基部钝圆ꎬ大小为 ４５ ~ ５８ μｍ×１３ ~ ２３
μｍ(图 ２)ꎮ 参照文献[４ꎬ５]等ꎬ该病原菌与匍柄霉
属(Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ)的形态特征较为相似ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｏｆ Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ
Ａ: Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｂｌａｃｋ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｎ Ａ.ｍａｒｉｎａ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄｓꎻ Ｂ: Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｇｒ１.
２３１
１期 苏会荣ꎬ等:红树植物—白骨壤黑斑病病原菌的分离与鉴定
２.４ 病原菌 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 和 ｇｐｄ 基因片段 ＰＣＲ 扩
增与序列分析
用引物 ＩＴＳ５ / ＩＴＳ４和 ｇｐｄ Ｆ / ｇｐｄ Ｒ 扩增ꎬ分别
获得 ｂｇｒ１菌株的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列 ５４７ ｂｐ(ＧｅｎＢａｎｋ
登录号 ＫＭ２７２８５７)和 ｇｐｄ 基因序列 ８８４ ｂｐ(Ｇｅｎ￣
Ｂａｎｋ登录号 ＫＭ２７２８５８)ꎮ 经 Ｂｌａｓｔｎ 同源性比对ꎬ
发现该病原菌的 ＩＴＳ５ / ＩＴＳ４ 序列同 Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ
ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ(登录号:ＪＸ８４５１３８)的同源性达 ９９％ꎻ
ｇｐｄ基因序列同 Ｓ. ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ(登录号:ＪＱ４１６１５２)
的同源性达 １００％ꎮ 构建联合系统发育树结果表
明(图 ３)ꎬ匍柄霉属内种间的系统树形成了明显的
分支ꎬ引起白骨壤黑斑病的病原菌 ｂｇｒ１ 和番茄匍
Ｆｉｇ. ２ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ
Ａꎬ Ｂ: Ｃｏｌｏｎｙꎻ Ｃꎬ Ｄꎬ Ｅ: Ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｉｄｉａ.
Ｆｉｇ. ３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｂｇｒ１ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｏｓｅｓｔ ｒｅｌａｔｉｖｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＴＳ ａｎｄ ｇｐｄ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
３３１
植物病理学报 ４６卷
柄霉(Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ)位于系统发育树同
一分支ꎬ该分支获得了 ５０％以上的自展支持率ꎬ且
遗传距离最近ꎮ 结合形态学特征及分子生物学鉴
定ꎬ本文认为引起白骨壤黑斑病的病原菌 ｂｇｒ１ 为
番茄匍柄霉(Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ)ꎮ
３ 结论与讨论
匍柄霉(Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ) 属半知菌门丝孢纲暗
色孢科(Ｄｅｍａｔｉａｃｅａｅ)真菌ꎬ为多种经济作物的致
病菌ꎬ 并 引 起 病 害ꎻ 其 中 番 茄 匍 柄 霉 ( Ｓ.
ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ)为从番茄叶斑病上首先分离报道ꎬ除引
起番茄叶斑病外ꎬ还可引起菊科、落地生根属等多
种经济农作物的叶斑病[５]ꎻ但有关该病原菌引起
红树植物病害ꎬ目前尚未见报道ꎮ 本文通过对白骨
壤黑斑病病原菌的分离、致病性测定、形态观测及
ＩＴＳ序列与 ｇｐｄ基因序列分析等结果表明ꎬ引起红
树植物白骨壤黑斑病的病原菌为番茄匍柄霉( Ｓ.
ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ)ꎬ这是首次报道该病原菌可引起红树植
物病害ꎮ 同时本研究中还发现ꎬ该病原菌除侵染白
骨壤叶片外ꎬ 还可浸染白骨壤茎干以及桐花树
(Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ)、秋茄(Ｋａｎｄｅｌｉａ ｃａｎｄｅｌ)、
海漆(Ｅｘｃｏｅｃａｒｉａ ａｇａｌｌｏｃｈａ)ꎬ海桑( Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ｃａ￣
ｓｅｏｌａｒｉｓ)ꎬ无瓣海桑(Ｓ. ａｐｅｔａｌａ)等红树植物叶片并
引起病害ꎬ可见该病原菌可侵染为害多种红树植
物ꎬ对此应引起关注ꎮ
参考文献
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Ｊａｐａｎ [Ｊ]. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ ７５
(１): ８０￣８２.
责任编辑:李晖
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